Name: measuring growth and gene expression dynamics of tumor-targeted s. typhimurium bacteria
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00
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Agradecemos H. Fleming para a leitura crítica e edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de Pós-Doutorado Misrock (TD) e NDSEG graduação comunhão (AP). SNB é um investigador HHMI.

1. Preparação celular <ol><li> Linhagens de células utilizando técnicas de cultura de células padrão. Neste experimento, foi utilizado OVCAR-8 células (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Crescer as células-alvo a uma confluência de 80-100%. </li><li> Incubar as células em 5 ml de tripsina durante 5 min, em seguida, adicionam-se 5 ml de meio RPMI + FBS para inactivar a tripsina. </li><li> Células colheita e contar com um hemocitômetro. Ressuspender em DMEM livre de fenol vermelho em uma concentraç?...

<ol>
	<li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+phoP/phoQ-deleted,+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers.">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li><li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha.">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li><li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals.">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li><li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli.">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li><li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging.">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li><li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector.">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li><li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens.">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li><li>Ozbudak, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).</li><li>Elowitz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Toso, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+the+intravenous+administration+of+attenuated+Salmonella+typhimurium+to+patients+with+metastatic+melanoma.">Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma.</a> J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).</li><li>Heimann, D. M., Rosenberg, S. 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Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi.">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs.">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li><li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer.">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice.">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li><li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks.">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria.">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li><li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+gene+circuits.">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li><li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+'biopixels'.">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li><li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+delivery+of+siRNAs:+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy.">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li><li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+amplified+protein+expression+therapy:+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector.">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS.">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511 (2013).</li><li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium.">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li><li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria.">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals.">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li></ol>

Usando este procedimento, somos capazes de gerar campos de tempo para o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de bactérias que colonizam tumores. Embora estas medições são rotineiramente realizados in vitro em cultura descontínua ou dispositivos microfluidics, eles são muito mais difíceis de executar in vivo. Há diversas modificações que podem ser aplicadas a estes métodos. Quando foi utilizado o OVCAR-8 de linha de células para gerar os modelos de rat...

A biologia sintética progrediu rapidamente na última década e agora está posicionada para influenciar importantes problemas de energia e saúde. No entanto, a expansão na arena clínica tem sido retardado por questões de segurança e ausência de desenvolvimento de critérios de projeto para em circuitos genéticos in vivo. Acelerar aplicações médicas de alto impacto vai exigir a utilização de métodos que interagem diretamente com a infra-estrutura médica, circuitos genéticos que funcionam fora do ambiente de laboratório controlado, e hospedeiros microbianos seguras e clinicamente aceito. Um certo número de estirpes têm sido investigados para a terapia do cancro devido à sua capacidade para crescer preferencialmente em tumores. Estes incluíram C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, e S. typhimurium 3-8. S. typhimurium tem gerado interesse particular como eles exibiram segurança e tolerância em um certo número de ensaios clínicos em humanos 9-12. Estes bactericida<html> um foram inicialmente mostrado para criar efeitos anti-tumorais através da estimulação do sistema imunitário do hospedeiro e pela depleção de nutrientes necessários para o metabolismo de células do cancro. Produção de carga terapêutica foi adicionado mais tarde através de modificações genéticas. Embora estes estudos representam avanços importantes no uso de bactérias para as terapias do tumor, a maioria dos esforços actuais têm confiado na expressão de alto nível, que normalmente resulta na entrega de doses elevadas, os efeitos fora do alvo, e do desenvolvimento de resistência do hospedeiro 13-16 . Agora, a biologia sintética pode adicionar a produção de carga programável, utilizando circuitos genéticos computacionalmente desenhados que podem executar detecção avançadas e entrega 17-20. Estes circuitos podem ser concebidas para funcionar como sistemas de entrega que detectam estímulos específicos de tumores e auto-regulam a produção de cargas, conforme necessário. No entanto, o estudo da função destes circuitos in vivo tem sido até agora difícil. ve_content &quot;&gt; Desde plasmídeos são o quadro comum para circuitos sintéticos, nós descrevemos um método para caracterizar a dinâmica da expressão gênica baseada em plasmídeo in vivo utilizando um modelo de mouse. Estes métodos utilizam imagens luminescência time-lapse e medição quantitativa de biodistribuição. Juntos, essas abordagens fornecem uma estrutura para o estudo de redes baseadas em plasmídeo in vivo para aplicações clínicas.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml syringe</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>309602</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3/10 cc Insulin Syringe</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>309301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PrecisionGlide Needle </td>
 <td>BD Biosciences </td>
 <td>301629</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI Medium 1640 (1X), 
 liquid, with L-glutamine</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11875-119 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A0166-5G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB Agar Broth</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L2897</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luria-Bertani broth</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>244610</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measuring growth and gene expression dynamics of tumor-targeted s. typhimurium bacteria

O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de S. atenuada colônias bacterianas typhimurium crescimento dentro dos tumores. Geramos um modelo de xenoenxerto de tumores em ratos, por injecção subcutânea de uma linha de células de cancro do ovário humano, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Nós transformado cepas atenuadas de S. bactérias typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) com a luciferase expresso constitutivamente (luxCDABE) plasmídeo para visualização 2. Estas estirpes colonizar especificamente tumores, permanecendo essencialmente não virulento para o rato 1. Uma vez que os tumores eram mensuráveis ​​estabelecido, as bactérias foram injectados por via intravenosa através da veia da cauda, ​​com diferentes doses. Tumor-localizada, a expressão do gene bacteriano foi monitorizado em tempo real, ao longo de 60 horas utilizando umsistema de imagem in vivo (IVIS). Em cada ponto de tempo, os tumores foram excisados, homogeneizados e plaqueados para quantificar colónias bacterianas para a correlação com dados de expressão de genes. Juntos, estes dados produz uma medida quantitativa do crescimento in vivo de expressão do gene e da dinâmica do crescimento de bactérias no interior de tumores.

Usando este protocolo, somos capazes de gerar dados sobre o crescimento in vivo e da dinâmica de expressão de genes de bactérias específicas do tumor. O fluxo de trabalho global está resumida na figura 1. Na primeira etapa, nós injetar bactérias (verde) ea imagem do animal usando IVIS para medir a expressão do gene com luminescência (azul) como repórter. Em seguida, na segunda etapa, de consumo, homogeneizar e tumores placa par...

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Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Medindo o Crescimento e Expressão Gênica Dynamics do Tumor-Targeted<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Bactérias

O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de atenuado<em&gt; S. typhimurium</em&gt; Colônias de bactérias que crescem dentro dos tumores. Este vídeo aborda a preparação de células tumorais e implantação, preparação e injeção de bactérias, a imagem inteira animal-luminescência, a excisão do tumor, e contagem de colônias de bactérias.

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Imunologia e Infecção

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Repórter Vaccinia vírus para quantificar Função Viral em todas as fases da Expressão Gênica

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Um protocolo para infectar<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Com<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, invasão e replicação em macrófagos

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Gene Expression Profiling de micróbios Contaminando utilizando uma plataforma digital de codificação em barra

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

NF-κB-dependente Luciferase Ativação e Quantificação da Expressão Gênica em Salmonella Células Cultura dos Tecidos Infectados

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...