Name: retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate
Uploaded: 2013-09-11T15:30:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate at JoVE.com

Nous remercions Wendy Chao pour son soutien à un examen critique. Ce travail a été soutenu par Bausch &amp; Lomb Vitreoretinal Fellowship (HM), National Eye Institute subvention EY014104 (JWM), de la recherche visant à prévenir Blindness Foundation (DGV), Fonds de recherche des yeux Lions (DGV), et un don généreux de la famille Yeatts (JWM et DGV).

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec l&#39;Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l&#39;utilisation d&#39;animaux dans ophtalmique et Vision Research, et les directives et les règlements énoncés par le Ear Infirmary Comité de protection des animaux Massachusetts Eye et. Une. Prétraitement <ol><li> Anesthésier à 8 semaines d&#39;âge souris avec une injection intrapéritonéale d&#39;un mélange de 60 mg / kg de kétamine et de 6 mg / kg de xylazine. </li><li> Coupez les moustaches. Cela se fait parce qu&#39;ils interfèrent avec la visualisation et le placement de l&#39;instrument. </li><li> Dilater la pupille avec 5% de phényléphrine et tropicamide 0,5%. </li><li> Couper les cils. Cela se fait aussi parce qu&#39;ils interfèrent avec la visualisation et la mise en place de l&#39;instrument. </li><li> Appliquer une anesthésie topique (solution ophtalmique à 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne). </li></ol> 2. Chirurgie sous le microscope <ol><li> Réglez la souris dans une pos latéraleition avec le nez vers le chirurgien. Une pincée de pointe est effectuée pour confirmer l&#39;anesthésie chirurgicale, et des gants stériles sont enfilé avant de commencer la chirurgie. </li><li> Inciser la conjonctive au limbe temporal postérieur et séparer la conjonctive de la sclérotique. Éviter de pénétrer dans la sclérotique. Après cette étape, saisir la conjonctive au limbe avec une pince pour contrôler l&#39;œil. </li><li> Faire une incision sclérale auto-obturant l&#39;aide de la pointe d&#39;une aiguille G 30 avec le biseau dirigé vers le haut. Ajoutez un tunnel scléral à travers la sclère et de pénétrer dans la sclérotique de la choroïde (Figure 1). Éviter de pénétrer dans la rétine. Si le saignement se produit de la choroïde et sort par la plaie sclérale, effectuer une astriction avec une lance chirurgicale jusqu&#39;à ce que le saignement cesse. Cette blessure scléral sera auto-étanche à une pression intraoculaire. </li><li> Perforer la cornée avec une aiguille 30 G pour réduire la pression intraoculaire. Utilisez l&#39;aiguille parallèle à l&#39;iris pour éviter de blesser les iris et le cristallin pendant entry dans la chambre antérieure. La pression intra-oculaire provoque la blessure à l&#39;auto-joint. </li><li> Insérez une aiguille G 33 relié à une seringue ul dans l&#39;espace sous-rétinien Hamilton 10 avec le biseau dirigé vers le bas (vers l&#39;œil intérieur), et injecter hyaluronate de sodium 3,5 pi doucement pour détacher la rétine neurosensorielle de l&#39;EPR sous-jacent. Éviter de pénétrer dans la rétine avec l&#39;aiguille 33 G parce hyaluronate de sodium ira dans l&#39;espace vitré mais pas l&#39;espace sous-rétinien si la rétine est pénétré. Aussi, éviter l&#39;injection rapide car il va créer une déchirure orale, et hyaluronate de sodium va s&#39;infiltrer dans la chambre antérieure. </li><li> Soit l&#39;humeur aqueuse de s&#39;écouler hors de la perforation de la cornée en pressant la cornée autour de la perforation de la cornée avec une pince pour régler la pression intra-oculaire. </li><li> Confirmer l&#39;absence de fuite de la plaie sclérale aide d&#39;une sonde chirurgicale. </li><li> Pour réduire le risque de fuite de l&#39;hyaluronate de sodium, de placer la colle cyanoacrylate chirurgicale surla plaie sclérale. </li><li> Remettez la conjonctive à sa position initiale à l&#39;aide de la colle cyanoacrylate chirurgicale. Cela permettra de réduire encore davantage le risque de fuite de l&#39;hyaluronate de sodium. </li><li> Vérifiez le fond à l&#39;aide d&#39;un couvercle en verre et confirmer la création d&#39;un RD bulleuse sans hémorragie sous-rétinienne. </li></ol> 3. Après traitement <ol><li> Appliquer une pommade antibiotique bacitracine à l&#39;oeil afin de réduire le risque d&#39;infection. </li><li> Garder la souris sur un tapis de chauffage pour éviter l&#39;anesthésie (mélange de kétamine et de xylazine) de provoquer une basse température corporelle à la suite de la pression artérielle basse. </li><li> Mettez les souris vers la cage de l&#39;animal après ils se réveillent de l&#39;anesthésie. Surveiller les souris quotidiennes de complications. Si des complications surviennent, euthanasier les souris comme décrit ci-dessous. </li></ol> 4. Sacrifice <ol><li> Euthanasier les souris par dislocation cervicale après l&#39;injection intrapéritonéale de 100 mg / kg de pentobarbital de sodium, et enucleaTE yeux à des moments appropriés pour chaque expérience (non représenté). Évitez d&#39;appliquer une pression sur l&#39;œil pendant l&#39;énucléation parce hyaluronate de sodium peut s&#39;échapper. DR bulleuses devraient être persistant pendant au moins 14 jours. </li></ol>

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Le Ear Infirmary Massachusetts Eye et possède une participation dans trois brevets américains dirigés à l&#39;utilisation de la vertéporfine. En outre, l&#39;Ear Infirmary Massachusetts Eye et a droit de propriété sur certaines demandes de brevet visant à la destruction sélective de néovascularisation choroïdienne sous-rétinien pour le traitement de la dégénérescence maculaire et d&#39;autres troubles. Le Ear Infirmary Massachusetts Eye et reçoit des redevances à la suite de ces brevets et demandes de brevets et le Dr Miller reçoit une part de la même conformément à la institutionnel brevet des politiques et procédures de Ear Infirmary, qui comprend des dispositions sur le partage des droits Massachusetts Eye et. L&#39;auteur, le Dr Joan W. Miller, est un ancien membre du conseil et ancien actionnaire d&#39;Alcon, Inc., et est actuellement consultant pour Alcon; Imagen Biotech, Inc., ISIS Pharmaceuticals; Kalvista Pharmaceuticals; Regeneron Pharmaceuticals, Inc et ONL Therapeutics, LLC. Dr Demetrios G. Vavvas serten tant que consultant pour Roche, Genentech, Kala Pharmaceuticals.

Plusieurs méthodes pour établir un modèle de RD dans les yeux de rongeurs ont été signalés 3-15, 22. La plupart d&#39;entre eux utilisent l&#39;injection sous-rétinienne d&#39;hyaluronate de sodium, car c&#39;est une matière visqueuse utilisée au cours de la chirurgie intra-oculaire chez l&#39;homme, et elle n&#39;est pas associée à une quelconque toxicité oculaire connu 1-15. Le hyaluronate de sodium, au lieu de la solution saline normale ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), augmente la durée de la RD. Les méthodes d&#39;injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium utilisent l&#39;une des deux approches: une approche de transvitreal 3-6 ou une approche de transsclérale 7-15. Les deux méthodes sont effectuées avec l&#39;observation du fond d&#39;oeil. Dans l&#39;approche de transvitreal, d&#39;un injecteur sous-rétinien est introduit dans la cavité vitréenne, un rétinotomie est créé dans la rétine périphérique, et le hyaluronate de sodium est injecté dans l&#39;espace sous-rétinien. Dans ce procédé, deux déchirures rétiniennes sont publiés, ce qui augmente le risque de rétinel hémorragie qui pourrait aller dans l&#39;espace sous-rétinien. En outre, il existe un risque de blessure de l&#39;objectif lorsque le rétinotomie est créé. Il existe plusieurs méthodes pour l&#39;approche modifiés de transsclérale. Dans la plupart de ces méthodes 12.7, après réduction de la pression intra-oculaire avec une perforation de la chambre antérieure, une aiguille 30 G raccordée à une seringue remplie de l&#39;hyaluronate de sodium est directement introduit dans l&#39;espace sous-rétinien à travers la conjonctive, la sclère, la choroïde, et RPE. Le hyaluronate de sodium est ensuite injectée dans l&#39;espace sous-rétinien. Le risque de déchirure de la rétine et le cristallin des blessures en utilisant cette méthode de transsclérale est inférieur à celui utilisant l&#39;approche transvitreal. Cependant, le trou pratiqué dans la sclérotique par une aiguille de 30 G est grand, en particulier pour les yeux de souris, et le hyaluronate de sodium injecté dans l&#39;espace sous-rétinien coule facilement hors de l&#39;oeil à travers la plaie sclérale. Cela conduit à une RD inférieure, et moins persistant plus de mort des cellules photoréceptrices variable. En outre, si le saignement se produit dans la choroïdel&#39;étape de perforation sclérale, l&#39;hémorragie se propage dans l&#39;espace sous-rétinien parce que la pression intraoculaire a été réduite avant l&#39;injection sous-rétinienne d&#39;hyaluronate. Plusieurs facteurs peuvent influencer l&#39;effet de RD sur le décollement de la rétine, y compris les sous-rétinien hémorragie et la hauteur et la persistance de la RD 16-21. décès augmente de cellules photoréceptrices avec l&#39;augmentation de la hauteur de la RD 16, 17, et les dommages des cellules photoréceptrices peuvent être plus étendues en raison de la réduction de la diffusion de l&#39;oxygène et des nutriments essentiels de la choriocapillaire avec RD plus élevé par rapport aux RD faible. Hémorragie sous-rétinienne est également toxique pour les cellules photoréceptrices 18-21; mécanismes possibles de cette toxicité dans le décollement de la rétine comprennent une hypoxie et une perturbation métabolique par l&#39;hémorragie sous-rétinienne comme une barrière de diffusion, et la neurotoxicité induite directement par des composants sanguins (tels que le fer). blessure de Lens, qui a été signalé à avoir un effet protecteur sur reticellules ganglionnaires internes 23, peuvent également affecter mort des cellules photoréceptrices après l&#39;induction de RD. En outre, si le site de la plaie d&#39;entrée n&#39;est pas scellée, l&#39;hyaluronate de sodium est susceptible de s&#39;échapper par la manipulation de l&#39;oeil pendant l&#39;énucléation. Cela peut conduire à la classification erronée d&#39;un RD comme peu profondes, qui peuvent à leur tour affecter l&#39;interprétation des résultats. Nous avons modifié la méthode de transsclérale pour injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium pour augmenter la reproductibilité des diététistes et de réduire le taux d&#39;hémorragie sous-rétinienne. L&#39;étape critique de ce protocole est de créer une incision sclérale auto-étanche à l&#39;aide d&#39;une aiguille G 30, qui empêche la fuite de l&#39;hyaluronate de sodium après l&#39;injection. Contrairement aux méthodes précédentes, ce protocole est effectuée sans observation du fond si une plus grande attention est accordée à la plaie sclérale. Application de la colle empêche également le hyaluronate de sodium de fuir hors de l&#39;œil. Dans notre expérience, le taux d&#39;hémorragie sous-rétinienne avec ce protocole wcomme significativement inférieure à celle d&#39;autres protocoles. Si le saignement de la choroïde se produit pendant l&#39;étape d&#39;incision sclérale, il va quitter l&#39;oeil à travers la plaie sclérale car cette étape est réalisée avant la réduction de la pression intraoculaire. Si un saignement se produit choroïdienne après réduction de la pression et de détachement de la rétine neurosensorielle oculaire, le sang va disséquer dans l&#39;espace sous-rétinien. Nous avons trouvé que cela se produise chez environ 5% des cas en revanche pour environ 10-20% avec les autres techniques. Ces animaux doivent être exclus de l&#39;analyse. Cette technique peut également être utilisée pour une injection sous-rétinienne d&#39;un transfert de gène à médiation par vecteur pour cibler des cellules photoréceptrices ou RPE 24, 25. Étant donné que le véhicule typique (PBS, solution saline) pour ces injections est nettement moins visqueux que le hyaluronate de sodium, des techniques standard sont infestés par plus de fuites. La technique décrite ici, en réduisant ce risque, effectue des expériences de transfert de vecteur plus reproductible etfiable.

Mort des cellules photoréceptrices et le déclin visuel ultérieur se produit lorsque les photorécepteurs sont séparés de l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine sous-jacente. La séparation physique des photorécepteurs est vu dans diverses maladies de la rétine, y compris la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge (DMLA), la choriorétinopathie séreuse centrale, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie des prématurés, ainsi que rhegmatogène (c. causée par une rupture de la rétine), décollement de la rétine ( RD). Injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium est un modèle largement accepté de créer un RD qui mène à la mort des cellules photoréceptrices, donnant un aperçu de la physiopathologie de la dégénérescence des photorécepteurs 1-15. Dégénérescence des photorécepteurs induite par l&#39;injection de hyaluronate de sodium sous-rétinien, la première fois en 2001 7, a l&#39;avantage d&#39;un cours de temps raisonnable (de quelques jours ou semaines). Cependant, elle peut avoir une variabilité importante de la perte de photorécepteurs cellule de l&#39;animal à animal en raison de deux facteurs majeurs qui affectent mort des cellules photoréceptrices après RD: 1) la hauteur et la durée de la RD, et 2) la survenue d&#39;une hémorragie sous-rétinienne. Il ya une courbe d&#39;apprentissage abrupte technique à la méthode qui contribue à deux facteurs. dégénérescence des cellules photoréceptrices augmente avec la hauteur de la RD, comme la distance entre le pigment épithélial de la rétine (RPE) couche et photorécepteurs augmente 16-17. Conformément à ces rapports, nos expériences précédentes ont montré plus mort des photorécepteurs RDS bulleuses que les diététistes peu profondes. Il a également été rapporté que l&#39;hémorragie sous-rétinienne est toxique pour les cellules photoréceptrices et affecte la mort des cellules photoréceptrices 18-21. De même, nous avons observé plus mort des photorécepteurs dans RDS avec hémorragie sous-rétinienne de diététistes sans hémorragie sous-rétinienne. Par conséquent, les techniques pour réduire la variabilité doivent se concentrer sur la réalisation d&#39;altitudes cohérentes de RD tout en évitant une hémorragie sous-rétinienne. Notre méthode modifiée d&#39;enducing RD peut faire bulleuse reproductible et RD persistante à la même position de l&#39;œil avec rare d&#39;hémorragie sous-rétinienne. Nous avons effectué la chirurgie utilisant une approche temporelle, car il est plus facile de parvenir à un plus large champ opératoire par rapport aux autres sites. Après l&#39;incision de la conjonctive, une incision sclérale auto-étanchéité est réalisée en utilisant une aiguille 30 G. Un tunnel scléral est créée, suivie par la pénétration sclérale dans la choroïde. Si le saignement se produit dans la choroïde cette étape, l&#39;hémorragie va quitter l&#39;oeil à travers la plaie sclérale, et le saignement peut être arrêté par astriction avec une lance chirurgicale. Une chambre antérieure ponction est ensuite réalisée à partir de la cornée afin de réduire la pression intraoculaire. Il s&#39;agit d&#39;une étape importante, car l&#39;injection sous-rétinienne seul entraînera une augmentation de la pression intraoculaire avec l&#39;occlusion de l&#39;artère rétinienne résultant et l&#39;ischémie de la rétine interne. Une aiguille 33 G raccordée à une seringue Hamilton de 10 ul est ensuite inséré dans l&#39;espace sous-rétinien, et 3,5 μ; Hyaluronate de sodium de l est injecté doucement pour détacher la rétine neurosensorielle de l&#39;EPR sous-jacent. Contrairement à d&#39;autres méthodes de RD induisant qui sont effectuées sous la surveillance du fond d&#39;œil, cette technique est réalisée sous observation directe. Depuis la blessure scléral est auto-obturant, hyaluronate de sodium ne sera pas s&#39;échapper après l&#39;injection. Enfin, la colle est placée sur la plaie sclérale, et la conjonctive est remis en place dans sa position initiale. Ces étapes dure réduisent également le risque de fuite de l&#39;hyaluronate de sodium. L&#39;injection de 3,5 hyaluronate de sodium ul crée DR reproductibles (50% de la rétine) dans les yeux de souris 8 semaines d&#39;âge. La création de la plaie auto-obturante est l&#39;étape la plus importante dans notre mode opératoire modifié, car elle empêche le hyaluronate de sodium injecté de s&#39;écouler hors de l&#39;oeil, ce qui permet bulleuse reproductible et DR persistants.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketaject</td>
 <td>Phoenix</td>
 <td>2010025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AnaSed</td>
 <td>LLOYD</td>
 <td>4004821</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide</td>
 <td>Massachusetts Eye and Ear Pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution</td>
 <td>AKORN</td>
 <td>17478-263-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Provics</td>
 <td>Alcon</td>
 <td>8065183085</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Webglue</td>
 <td>Patterson Veterinary</td>
 <td>07-8566128</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MG90</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30G1/2 PrecisionGlide Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Weck-Cel Eye Spears</td>
 <td>Beaver-Visitec</td>
 <td>0008685</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 Microliter Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7635-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>33 gauge, 0.5 inch needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18x18mm Cover Glass</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>18-548A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate

Injection sous-rétinienne de l&#39;hyaluronate de sodium est un procédé largement accepté d&#39;induire un décollement de rétine (RD). Cependant, la hauteur et la durée de RD ou la survenue d&#39;une hémorragie sous-rétinienne peuvent affecter la mort des cellules photoréceptrices de la rétine décollée. Par conséquent, il est avantageux de créer DR reproductibles sans hémorragie sous-rétinienne d&#39;évaluation de la mort des cellules photoréceptrices. Nous avons modifié une méthode précédemment rapporté pour créer bulleuse et RDS persistantes dans un endroit reproductible avec rare d&#39;hémorragie sous-rétinienne. L&#39;étape cruciale de cette méthode modifiée est la création d&#39;une incision sclérale auto-obturante, qui peut empêcher une fuite de l&#39;hyaluronate de sodium après injection dans l&#39;espace sous-rétinien. Pour réaliser l&#39;incision sclérale auto-étanche, un tunnel scléral est créée, suivie par la pénétration sclérale dans la choroïde avec une aiguille 30 G. Bien que l&#39;hémorragie de la choroïde peut se produire au cours de cette étape, astriction avec une lance chirurgicale réduit le taux de l&#39;ourlet de la choroïdeorrhage. Cette méthode permet à un modèle plus reproductible et fiable de mort des photorécepteurs dans des maladies qui impliquent RD comme rhegmatogène RD, la rétinopathie du prématuré, la rétinopathie diabétique, CRSC, et la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge (DMLA).

Pour évaluer la persistance de la RD faite par ce protocole, cryosections ont été faites aux jours 3, 7, et 14 après l&#39;induction de RD. Six yeux ont été utilisés pour chaque point de temps. Hématoxyline et l&#39;éosine (HE) coloration a été utilisé pour visualiser les sections. Toutes les sections ont montré une RD bulleuse approche de la lentille (figure 2). Un œil a montré une hémorragie sous-rétinienne au jour 7. Pas yeux ont montré des signes d&#39;infection ou de blessure de l&#39;objectif. <img src="/files/ftp_upload/50660/50660fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50660/50660fig1highres.jpg" /> Figure 1. La création d&#39;une incision sclérale auto-étanche. Ce schéma montre une image en coupe transversale d&#39;un œil normal de souris. La ligne rouge indique l&#39;incision sclérale auto-obturant. Un tunnel scléral suivie par la pénétration scléral dans la choroïde avec une aiguille 30 G crée une incision sclérale auto-obturant. Cette blessure scléralsera auto-étanche avec la pression intra-oculaire, ce qui peut empêcher une fuite de l&#39;hyaluronate de sodium après injection dans l&#39;espace sous-rétinien et de réaliser des détachements rétiniens bulleuses persistants. <img src="/files/ftp_upload/50660/50660fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50660/50660fig2highres.jpg" /> Figure 2. Évolution dans le temps de décollement de la rétine. Cette photo de fond montre un décollement de la rétine bulleux sans hémorragie sous-rétinienne immédiatement après la chirurgie. Cryocoupes avec hématoxyline et l&#39;éosine (HE) coloration spectacle persistante décollement de la rétine bulleux sans hémorragie sous-rétinienne à travers au moins 14 jours.

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Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Décollement de la rétine modèle chez les rongeurs par injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium

Création décollements de rétine expérimentales avec une hauteur reproductible et durable de détachement, et sans hémorragie sous-rétinienne, est important pour l&#39;étude de la physiopathologie des photorécepteurs perte de cellules dans la maladie de la rétine et l&#39;évaluation des interventions thérapeutiques potentielles. Ici, nous rapportons une telle méthode en détail.

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

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