Name: live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Çalışmalarımız Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir. Biz nazik CFP-LC3 ifadesi için plazmid bize sağlamak için Prof Tamotsu Yoshimori teşekkür etmek istiyorum.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> (2 sonra% 80 bir confluency için amaç% 30-40 bir confluency için, Dulbecco&#39;nun Modifiye Eagles Orta (DMEM) gece boyunca kültür hücreleri; HEK-293T hücreleri Tohum düşük geçit sayısı istikrarlı bir şekilde 22 mm yuvarlak lamelleri GFP-DFCP1 ifade gün - canlı hücre görüntüleme gün). </li></ol> 2. Hücre transfeksiyonu <ol><li> İt serum, orta, 3 ul X-tremeGENE 9 DNA Transfeksiyon Reaktif ve pECFP-LC3 plazmid DNA, 0.5 ug azaltılmış 1...

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

Bu protokolde tarif edildiği gibi bir yöntem autophagosome oluşumu sırasında protein lokalizasyonu görselleştirme sağlar. Biz olaylar, disk konfokal ve Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi iplik gelin-tarama konfokal dahil olmak üzere açıklanan görselleştirme çeşitli yöntemler denedim. Biz genel amaçlı standart geniş alan epi-floresan hassasiyet ve çözünürlük arasındaki en iyi dengeyi sağlar bulduk. Bu gürültü, az photo-bleaching/photo-toxicity ve hızlı satın alma için iyi bir...

Otofaji 1-3 autophagosome oluşumunun son sonuç için proteinin çok sayıda koordine gerektiren oldukça dinamik bir işlemidir. Mikroskopi muhtemelen en sık otofaji 4 eğitim için uygulanan bir tekniktir. En Otofaji protein lokalizasyonu yaygın hem de endojen proteinlerin immüno-boyama yöntemi ve floresans ile etiketlenmiş eksojen proteinin ifadesi ile, sabit hücrelerinde incelenmiştir. Buna ek olarak, Elektron Mikroskobu (EM), tek başına ve immün-altın etiketleme, ile birlikte bu yapıların 5,6 ince ayrıntıları nitelendirdi. Zaman - bu tekniklerin alanı 3 boyutlu olarak autophagosome oluşumu anlayışımızı kurduk olmasına rağmen, onlar 4. boyut hakkında bilgi yeterli miktarda sağlamak için başarısız oldu. Bu Possi kadar yakın bir autophagosome oluşumu takip verir gibi canlı hücre görüntüleme Bu bariyer üstesindengerçek zamanlı 7 ble. Bu teknik ilk Yoshimori ve arkadaşları 8 tarafından otofaji incelemek için kullanılmıştır, ve giderek bundan sonra kullanılmıştır. Time-lapse mikroskopi canlı hücrelerde POI ve bir süre boyunca lokalizasyonu yakalar. Iyi karakterize otofaji ve / veya organel işaretleyici bu bilgileri karşılaştırarak, canlı hücre görüntüleme analizi autophagosome oluşumu büyük mekansal ve zamansal bağlamda POI koyabilirsiniz. Canlı hücre görüntüleme analizi autophagosome oluşumu tüm adımları boyunca POI lokalizasyonu tekrarlayan yakalama dayanır, sabit hücre görüntüleme tek bir yakalama dayalı iken. Sabit hücre görüntüleme sadece lifecy farklı aşamalarında aynı anda yakalanan birçok autophagosomes yılında ortalama lokalizasyonu dayalı POI rolünü, varsayabiliriz ise bu nedenle, canlı hücre görüntüleme, autophagosome oluşumunun belirli adımlar da POI katkısı kanıtlayabilirimcle. Canlı hücre görüntüleme yüksek analitik güç bir yöntem olmasına rağmen, bu göz önüne alınması gereken bazı doğal sınırlamalar vardır. Her şeyden önce, canlı hücre görüntüleme bir ya da daha fazla dış kaynaklı floresanla işaretlenmiş proteinlerin ekspresyonu gerektirir. Floresan etiketleri boyutu büyük olma eğilimindedir ve bazen sterik nedenlerden dolayı bir protein davranışını değiştirebilir. Bu membran 2 boyutları sınırlı alanda çalışması için gereken bu durumu, membran proteinleri için vurgulanır. Önemli olan, bir Autophagosomes membranöz yapılardır ve buna göre oluşumu membran-ilişkili proteinlerin çok sayıda gerektirir. Başka bir problem seti POI ifade seviyeleri bağlanır. Prensip olarak, bir eksojen protein endojen protein karşılaştırılabilir seviyelerde ifade edilmelidir. Bu alt hücresel yerleşimi önemli düzenleyiciler doymuş olmayacak sağlar, ve inciE analiz biyolojik ilgili olacaktır. Onlar endojen seviyelerinin üzerinde ifade edilir, onlar otofaji yanıt 9 inhibe eğilimi olarak Ayrıca, otofaji proteinlerin aşırı, kaçınılmalıdır. Tersine, POI ifadesi düzeyleri yana fotoğraf beyazlatma olmadan zaman iyi bir süre için yerelleştirme aşağıdaki sağlayacak kadar yüksek olmalıdır, bir uzlaşma gerekmektedir. Memelilerde hücrelerin bir eksojen proteinin en iyi ifade seviyeleri elde ince ayar bir sürü gerektirir, ancak stabil POI farklı düzeylerde ifade hücre hatları kurulması ve tarama ile mümkündür. Standart floresan mikroskobu ile elde edilebilir uzaysal çözünürlüğü başka bir sınırlayıcı faktördür. Çözünürlük nedenlerle bir dizi için sınırlı olabilir, ama en iyi, yanal çözünürlük 250 nm civarında olacak. Bu, daha küçük bir mesafe ile ayrılmış herhangi bir nesne (veya tek olarak bağlı görüneceği anlamına gelirnesne) ve 250 nm daha küçük nesneleri olduklarından daha büyük resimde temsil edilecek. Bu nedenle görüntülerin her zaman bu düşünce ile yorumlanmalıdır ve bu EM gibi tamamlayıcı teknikler ince ultra-yapısal detay çözmek için gerekli olacaktır. Sonuç olarak, canlı hücre görüntüleme doğal olarak, uzun bir zaman süresi için potansiyel olarak, hafif bir hücre açığa gerektirir. Bu bir hücre, fotoğraf-toksisite olarak bilinen bir olgu fizyolojik tepkileri değiştirebilir. Biz başarıyla autophagosomes ER teller 10,11 ile yakın ilişki içinde olan PI3P zengin halka benzeri yapılar olarak adlandırılan omegasomes, köken, ilk kez açıklamak için PI3P-bağlayıcı protein DFCP1 canlı hücre görüntüleme kullandık. Biz açıkça LC3 pozitif yapıları omegasomes ile yakın ilişki içinde oluşmaya başlar göstermiştir. Biz burada bir hücre hattı istihdam stabil canlı hücre için GFP-DFCP1 ifade öneririzilgi protein görüntüleme, autophagosome oluşumunda rolü karakterizasyonu için sağlam bir mekansal ve zamansal çerçeve kurar.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Otofaji besinlerin, özellikle amino asit yokluğunda eksikliği tarafından tetiklenen bir hücresel tepkidir. Otofaji sitoplazma, uzun ömürlü proteinler ve hatta protein agregatlarının, kusurlu organeller ve virüs ya da bakteri tecrit Autophagosomes adlandırılan çift cidarlı yapıların formasyonu ile tanımlanır. Autophagosomes sonunda üretilen besin sitoplazmaya geri geridönüştürülerek ile, içerik toplu bozulmasına yol açan lizozomlar ile sigorta. Bu nedenle, otofaji hücre dengesini için çok önemlidir ve otofaji bozulmasına hastalık, özellikle nörodejenerasyon, yaşlanma ve kansere yol açabilir. Autophagosome oluşumu hücreleri çekirdek otofaji makine adı verilen proteinlerin belirli bir grup, tahsis hangi için, bir çok ayrıntılı bir süreçtir. Çekirdek Otofaji makine işlevsel olarak, çeşitli hücresel işlemleri ile ilgili ek proteinler ile tamamlanır membranında örneğin birmitokondriyal ve lizozomal biyoloji e ticareti,. Autophagosomes oluşumu ve bozulması için bu proteinlerin Koordinasyon otofaji son derece dinamik ve sofistike yanıt oluşturmaktadır. Canlı hücre görüntüleme bir tek autophagosome oluşumu olayın seviyesine her otofaji ile ilgili proteinin moleküler katkısı aşağı izlemenizi sağlar ve gerçek zamanlı olarak, bu nedenle bu teknik, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük sunuyor. Burada bizim analiz için bir mekansal ve zamansal bağlamda kurmak için, istikrarlı bir şekilde GFP-DFCP1 ifade eden bir hücre hattı kullanın. Autophagosomes oluşumuna yol açan haberci yapılardır DFCP1 işaretleri omegasomes. Ilgi (POI) bir protein, kırmızı ya da mavi floresan etiketi ya ile işaretlenebilir. Mitokondri ve lizozomlar ER gibi farklı organeller,,, tüm autophagosome oluşumu farklı adımlar katılan ve belirli bir izci boya kullanılarak işaretlenebilir. AUTOP zaman atlamalı mikroskopiBu deneysel yukarı hagy, bilgi dördüncü boyutu örneğin, süresi hakkında ayıklanmasını sağlar. Dolayısıyla biz uzay ve zamanda otofaji için POI katkısı takip edebilirsiniz.

Protokol açıklanan olarak, dengeli bir şekilde Otofaji indükleyici koşullar altında, GFP ile işaretlenmiş olan DFCP1 ifade eden bir hücre hattı CFP-etiketli LC3 lokalizasyonu takip zaman atlamalı mikroskobu kullanılmıştır. Bu deneyin sonucu 2 serisi veya GFP-DFCP1 ve CFP-LC3 karşılık gelen görüntüler, yeşil bir ve mavi kanaldan biri olan yığınlarının yakalama olduğunu. Daha ileri olarak, protokol bölümünde açıklanan tek autophagosome oluşumu olaylar, karşılık gelen montajı oluşturm...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Farelerde Aerobik Egzersiz ile Autophagy etkinleştirme

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...