Name: micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy
Uploaded: 2013-10-08T19:30:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Den forskning som lett fram till dessa resultat har erhållit finansiering från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr. 228334 och 241526. Detta forskningsprojekt har också stöd av Human Frontier Science Program forskningsanslag (RGP0027/2009), och av det italienska ministeriet för utbildning, universitet och forskning inom ramen för flaggskeppsprojekt Nanomax och italienska hälsoministeriet inom ramen för den &quot;Stamceller Call for proposals&quot;. Denna forskning har genomförts inom ramen för forskningsverksamhet ICON stiftelse som stöds av &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&quot;.

1. Tissue Upprättande och förvaring <ol><li> Fix mushjärna genom standard transcardial perfusion 13 med 20 ml 0,01 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-lösning, följt av 100 ml paraformaldehyd 4% i 0,01 M PBS. Justera noggrant pH i båda lösningarna till 7,6: något lägre värden av pH-värdet kan släcka fluorescens EGFP. </li><li> Efter fixa utskurna hjärnor över natten i paraformaldehyd 4% vid 4 ° C. </li><li> Skölj två gånger (30 min vardera) i 0,01 M PBS och förvara i 0,01 M PBS vid 4 ° C. </li></ol> 2. Uttorkning och clearing Notera: protokollet för uttorkning och rensa följer nära den som beskrivs av Becker et al 10. <ol><li> För att avlägsna peroxider från uttorkning lösningsmedel (tetrahydrofuran, THF), som starkt släcka XFP fluorescens, filtret THF med basisk aktiverad aluminiumoxid (aktivitetsgrad Brockman I, ca 250 g / L av THF) med användning av en ChromaTO-kolonn. Undvik sprickor i kolonnen, vilket skulle minska peroxid bort. </li><li> Tillsätt stabiliseringsmedel (butylerad hydroxitoluen, 250 mg / L) till den slutliga lösningen, även om THF redan stabiliserats tillsattes före filtrering. Stabilisator är i själva verket kvarhålles av aluminiumoxid: THF utan stabilisator kan utveckla stora mängder av peroxider och kan vara explosiv och farlig. </li><li> Torka hela mushjärna i en graderad serie av THF i rent vatten: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 timme vardera, sedan 100% över natten. Placera flaskan med provet på ett roterande hjul. Undvik ljusexponering, linda rören med en aluminiumfolie. </li><li> Filtrera clearing lösningsmedel (dibensyleter, DBE) med aluminiumoxid (aktiverad basisk, aktivitetsgrad Brockman I, ca 250 g / L DBE) med användning av en filtreringstratt. </li><li> Rensa provet i 100% DBE. Ändra lösning efter 3 och 6 timmar. </li></ol> 3. Specimen Monterings <ol><li> När hjärnan ser transparent genom ögat (typiskttiskt 1 timme efter den andra DBE förändringen), montera den på den tippade bildplatta med en av följande metoder: </li><li><ol><li> Direktmontage - störta försiktigt provet på en av de tips (Figur 3a). </li><li> Agaros skiva - Plunge en skiva gjord av 6% agarosgel på tips. Försiktigt fixa provet på agaros skiva med akryl lim (Figur 3b). Vänta ca 1 minut för att bota. </li><li> Agaros bägare - Plunge en bägare gjord av 3% agarosgel på tips. Placera försiktigt provet på botten av bägaren (Figur 3c). </li></ol></li></ol> Anmärkning 1: Montering i agaros bägaren är att föredra när det är viktigt att avbilda provet i dess helhet, men det agarosgel omger provet ger upphov till ytterligare ljusspridning som kan vara skadligt för bildkvalitet. Om en liten del av provet kan uteslutas från att avbilda, är det bättre att montera specimen på agaros disk eller direkt på spetsen. Den förra metoden är bäst lämpad för att hålla hjärnan horisontell (med undantag från att avbilda en ventral eller dorsala delen av hjärnan), den senare för att hålla hjärnan vertikalt (med undantag från att avbilda en del av luktsinnet lökar eller ryggmärgen). Not 2: agarosgelen bör beredas i vatten, sedan uttorkad med THF (50% och 100% 4 h vardera) och rensat i DBE 100% i 4 timmar eller tills det ser klart genomskinlig. <ol start="3"><li> Efter montering av provet efter en av de tidigare metoderna, placera bildplattan inuti provkammaren med hjälp av en pincett. Fylla kammaren med clearing lösning. </li></ol> 4. Tomography Framställning <ol><li> Ta skåran att samla in så mycket fluorescens som möjligt. </li><li> Belysa provet med låg lasereffekt för att förhindra fotoblekning. </li><li> Flytta provet i tre riktningar med hjälp av programmet drivna mikropositionerings systemam.. Identifiera för varje riktning de minimala och maximala koordinaterna för vilket provet belyses och är inom synfältet för kameran (Figur 4a). </li><li> För in ovanstående koordinaterna som parametrar för &quot;Pre-tomografi&quot; subrutin. Ange även avståndet mellan intilliggande staplar som ska användas i tomografi, och pre-tomografi provtagning steg i z-led. </li><li> Starta pre-tomografi, som samlar in bilderna i varje stapel med z provtagningen anges vid (4,4). </li></ol> Anm: De insamlade bilderna används av en programvara för att förbereda en grov karta över provet form och position (4b figur), som gör det möjligt att begränsa tomografi förvärvet endast till den volym som faktiskt upptas av provet, vilket minskar imaging tid och därmed fotoblekning. 5. Tomography Acquisition <ol><li> Flytta provet utanför ljus arket använder mikropositioneringssystemet. </li><li> Increase lasereffekten och stoppa rörelsen av samtliga avsökningssystem, i syfte att belysa bara en fast linje i mitten av synfältet. </li><li> Montera skåran och rikta den med autofluorescens signal från clearinglösning. Du ska tydligt se spaltlinje i mitten av synfältet. </li><li> Åter aktivera avsökningssystemet, minska lasereffekten och flytta provet inuti ljus arket använder mikropositioneringssystemet. Notera att den lasereffekt som används med slitsen kommer att vara högre än den som används utan att det, eftersom den rumsliga filterblocken en icke försumbar fraktion av ljus. </li><li> Justera amplitud och offset av scanning och de-scanning system med styrprogram, tills bilderna ser klar och ljus. </li><li> Kör tomografi förvärv programvara, efter inställning av lämplig z steg för experimentet. Volymen kommer att avbildas i många parallella, delvis överlappande staplar (figur 5a), och bilderna kommer att sparas ien hierarkisk mappstruktur. </li></ol> 6. Sömnad och visualisering <ol><li> Fyll i förvärvade volymen med syntetiska svarta bilder (dvs. bilder av samma typ och storlek av de insamlade dem-, men med noll intensitet) med hjälp av en automatiserad programvara (figur 4c). Detta steg är obligatoriska för sömmen mjukvara för att hantera en komplett kubisk volym. </li><li> Launch Vaa3D programvara (fritt laddas ner från <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) med plugins TeraStitcher och TeraManager installerade. </li><li> Ladda TeraStitcher plugin. Välj den katalog som innehåller den avbildade volymen indikera de relativa orienteringarna av de axlar (med avseende på en referenshögerhänt koordinatsystem) och voxel storlek. </li><li> Starta den första delen av sömmen. Programmet kommer att beräkna den relativa förskjutningen mellan par av staplar, och hitta en övergripande optimal placement för alla staplar ihop (figur 5b). </li><li> Välj att spara sydd volym i singel-upplösning eller multi-upplösning format. Det senare gör det möjligt för flera upplösningar, visualisering med TeraManager plugin. I båda fallen, om högre upplösning är större än några gigabyte, också välja flera stacken spara modalitet och ange storleken på de enskilda substacks. Detta kommer att möjliggöra effektiv tillgång till de lagrade uppgifterna. </li><li> Starta den andra delen av sömmen. Programvaran kommer att slå samman de inriktade stackar, och spara dem i antingen enkel-eller fler stack läge (figur 5c och 5d). I slutet stänga TeraStitcher plugin. </li><li> Ladda TeraManager plugin. Välj mappen med multi staplade multi upplösning volym, och ange voxel storlek och axelorienteringar. Volymen kommer att lastas på den lägsta upplösningen. </li><li> För att zooma till en högre upplösning, välj ett landmärke med hjälp av högerklicks modality av Vaa3D, sedan zooma in med hjälp av musens. Alternativt kan du direkt välja ROI för att zooma in med ett högerklick, eller ange koordinaterna för volymen av intresse. </li><li> För att zooma tillbaka till lägre upplösning, helt enkelt använda rullnings musen. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+light+sheet+microscopy:+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain.">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

CLSM i kombination med kemisk clearing utgör ett kraftfullt verktyg för att studera neuroanatomi av hela mushjärnor märkta med fluorescerande prober, antingen proteiner eller syntetiska färgämnen. Eftersom det utsända ljuset utanför fokalplanet är blockerad av en fysisk rumslig filter är hög kontrast bildbehandling möjlig även i tjocka prover, samtidigt som den höga bildhastighet som är typiska för lätta plåt arkitektur. Den viktigaste frågan att ta itu med när man använder de beskrivna metoderna är att maximera kontrasten. I själva verket är den tillgängliga signalen minskas både genom kemiska och optiska faktorer. Ur kemisk synpunkt kan clearingförfaranden baserade på organiska lösningsmedel släcka utsläpp från fluorescerande proteiner och andra fluorescerande färgämnen 7. Filtrering av lösningsmedlet för avlägsnande av peroxider, såsom beskrivs av Becker et al. 10 medger upprätthållande av en god nivå av fluorescens även i lösningsmedels rensas vävnader. Published vattenbaserade clearingmetoder 14 inte minskar fluorescens effektivitet, utan att leda till sämre insyn när det handlar om hela murina hjärnor, åtminstone med linjära optiska tekniker. Å andra sidan, just nu finns det inga kommersiella mål med långa arbetsavstånd korrigerade för högt brytningsindex (n ≈ 1,56) rensa lösningar som används. Sålunda refraktionsindexet obalans mellan det medium i vilket provet är nedsänkt och designen en av målet ger upphov till starka sfäriska avvikelser. Förutom att minska upplösningen av mikroskop, sådana avvikelser resulterar i en minskning av bildintensitet och kontrast, eftersom ljuset sprids på ett större område. Möjliga lösningar till detta problem inkluderar användning av adaptiv optik 15 och / eller statiska asfäriska correctors. Varje förbättring i bild kontrast och intensitet drabbar lätt även utskriftshastighet, eftersom en kortareintegrationstiden per bild kan väljas. Just nu CLSM råd med en utskriftshastighet på ca 10 6 ìm 3 / sek, med en kamera exponeringstid på 100 ms 9. Vid denna hastighet tar det 1-3 dagar till bilden en hel mus hjärna, beroende på provstorlek. Även om ingen betydande försämring av bildkvaliteten observeras under så lång avbildning session, främst på grund av den inneboende låg fotoblekning av ljus plåt belysning 6, den långa tid som krävs för att bilden en enda mus hjärna kunde i praktiken minskar tillämpningen av CLSM. En ökning av 10-faldigt i systemeffektivitet, tillsammans med användning av en höghastighetskamera för detektering, skulle reducera avbildningstiden till flera timmar, vilket gör att en rutinmässig användning av det beskrivna protokollet. Trots alla ovan nämnda begränsningar, CLSM avbildning kopplad till kemisk röjning av vävnader tillstånd att rekonstruera hela mushjärnor med micron skala upplösning på mindre än enveckan. Andra optiska metoder för hela hjärnröntgen råd med högre upplösning än CLSM, men till priset av längre förberedelser och / eller bildbehandling tid 2-4, eller av en gles z provtagning 5. De metoder som beskrivs i den här artikeln kan användas i kombination med olika strategier för fluorescerande märkning: transgena djur som uttrycker fluorescerande proteiner i utvalda neuronala delmängder, viral transfektion, intraparenkymal färgämne injektion etc. I praktiken alla färgningsstrategier före djuroffer är kompatibla med CLSM . I själva verket har obduktions fluorescerande märkning av hela mushjärnor inte visats hittills, i alla fall, om en sådan typ av färgning skulle vara möjligt inom en snar framtid, hur många exemplar som kunde rekonstrueras med CLSM kommer att bli mycket större, inklusive möjlig mänsklig hjärnvävnad. Sammanfattningsvis konfokala ljus ark mikroskopi används i kombination med tissue clearing och multi-upplösning datahantering kan tillåta forskare att rekonstruera och analysera makroskopiska prover med upplösning i micron skala, med tekniska insatser som är bra i handen för de flesta laboratorier. Potentiella tillämpningar av CLSM är naturligtvis inte begränsad till neurovetenskap, utan spänner över alla forskningsfält där ljuset blad mikroskopi har redan använts, som embryogenes 16,17 och anatomi smådjur 18.

Jämfört med vår förståelse av den molekylära och cellulära mekanismer bakom hjärnans funktion, vår kunskap om fina neuroanatomi ser fortfarande i sin linda 1. I själva verket saknas fortfarande heltäckande kartor över läget för neuronal somata eller långsiktiga prognoser i hela hjärnan. Egentligen är många tekniska ansträngningar åt att rekonstruera musen hjärnan med mikroskopisk upplösning. Optiska metoder baserade på seriesnittning av harts inbäddade prover, som knivsegg Scanning Mikroskopi (KESM) 2, Micro-Optical Sektione Tomography (MOST) 3 och fluorescens-MOST (fMOST) 4, kan ge submikrona tredimensionell upplösning avbildning av hela mushjärnor. Emellertid är den totala tid som krävs för framställning och avbildning av ett enda prov i storleksordningen av flera veckor, vilket begränsar den praktiska tillämpningen av sådana metoder. En annan teknik som bygger på seriesnittning (men utan harts inbäddning), Serial Two-Photon tomografi (STP) 5, tillåter hög tredimensionell upplösning. Emellertid har denna teknik visat i hela mushjärnor endast med en mycket gles provtagning, insamling av ett avsnitt varje 50 | am 5 samt vår kunskap STP ännu inte har producerat en full-sampling rekonstruktion av en murin hjärna. En avancerad optisk metod för att rekonstruera hela exemplar i tre dimensioner med hög hastighet är lätt blad mikroskopi 6. I detta optiska system provet belyses med ett tunt ark av ljus och fluorescensemissionen uppsamlas längs en axel som är vinkelrät mot belysningsplanet. På detta sätt endast i-fokus fluoroforer är glada och det är möjligt att uppnå en optisk sektionering i fältkonfiguration bred, som garanterar hög bildhastighet. När kopplat till clearing protokoll som bygger på ersättning av vatten med ett brytningsindex matchning vätska 7, har ljus ark mikroskop tillämpats påmakroskopiska prover, som hela mushjärnor 8. Men provet-inducerad ljusspridning, som påverkar ens clearade exemplar, försämrar ljus arket leder till excitation av out-of-fokus fluoroforer som tillför en övergripande oskärpa till de förvärvade bilderna. För att selektivt samla in endast i-fokus fotoner, vi nyligen kopplat ljus plåt belysning till en konfokala detektionssystemet 9. I konfokal ljus ark mikroskop (CLSM), out-of-fokus och spridda fotoner avslås av en linjär rymdfilter (springa) före detektering (figur 1). För att uppnå konfokal operation i ljus ark arkitektur, är belysning medelst en avsökningslinje, och en de-avsökningssystem i detekteringsvägen skapar en statisk bild av exciteringsavsökningslinjen vid läget för slitsen. Ett tredje skanningssystem rekonstruerar en tvådimensionell bild på kamerans sensor. CLSM ger en 100% kontrastförbättring i rensas mushjärnor i förhållande till konventionell ljusblad mikroskopi, samtidigt som en 10 Hz bildfrekvens. Med CLSM är det möjligt att rekonstruera hela mushjärnor med upplösning på 2 | im i XY och 9 ^ m i Z, och med tillräcklig kontrast för att urskilja enstaka fluorescensmärkta neuroner. I denna artikel beskriver vi den experimentella pipeline att rekonstruera en mus hjärna med CLSM. Aldehydetrar fast mushjärnorna är uttorkad i en graderad serie av peroxid-fri tetrahydrofuran och därefter godkännas i peroxidfri dibensyleter (figur 2), efter det protokoll som utvecklats av Becker et al. 10 rensas provet sedan försiktigt monterad på en tippat platta och placerad i avbildning kammare av en skräddarsydd konfokala ljus ark mikroskop. Provet kan monteras direkt vid plunging den på en spets av plattan (figur 3a), alternativt kan det limmas på en skiva av rensas agarosgel (Figur3b) eller placeras i hålrummet i en bägare tillverkad av rensas agarosgel (Figur 3c). En optisk tomografi av hela hjärnan utförs sedan, så många parallella intilliggande staplar förvärvas för att täcka alla de hjärnvolym (Figur 4). En pre-tomografi sampling, som ger en grov karta över provets position och form, garanterar att bildbehandling utförs endast i den volym som upptas av provet. De tomografi stackar därefter sys ihop med skräddarsydd programvara och sparas i en multi-upplösning hierarkiskt system 11. Mus hjärnor så småningom kan utforskas med prototypal multi upplösning Google Maps-liknande visualiseringsprogram. Båda dessa mjukvaruinstrument är integrerade som insticksprogram i open-source plattform Vaa3D 12. Vi visar äntligen representativa bilder av mus hjärnor att undersöka möjligheterna med den beskrivna experimentella pipeline studera fin mus neuroanatomy.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Att förstå arkitekturen i däggdjurshjärnan vid encelliga upplösning är en av de viktigaste frågorna i neurovetenskap. Men kartläggning neuronal soma och prognoser i hela hjärnan är fortfarande utmanande för bild-och datahantering teknik. Faktum är makroskopiska volymer måste rekonstrueras med hög upplösning och kontrast i en rimlig tid, som producerar datamängder i TeraByte område. Vi visade nyligen en optisk metod (konfokala ljus ark mikroskopi CLSM) med förmåga att erhålla micron skala rekonstruktion av hela mushjärnor märkta med förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP). Kombinera ljus plåt belysning och konfokal upptäckt, gör CLSM djup avbildning inuti makroskopiska clearade prover med hög kontrast och hastighet. Här beskriver vi den kompletta experimentell pipeline att få heltäckande och mänskliga läsbara bilder av hela mushjärnor märkta med fluorescerande proteiner. Avräkning och monterings pÖRFARANDEN beskrivs, tillsammans med åtgärder för att utföra en optisk tomografi på hela sin volym genom att förvärva flera parallella intilliggande staplar. Vi visade användningen av öppen källkod skräddarsydda programverktyg som möjliggör sömnad av flera stackar och multi-upplösning uppgifter navigering. Slutligen, illustrerade vi några exempel på hjärnkartor: lillhjärnan från en L7-GFP transgen mus, där alla Purkinje celler selektivt märkta, och hela hjärnan från en thy1-GFP-M mus, som kännetecknas av en slumpmässig gles neuronal märkning.

Den beskrivna protokollet kan användas för att rekonstruera med micron skala upplösning antingen hela mushjärnor eller utskurna delar, utan behov av fysisk sektionering. Som ett representativt resultat, i figur 6 hela cerebellum av en L7-GFP mus (postnatal dag 10) visas. I detta djur alla Purkinje nervceller är märkta med EGFP. Om vi zoomar in, kan den typiska lamellära struktur cerebellar cortex ses (Figur 7). Ytterligare zoomar in kan tydligt skilja varje Purkinje cell soma (Figur 8). Den beskrivna protokollet kan alltså användas för att screena neuronal rumslig organisation i olika neuroutvecklingsstudier. Som ett andra representativt resultat, presenterar vi bilder från unsectioned hjärnan av en vuxen thy1-GFP-M-mus. I denna transgena djuret EGFP uttrycks i en slumpmässig gles neuronal delmängden. Den högra halvan av hjärnan visas i i figur 9. Som vizooma in längre och längre (figurerna 10 och 11), neuronala processer bli urskiljbara. Detta resultat visar att den beskrivna protokollet tillåter micron skala upplösning avbildning i hela vuxen mus hjärnor, öppnar möjligheten att studera hela hjärnan anatomi på cellupplösning i musmodeller av neurodegenerativa sjukdomar. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figur 1. Optiskt system för konfokala ljus ark mikroskopi (CLSM). (A) Övre vy av anordningen, som visar exciteringsvägen. Laser emission från en 488 nm diodpumpade fasta tillståndet (DPSS) laser, efter expansion och kollimering medelst ett första teleskop, inträder ett akustooptiskt avstämbart filter (AOTF), som reglerar strålens intensitet. Sedan en andra teleskop expanderar ytterligare balken. En galvanometerspegeln vertikalt (längs y) skannar vara<html> am, som fokuseras av en lins inuti provkammaren. (b) sidovy av anordningen, och visar detekteringsvägen. Ljus samlas in av detekteringsmålet är vertikalt descanned av en galvanometerspegeln och fokuseras av en lins, som producerar en fast bild av rörliga excitation linjen. Vid läget för den fasta bilden en linjär rymdfilter (slits) är placerad. Efter slitsen, en galvanometerspegeln placeras inuti en 4f linssystem rekonstruerar en två-dimensionell bild på chipet av en elektron multiplicera laddningskopplad anordning (EM-CCD). En fluorescens bandpassfilter bort alla excitation ströljus före upptäckt. Representativa strålar av excitation, upptäckt och bandpassfiltrerade upptäckt ljus avbildas med blå, ljusblå och gröna strålar, respektive. De brännvidder på alla objektiv som faktiskt används i mikroskop anges. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; alltid &quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Figur 2. Specimen clearing. Formaldehydfixerade mushjärnor, vilka lagras i PBS 0,1 M vid 4 ° C (a), är uttorkad i en graderad serie av tetrahydrofuran (THF, b) och godkändes därefter i 100% dibensyleter (DBE , c). Dehydratiseringssteget orsakar också viss vävnad krympning. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Figur 3. Specimen montage för CLSM-avbildning. Det klarnade hjärnan kan direkt nedsänkt i tippat monteringsplatta (a), limmade på en rensas agaros skiva (b), eller sättas in i ett rensat agaros bägare (c). Figur 4. Tomography förvärv. De pre-tomografi rutinprover en parallellepiped med hjärnan (a) för att fastställa antalet och längden på parallella intilliggande staplar som behövs för att bilden hela provet (b). Efter tomografi, är svarta bilder genereras för att avsluta den virtuella förvärvad volym till en parallellepiped (c). <img alt="Figur 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figur 5. Volym sömmar. Den samlade bilden stackar delvis överlappar mellan varandra (a), vilket gör att deras exakta anpassning till TeraStitcher plugin (b). Insticksprogrammet sammanfogar sedan de inriktade staplarna i antingen en enkel-staplade (c) eller fler STAcked (d) multi-upplösning representation. <img alt="Figur 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figur 6. Hela lillhjärnan av en P10 L7-GFP mus, där alla Purkinje nervceller är märkta med EGFP. Skala bar, 1 mm. <img alt="Figur 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figur 7. Zoomning av en del av cerebellum som visas i figur 6, som visar den typiska lamellär struktur cerebellar cortex. Scale bar, 500 | im. <img alt="Figur 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figur 8. Ytterligare zoom-in av en del av cerebellum visas i figur 6. Purkinje-celler soma klart kan skiljaed. Skala bar, 200 nm. <img alt="Figur 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Figur 9. Högra halvan av hjärnan från en vuxen thy1-GFP-M mus, som kännetecknas av en gles ospecifik neuronal EGFP märkning. Skala bar, 1 mm. <img alt="Figur 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figur 10. Zooma in på ett parti av den halv hjärna visas i figur 9, som visar en del av hippocampus och cortex. Scale bar, 200 | im. <img alt="Figur 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figur 11. Ytterligare zoom-i av en del av den halva hjärnan som visas i figur 9. Flera neuriter i hjärnbarken klart kan särskiljas. Scale bar, 50 | im.

Watch this Scientific Journal Video about Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

I den här artikeln beskriver vi hela experimentella förfarande för att rekonstruera, med hög upplösning, den fina hjärnans anatomi fluorescerande mushjärnorna. Den beskrivna protokollet omfattar provberedning och clearing, exemplar montering för avbildning, uppgifter efterbearbetning och flerskalig visualisering.

Micron-skala Upplösning Optisk Tomography för hela musen hjärnor med Confocal Ljus Sheet mikroskopi

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optisk inspelning av suprathreshold neural aktivitet med encelliga och single-spik upplösning

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optisk koherenstomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualisering av Motor Axon navigering och kvantifiering av Axon Arborization i musembryon som använder ljus ark fluorescensmikroskopi

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Fritt flytande immunstaining av mushjärnor

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Karakterisering av neuromuskulära korsningar hos möss genom kombinerad konfokal och superupplösningsmikroskopi

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Registrering av kalciumtransienter i musens neuromuskulära korsning med hög tidsupplösning med konfokalmikroskopi

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Koherent Anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) Ansökan om avbildningsmyelinering i hjärnskivor

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Helhjärna encellig avbildning och analys av intakta neonatala mushjärnor med hjälp av MR, vävnadsrensning och ljusarkmikroskopi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Avbildning av åldrande cochlea med fluorescensmikroskopi

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Mus Retina OCT Fibergram Justering med konfokala bilder

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Författare Spotlight: Framsteg inom in vivo och ex vivo näthinneavbildning för förbättrad diagnos och behandling av glaukom 

Justering av optisk koherenstomografi i synligt ljus med konfokala bilder av samma musnäthinna

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...