Name: measuring growth and gene expression dynamics of tumor-targeted s. typhimurium bacteria
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00
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私たちは、原稿の重要な読書や編集のためにH.フレミングに感謝します。この作品はMisrockポストドクトラルフェローシップ（TD）とNDSEG大学院生フェローシップ（AP）によってサポートされていました。 SNBはHHMIの研究者でもある。

1。細胞調製<ol><li>標準的な細胞培養技術を用いて継代細胞系。この実験では、OVCAR-8細胞（NCI DCTD腫瘍リポジトリ、フレデリック、MD）を用いた。 100％ - 80のコンフルエントターゲットに細胞を成長させる。 </li><li> 5分間5ミリリットルトリプシンで細胞をインキュベートし、その後、5ミリリットルRPMI培地+ FBS、トリプシンを不活性化するために追加します。 </li><li>収穫と血球のセルを数え?...

<ol>
	<li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+phoP/phoQ-deleted,+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers.">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li><li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha.">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li><li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals.">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li><li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli.">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li><li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging.">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li><li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector.">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li><li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens.">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li><li>Ozbudak, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).</li><li>Elowitz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Toso, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+the+intravenous+administration+of+attenuated+Salmonella+typhimurium+to+patients+with+metastatic+melanoma.">Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma.</a> J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).</li><li>Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+intravenous+administration+of+live+genetically+modified+salmonella+typhimurium+in+patients+with+metastatic+melanoma.">Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma.</a> J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).</li><li>Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+perfect+(bacterial)+cancer+therapy.">Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi.">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs.">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li><li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer.">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice.">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li><li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks.">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria.">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li><li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+gene+circuits.">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li><li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+'biopixels'.">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li><li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+delivery+of+siRNAs:+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy.">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li><li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+amplified+protein+expression+therapy:+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector.">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS.">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511 (2013).</li><li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium.">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li><li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria.">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals.">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li></ol>

この手順を用いて、腫瘍を定着細菌の増殖および遺伝子発現動態のタイムコースを生成することができる。これらの測定は、定期的にバッチ培養又はマイクロ流体デバイスにおいてインビトロで行われるが、それらはインビボで行うことがはるかに困難である。 これらの方法を適用することができるいくつかの変更がある。我々はマウスモデルを生成する?...

合成生物学は、過去10年間で急速に進んでおり、現在はエネルギーと健康に重要な問題に影響を与えるように配置されている。しかしながら、臨床分野への展開は安全上の懸念及びin vivoでの遺伝子回路の設計基準を開発するの有無によって遅くされている。加速高い衝撃の医療アプリケーションでは医療インフラ、管理されたラボ環境の外に機能する遺伝子回路、安全かつ臨床的に受け入れられる微生物ホストと直接インタフェースする方法を利用して必要になります。 菌株の数は、腫瘍において優先的に増殖する能力に起因する癌治療のために研究されてきた。これらは、C.が含まれているノビイ、大腸菌、V. cholorae、B.ロンガム 、およびS.ネズミチフス3-8。S.彼らは9-12ヒト臨床試験の数は、安全性と寛容性を示してきたようにネズミチフス菌は、特定の関心を生成しました。これらbacteri<html>最初にホストの免疫系の刺激を介して、癌細胞代謝に必要な栄養素の欠乏による抗腫瘍効果を作成することが示された。治療上の貨物の生産は後で遺伝子改変を通して追加されました。これらの研究は、腫瘍治療のための細菌の使用における重要な進歩を表しているが、既存の努力の大半は、典型的に高い投与量、オフターゲット効果、およびホスト抵抗13-16の開発の送達をもたらす高レベルの発現に依存している。 さて、合成生物学は、高度なセンシングと配信17-20を実行できる計算に設計遺伝子回路を利用することによって、プログラム可能な貨物の生産を追加することがあります。これらの回路は、腫瘍特異的な刺激を感知し、必要に応じて貨物の生産を自己調節する送達システムとして機能するように設計することができる。しかし、 生体内でこれらの回路の機能を研究することはこれまで挑戦してきました。 ve_content &quot;&gt;プラスミド、合成回路の共通のフレームワークであるため、我々は、マウスモデルを用いたin vivoでプラスミドベースの遺伝子発現のダイナミクスを特徴づけるための方法を説明しますこれらのメソッドは、タイムラプス発光イメージングと生体内分布の定量的測定を利用しています一緒に、これらのアプローチは、臨床応用のための生体内でのプラスミドベースのネットワークを研究するためのフレームワークを提供します。

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml syringe</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>309602</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3/10 cc Insulin Syringe</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>309301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PrecisionGlide Needle </td>
 <td>BD Biosciences </td>
 <td>301629</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI Medium 1640 (1X), 
 liquid, with L-glutamine</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11875-119 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A0166-5G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB Agar Broth</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L2897</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luria-Bertani broth</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>244610</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measuring growth and gene expression dynamics of tumor-targeted s. typhimurium bacteria

これらの実験の目的は、弱毒Sの増殖および遺伝子発現の動態に関する定量経時データを生成することである腫瘍の内部で成長菌細菌コロニー。 我々は、OVCAR-8（NCI DCTD腫瘍リポジトリ、フレデリック、MD）、ヒト卵巣癌細胞系の皮下注射によってマウスにおける異種移植モデルの腫瘍を発生した。 私たちは、S.の弱毒株を変換可視化2用プラスミド構成的に発現ルシフェラーゼ（luxCDABE）と： ネズミチフス菌 （SL1344 phoPQ-1 ELH430）。マウス1〜本質的に非病原性を維持しながら、これらの株は、特に腫瘍を植民地化する。 測定可能な腫瘍が確立した後、細菌は、投与量を変化させた尾静脈を介して静脈内注射した。腫瘍局在化、細菌の遺伝子発現を用いた60時間かけてリアルタイムでモニターしたvivoイメージングシステム（IVIS） であった 。各時点で、腫瘍を均質化し、切除し、そして遺伝子発現データとの相関のための細菌コロニーを定量するために播種した。 併せて、このデータは、腫瘍の内部に成長する細菌のin vivo増殖および遺伝子発現ダイナミクスの定量的尺度を与える。

このプロトコルを使用して、我々は腫瘍標的細菌のin vivo増殖および遺伝子発現ダイナミクスに関するデータを生成することができる。全体的なワークフローを図1に要約する。 第一段階では、細菌（緑）画像のレポーターとしてルミネッセンス（青）で遺伝子発現を測定するためにIVISを用いて動物を注入する。 次に、第二?...

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Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

腫瘍標的の測定成長と遺伝子発現ダイナミクス<em&gt; S.ネズミチフス菌</em&gt;バクテリア

これらの実験の目的は、弱毒化の増殖および遺伝子発現の動態に関する定量経時データを生成することである<em&gt; S.ネズミチフス菌</em腫瘍内部成長&gt;細菌コロニー。このビデオでは、腫瘍細胞の準備と注入、細菌の準備と注入、全動物の発光イメージング、腫瘍切除、および細菌のコロニーカウントをカバーしています。

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

感染するためのプロトコル<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;と<em&gt;ネズミチフス菌</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

表現型のハイスループットアッセイ<em&gt;サルモネラ菌</em&gt;ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Toll様受容体刺激時の遺伝子発現解析を行うためにマウス腹腔マクロファージの単離

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

サルモネラ感染組織培養細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...