Name: micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy
Uploaded: 2013-10-08T19:30:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Исследование приводит к этим результатам получил финансирование от Седьмой рамочной программе Европейского союза (FP7/2007-2013) под грантовых соглашений н. 228334 и 241526. Этот исследовательский проект был также поддержан программы Human Frontier Science исследовательского гранта (RGP0027/2009), и итальянским министерством по делам образования, университетов и исследований в рамках флагманского проекта Nanomax и Министерства здравоохранения Италии в рамках &quot;Стволовые клетки Прием заявок&quot;. Это исследование было проведено в рамках научно-исследовательской деятельности ICON основания, поддерживаемых &quot;Ente Cassa ди Risparmio ди Фиренце&quot;.

1. Подготовка ткани и хранение <ol><li> Исправить мозга мыши с помощью стандартных transcardial перфузии 13 с 20 мл 0,01 М фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), а затем 100 мл 4% параформальдегида в 0,01 М PBS. Тщательно регулировать рН обоих растворов до 7,6: несколько более низкие значения рН могут гасить флуоресценцию EGFP. </li><li> После исправить подакцизным мозги на ночь в параформальдегиде 4% при 4 ° С. </li><li> Промыть два раза (30 мин каждый) в 0,01 М PBS и хранить в 0,01 М PBS при 4 ° С. </li></ol> 2. Обезвоживание и клиринга Примечание: протокол для обезвоживания и очистки близко следует за один описанный Becker и др. 10. <ol><li> Для удаления перекиси с дегидратации растворителе (тетрагидрофуран, ТГФ), который сильно погасить XFP флуоресценции, фильтр ТГФ с основной активированный оксид алюминия (степень активности Brockman I, около 250 г / л ТГФ) с использованием цветностистолбец картографии. Избежать растрескивания колонны, что приведет к уменьшению удаление перекиси. </li><li> Добавить стабилизатор (бутилированный гидрокситолуол, 250 мг / л) в конечном растворе, даже если ТГФ уже стабилизированный перед фильтрацией. Стабилизатор на самом деле, удерживаемого оксида алюминия: ТГФ без стабилизатора может развиться большое количество перекиси и может быть взрывоопасным и опасно. </li><li> Высушить весь мозг мыши в серии градуированных ТГФ в чистой воде: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 ч, затем каждый 100% в течение ночи. Помещают пробирку с образцом на вращающемся колесе. Для предотвращения попадания света, оберните флаконы с алюминиевой фольгой. </li><li> Фильтр-координационного растворитель (дибензил эфир, DBE) с оксидом алюминия (активированный основной, класс активность Brockman I, около 250 г / л DBE) с помощью фильтрации воронку. </li><li> Снимите образец в 100% DBE. Измените решение после 3 и 6 часов. </li></ol> 3. Образец Монтажные <ol><li> Когда мозг выглядит прозрачным, глаз (типичнымски 1 час после второй смены DBE), закрепить его на пластине изображений наконечником одним из следующих способов: </li><li><ol><li> Непосредственный монтаж - Осторожно погрузить образец на одном из советов (рис. 3). </li><li> Агароза диск - Окунитесь диска, изготовленного из 6% агарозном геле на кончиках. Аккуратно исправить образец на агарозном диска с акриловый клей (рис. 3б). Подождите примерно 1 мин для лечения. </li><li> Агароза стакан - Окунитесь в стакан, выполненный из 3% агарозном геле на кончиках. Аккуратно образец на дне стакана (фиг.3С). </li></ol></li></ol> Примечание 1: Установка в агарозном химический стакан должен быть предпочтительным, когда важно визуализации образца в целом, однако агарозном геле, окружающий образец приводит к дополнительному рассеянию света, который может нанести ущерб качеству изображения. Если небольшая часть образца могут быть исключены из изображений, лучше установить спецификациюИмен на агарозном диске или непосредственно на чаевых. Первый метод лучше всего подходит, чтобы держать мозг горизонтальную (за исключением из образа на вентральной или спинной части мозга), последний держать мозг вертикали (исключая из визуализации часть обонятельных луковиц или спинного мозга). Примечание 2: агарозном геле должны быть приготовлены в воде, а затем обезвоживают ТГФ (50% и 100% 4 ч каждый) и очищается в DBE 100% в течение 4 часов или пока он не выглядит явно прозрачным. <ol start="3"><li> После установки образца по одному из предыдущих методов, поместите изображений пластину внутри камера образцов с помощью пинцета. Заполните камеру с прояснением решение. </li></ol> 4. Томография Подготовка <ol><li> Снимите щель, чтобы собрать как можно больше флуоресценцию, как это возможно. </li><li> Освещать образец с низким мощности лазера, чтобы предотвратить фотообесцвечивания. </li><li> Перемещение образца в трех направлениях, с использованием программного обеспечения управляемой микропозиционированное систем. Определите для каждого направления минимальные и максимальные координаты которой образец освещается и находится в пределах поля зрения камеры (рис. 4а). </li><li> Вставьте выше координаты в качестве параметров для &quot;Pre-томографии&quot; подпрограммы. Указать также расстояние между соседними стеки, используемый в томографии, и шаг дискретизации предварительно томографии в направлении Z.. </li><li> Запустите предварительный томографии, который собирает изображения в каждом стеке с выборки г указанного в (4.4). </li></ol> Примечание: Собранные изображения используются программное обеспечение для подготовки грубую карту, формы образца и положения (рис. 4, б), что позволяет ограничивать приобретение томографа только к объему фактически занимаемой образца, сокращая время обработки изображений и таким образом фотообесцвечивания. 5. Томография Приобретение <ol><li> Перемещение образца вне светового листа с использованием системы микропозиционированное. </li><li> Increase мощность лазера и остановить движение всех сканирующих систем, чтобы осветить только фиксированную линию в центре поля зрения. </li><li> Установите щель и выровняйте его с помощью аутофлюоресценция сигнал от клиринговой решения. Вы должны четко видеть щели линию в центре поля зрения. </li><li> Повторно активировать систему сканирования, снизить мощность лазера и переместите образец внутри светового листа с помощью системы микропозиционированное. Следует отметить, что мощность лазера используется с щелью будет выше, чем при использовании без него, с пространственным блоков фильтров, не незначительна часть света. </li><li> Отрегулируйте амплитуду и смещение сканирования и де-сканирующих систем с программным обеспечением управления, пока изображения не смотреть четкий и яркий. </li><li> Запустите программу приобретения томография, после установки соответствующего шаг г для эксперимента. Объем будет отображены во многих параллельно, частично перекрывающихся стеков (рис. 5а), а изображения будут сохранены виерархическая структура папок. </li></ol> 6. Шитье и визуализация <ol><li> Заполните приобретенный объем с синтетическими черных изображений (т.е. изображений одного и того же типа и размеров собранных из них-, но с нулевой интенсивности) с использованием автоматизированного программного обеспечения (Рисунок 4в). Этот шаг является обязательным для того, чтобы сшивание программного обеспечения, чтобы иметь дело с полным кубического объема. </li><li> Запуск Vaa3D программное обеспечение (бесплатно скачать с <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) с установленных плагинов TeraStitcher и TeraManager. </li><li> Загрузите плагин TeraStitcher. Выберите каталог, содержащий изображенную объем, указывают относительные ориентации осей (относительно эталона правую систему координат) и размер воксел. </li><li> Запустите первую часть строчки. Программное обеспечение будет вычислить относительное смещение между парами стеков, и найти общее оптимальное placemЛОР для всех стеков вместе (рис. 5б). </li><li> Выберите, чтобы сохранить сшитые объем в одной разрешения или в формате мульти-разрешением. Последнее позволяет для мульти-разрешением визуализации с плагином TeraManager. В обоих случаях, если с большим разрешением изображение больше, чем несколько гигабайт, также выбрать мульти-стек экономии модальности и указать размер отдельных substacks. Это позволит эффективный доступ к хранимым данным. </li><li> Запустите вторую часть строчки. Программное обеспечение будет объединить выровненные стеки, и сохранить их в любом режиме одно-или много-стека (рис. 5В и 5Г). В конце закрыть окно плагина TeraStitcher. </li><li> Загрузите плагин TeraManager. Выберите папку с мульти-складочного объема нескольких разрешений, и указать воксельной размер и осей ориентации. Объем будет загружен на минимальном разрешении. </li><li> Для увеличения более высокое разрешение, выберите ориентир помощью правой кнопки мыши modalitу из Vaa3D, затем увеличить при помощи мыши свиток. Или же вы можете сразу выбрать ROI для увеличения с правой кнопкой мыши, или указать координаты интересующего объема. </li><li> Для уменьшения масштаба на более низкое разрешение, просто используйте свиток мыши. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+light+sheet+microscopy:+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain.">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

CLSM в сочетании с химической очистки представляют собой мощный инструмент для изучения нейроанатомию целых мозгах мыши, меченных флуоресцентными зондами, либо белков или синтетических красителей. Поскольку свет, излучаемый вне фокальной плоскости заблокирован физической пространственный фильтр, высококонтрастный изображений можно также в толстых образцов, сохраняя при этом высокую частоту кадров, характерные для легкой листовой архитектуры. Главный вопрос, чтобы иметь дело с при использовании описанных методов является максимизация отличие. В самом деле, доступный сигнала уменьшается как за счет химических и оптических факторов. С химической точки зрения, процедуры клиринга на основе органического растворителя может погасить излучение флуоресцирующих белков и других флуоресцентных красителей 7. Фильтрование растворитель для удаления перекиси, как описано Becker и др.. 10, позволяет поддерживать хороший уровень флуоресценции также в растворителей очищен тканей. Публиковатьизд на водной основе методов клиринговые 14 не снижают эффективность флуоресценции, но приводит к ухудшению прозрачности при работе с целых мышиных мозга, по крайней мере с линейными оптическими методами. С другой стороны, на данный момент нет никаких коммерческих целей с большим рабочим расстоянием, исправленные за высоким показателем преломления (п ≈ 1,56) клирингового решения, используемые. Таким образом, показатель преломления несоответствие между средой, в которой образец погружают и конструкции одной из целей приводит к сильным сферических аберраций. Помимо снижения разрешение микроскопа, такие аберрации привести к падению интенсивности и контрастность изображения, так как свет распространяется на более широкую область. Возможные обходные пути к этому вопросу относятся использование адаптивной оптики 15 и / или статических асферических корректоров. Любое улучшение контрастности изображения и интенсивности труда влияет также изображений скорость, так корочеВремя интегрирования за изображения можно выбрать. На данный момент CLSM может позволить себе скорость визуализации около 10 6 мкм 3 / с, при времени экспозиции камеры 100 мс 9. На такой скорости он принимает от 1-3 дней к изображению целую мозг мыши, в зависимости от размера выборки. Хотя ни значительное ухудшение качества изображения не наблюдается на протяжении такого долгого сессии изображений, по большей части из-за собственной низкой фотообесцвечивания света листового освещения 6, долго время, необходимое для изображения одного мозга мыши могли на практике снизить применимость CLSM. Увеличение в 10 раз в эффективности системы, в сочетании с использованием высокоскоростной камерой для обнаружения, позволит сократить время формирования изображения до нескольких часов, позволяя рутинное применение описанного протокола. Несмотря на все вышеуказанных ограничений, CLSM изображений в сочетании с химической очистки тканей разрешений реконструировать целые мозги мыши с разрешением микронного масштаба менее чемнеделю. Другие оптические методы всей визуализации головного мозга позволить себе высокое разрешение, чем CLSM, но по цене более подготовки и / или времени съемки 2-4, или из проб разреженных г 5. Методы, описанные в этой статье, могут быть использованы в сочетании с различных стратегий для флуоресцентного мечения: трансгенных животных экспрессирующих флуоресцентные белки в отдельных нейронных подмножеств, вирусной трансфекции инъекции интрапаренхимальные красителя, и т.д. На практике все предшествующие стратегии окрашивания жертву животных совместимы с CLSM . На самом деле, некропсический люминесцентные маркировка целых мозгах мыши не была продемонстрирована до сих, во всяком случае, если такой вид окрашивания будет возможно в ближайшее время, количество образцов, которые могут быть реконструированы с CLSM станет гораздо больше, потенциально включая человеческую ткань мозга. В заключение конфокальной свет лист микроскопия используется в сочетании с тисСью клиринга и управления данными нескольких разрешений может позволить исследователям воссоздать и проанализировать макроскопические образцы с разрешением в микронных размеров, с технологическими усилиями, которые хорошо в руке большинстве лабораторий. Потенциальные применения CLSM, конечно, не ограничивается неврологии, но охватывает все научно-исследовательские области, в которых уже используются свет лист микроскопия, как эмбриогенеза 16,17 и анатомию мелких животных 18.

По сравнению с нашим пониманием молекулярные и клеточные механизмы, лежащие функции мозга, наше знание о тонкой нейроанатомии выглядит еще в зачаточном состоянии 1. На самом деле, мы все еще не подробные карты позиции нейронов somata или долгосрочных прогнозов по всему мозгу. На самом деле, многие технологические усилия посвящены реконструировать мозг мыши с микроскопическим разрешением. Оптические методы, основанные на последовательной срезов смоляных встраиваемый образцов, а ножа сканирующей микроскопии (KESM) 2, Micro-оптический Секционирование томография (МОСТ) 3 и флуоресценции-МОСТ (fMOST) 4, может обеспечить субмикронных трехмерных резолюцию томография целых мозгах мыши. Тем не менее, общее время, необходимое для подготовки и визуализации одного образца составляет порядка нескольких недель, ограничивая практическое применение таких методов. Другой метод основан на последовательной срезов (но без смолы вложения), Серийный Два-Фотон томография (STP) 5, позволяет с высокой трехмерное разрешение изображения. Тем не менее, эта техника была продемонстрирована в целом мозг мыши только с очень редкой выборки, сбора 1 раздел каждые 50 мкм 5, и, насколько нам известно STP пока не привели в полный дискретизации реконструкцию мышиной мозга. Передовые оптический метод реконструировать целые экземпляры в трех измерениях на высокой скорости легкий лист микроскопии 6. В этой оптической схемы освещения образца с тонким листом света и флуоресценции собирают вдоль оси, перпендикулярной к плоскости освещения. Таким образом только в фокусе флуорофоры рады и можно добиться оптического секционирования в конфигурации широкого поля, гарантируя высокую частоту кадров. В сочетании с очистки протоколы, основанные на подмене воды с показателем преломления соответствующий жидкости 7, свет лист микроскопия была применена кмакроскопические образцы, как целые мозгах мыши 8. Тем не менее, образец-индуцированной рассеяние света, который влияет даже очищенные образцы, ухудшает света лист, ведущие к возбуждению из собственного внимания флуорофорами который добавляет общая размытости получаемых изображений. Чтобы выборочно собирать только в фокусе фотоны, недавно мы вместе света листового освещение в конфокальной схемы обнаружения 9. В конфокальной света листового микроскопии (CLSM), вне фокуса и рассеянных фотонов отвергаются линейного пространственного фильтра (щель) до обнаружения (рис. 1). Для достижения операцию конфокальной в легкой листовой архитектуры, освещение производится с помощью линии сканирования, а система де-сканирование на пути обнаружения создает статическое изображение сканирующего возбуждения линии в месте расположения щели. Третья система сканирования реконструирует двумерное изображение на датчике камеры. CLSM дает 100% повышение контрастности в очищенной мышимозги в отношении обычного света листового микроскопии, при сохранении скорости 10 Гц кадров. С CLSM можно реконструировать целые мозги мыши с разрешением 2 мкм в XY и 9 мкм Z, и с достаточной отличие различить один флуоресцентно меченных нейронов. В этой статье мы расскажем экспериментальную трубопровода на реконструкцию мозг мыши с CLSM. Мозги альдегидов фиксированной мыши являются дегидратировали в серии перекиси без тетрагидрофурана, а затем очищается в перекиси без дибензилового эфира (рис. 2), согласно протоколу, разработанному по Беккер и др. 10. Очищается образца затем тщательно установлен на наконечником пластины и позиционируется в визуализации камере заказ конфокальной света листового микроскопом. Образец может быть установлен непосредственно путем погружения его на кончике пластины (рис. 3); альтернативно он может быть приклеен на диске очищенной агарозном геле (фиг.3б) или размещены в полости химический стакан изготовлен из очищенной агарозном геле (фиг.3С). Оптическая томография всего мозга Затем выполняется, так как многие параллельные смежные стеки приобретаются покрыть всю объем мозга (рис. 4). Отбор проб предварительно томография, который производит грубую карту положении образца и формы, гарантирует, что изображения выполняется только в объеме, занимаемом образца. В томография стеки впоследствии сшиты вместе с программного обеспечения на заказ и сохраняются в иерархической схеме 11 в разных разрешениях. Мозги мыши в конечном итоге могут быть изучены с прототипных программного обеспечения нескольких разрешений Google Maps, как визуализации. Обе эти программные инструменты интегрированы с помощью плагинов, в с открытым исходным кодом платформы Vaa3D 12. Мы, наконец, показать представительства образы мозг мыши, чтобы продемонстрировать возможности описанной экспериментальной трубопровода в изучении тонкой мышиный neuroanatomу.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Понимание архитектуры мозга млекопитающих при разрешении одноклеточных является одним из ключевых вопросов неврологии. Тем не менее, отображение нейронов сому и прогнозы на протяжении всего мозга по-прежнему сложным для работы с изображениями и управления данными технологиями. Действительно, макроскопические объемы должны быть реконструированы с высоким разрешением и контрастностью в разумные сроки, производя наборы данных в диапазоне TeraByte. Мы недавно продемонстрировали оптический метод (конфокальной свет лист микроскопии, CLSM) с возможностью получения микронных масштабную реконструкцию целых мозгах мыши, меченных расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Сочетание света освещение листа и конфокальной обнаружения, CLSM позволяет глубоко изображений внутри макроскопических очищенных образцов с высокой контрастностью и скоростью. Здесь мы опишем полную экспериментальную трубопровод для получения полных и читаемые образы целых мозгах мыши, меченных флуоресцентными белками. Очистка и монтаж рrocedures описаны, вместе с шагами, чтобы выполнить оптическое томографии на всем объеме, приобретая множество параллельных смежных стеки. Мы показали использование с открытым исходным кодом заказных программных средств, позволяющих шить из нескольких стеков и навигации данных мульти-разрешением. Наконец, мы показано несколько примеров карт мозга: мозжечок из трансгенной мыши L7-GFP, в котором все клетки Пуркинье селективно меченых и весь мозг от Thy1-GFP-М мыши, характеризуется случайной редкой нейронов маркировки.

Описанный протокол может быть использован для восстановления с микронного масштаба разрешения либо целых мозгах мыши или вырезанных частей, без необходимости физического срезов. В качестве типичного результате на рисунке 6 весь мозжечок из L7-GFP мыши (послеродовой день 10) показана. У этого животного все нейроны Пуркинье помечены EGFP. Если мы увеличения, типичный слоистой структуры коры мозжечка видно (рис. 7). Далее масштабирования позволяет четко различать каждый сотовый сому Пуркинье (рис. 8). Описанный протокол, таким образом, может быть использован для скрининга нейронов пространственную организацию в различных нервной исследований. В качестве второго представительства результате мы представляем изображения с unsectioned мозга в Thy1-GFP-М мыши взрослого. В этом трансгенного животного EGFP выражается в случайном разреженного нейронов подмножества. Правая половина мозга показана на на рисунке 9. Как мыувеличение для дальше и дальше (фиг. 10 и 11), нейрональные процессы становятся различимы. Этот результат показывает, что описано протокол позволяет разрешающая способность микронного масштаба в целых мозга взрослых мышей, открывая возможность изучения целого мозга анатомии на клеточном резолюции в мышиных моделях нейродегенеративных заболеваний. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Рисунок 1. Оптическая схема конфокальной микроскопии света листа (CLSM). (А) вид сверху устройства, показывающий путь возбуждения. Лазерное излучение с диодной накачкой твердом состоянии (DPSS) лазера 488 нм, после расширения и коллимации с помощью первого телескопа, входит акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF), который регулирует интенсивность пучка. Затем второй телескоп расширяет луч. Galvo зеркало вертикально (вдоль у) сканирует быть<html> утра, который фокусируется линзой внутри образца камеры. (б) боковой вид устройства, показывающий путь обнаружения. Свет собирают целью обнаружения вертикально descanned на Galvo зеркало и фокусируется линзой, производя неподвижного изображения движущегося линии возбуждения. В положении неподвижного изображения линейный пространственный фильтр (щель) помещается. После щели, Galvo зеркало помещается внутри системы 4f объектива реконструирует 2-мерное изображение на единичный сигнал прибор с зарядовой связью электронно-умножения (EM-CCD). Флуоресценции полосовой фильтр убрать все бродячих возбуждения свет до обнаружения. Представительства лучи возбуждения, обнаружения и полосовой фильтрацией света обнаружения изображены синий, голубой и зеленые лучи, соответственно. Координационные длины всех линз фактически использованных в микроскоп указаны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . jove_content &quot;FO: держать-together.within страницах =&quot; всегда &quot;&gt; <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Рисунок 2. Образец очистка. Мозг мышей формальдегида фиксированной, которые хранятся в 0,1 М PBS при 4 ° С (а), являются дегидратировали в серии тетрагидрофуране (ТГФ, б) и в дальнейшем очищены на 100% дибензил эфире (DBE , в). Стадию дегидратации вызывает также некоторое ткани усадки. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Рисунок 3. Образец монтажа для работы с изображениями CLSM. Очищается мозг может быть непосредственно погрузился на прочат монтажной пластине (а), склеенные с очищенной агарозном диска (б), или вставить в очищенной агарозы стакана (с). Рисунок 4. Приобретение томография. Рутинные предварительно томография образцы параллелепипед, содержащий мозги (а) определить количество и длину параллельных соседних стопок, необходимых для изображения все образец (б). После томографии, черные изображения генерируются для завершения виртуального приобретенный объем до параллелепипеда (с). <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Рисунок 5. Объем шить. Собранные изображения стеки частично перекрываются друг с другом (а), что позволяет их точное выравнивание с помощью плагина TeraStitcher (б). Плагин затем сливается выровненных стеки в любом одном стеками (в) или мульти-станцийтрахнуться (г) нескольких разрешений представление. <img alt="Рисунок 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Рисунок 6. Всего мозжечок из P10 L7-GFP мыши, в котором все нейроны Пуркинье помеченным EGFP. Scale-бар, 1 мм. <img alt="Рисунок 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Рисунок 7. Zoom-в из части мозжечка, показанной на рисунке 6, показывая типичный слоистую структуру коры мозжечка. Масштаб бар, 500 мкм. <img alt="Рисунок 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Рисунок 8. Кроме того увеличение в из части мозжечка, показанной на фиг.6. Клеток Пуркинье сома можно четко отличитьиздание Шкала бар, 200 мкм. <img alt="Рисунок 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Рисунок 9. Правая половина мозга от Thy1-GFP-М мыши взрослых, характеризуется редким неспецифической нейронов EGFP маркировки. Масштаб бар, 1 мм. <img alt="Рисунок 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Рисунок 10. Увеличенное изображение фрагментов части половины мозга, показанной на рисунке 9, показывающий часть гиппокампа и коры головного мозга. Scale бар, 200 мкм. <img alt="Рисунок 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Рисунок 11. Дальнейшие увеличенное изображение фрагментов части половины мозга, показанной на рисунке 9. Несколько нейриты в коре можно четко отделить. Шкала бар, 50 мкм.

Watch this Scientific Journal Video about Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

В этой статье мы расскажем полную экспериментальную процедуру восстановления, с высоким разрешением, тонкой анатомии мозга флуоресцентно меченых мозгах мыши. Описанный протокол включает подготовку образца и очистки, образец монтажные для изображений, данных постобработки и многомасштабной визуализации.

Микронного масштаба Разрешение оптической томографии целых мозг мышей с конфокальной Light Sheet микроскопии

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Оптическая запись запороговой нейронной активности с одноклеточных и одного всплеска резолюции

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Оптическая когерентная томография: Визуализация мыши сетчатки ганглия клетки в естественных условиях

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Визуализация мотор Axon навигации и количественной оценки Axon арборизация эмбрионов мыши, с помощью микроскопии флуоресцирования света лист

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Свободно плавающее иммуноокрашание мозга мыши

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Характеристика нервно-мышечных соединений у мышей с помощью комбинированной конфокальной микроскопии и микроскопии сверхвысокого разрешения

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Регистрация переходных процессов кальция в нервно-мышечном соединении мыши с высоким временным разрешением с помощью конфокальной микроскопии

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Когерентная антистоковская рамановская спектроскопия (CARS) для визуализации миелинизации в срезах мозга

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Визуализация стареющей улитки с помощью флуоресцентной микроскопии со световым листом

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Выравнивание фиброграммы ОКТ сетчатки мыши с конфокальными изображениями

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

В центре внимания автора: Достижения в области визуализации сетчатки in vivo и ex vivo для улучшения диагностики и лечения глаукомы 

Совмещение фиброграмм оптической когерентной томографии видимого света с конфокальными изображениями той же сетчатки мыши

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...