Name: facial transplants in xenopus laevis embryos
Uploaded: 2014-03-26T13:00:00
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Wir danken Radek Sindelka für seine Hilfe und Cas Bresilla für die Unterstützung mit Froschhaltung und Embryo Vorbereitung. Diese Arbeit wurde durch die NIH über die Erteilung R01DE021109 zu HLS Laura Jacox finanziert wurde von der Herschel Smith Graduiertenstipendium an der Harvard University und einen F30 einzelner Stipendien Zuschuss F30DE022989-01 durch die NIDCR finanziert.

1. Vorbereiten Reagenzien <ol><li> 10x MBS: Bereiten 1 l 10x Geändert Barths Saline (MBS)-Lösung 17. Siehe Tabelle 1, Reagenzien Bestandteile und Anweisungen. Verwenden Sie destilliertes Wasser für alle Lösungen. Mischen Sie in einem Becherglas mit einem Rührstab, bis zur vollständigen Auflösung. Alle Lösungen sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden. </li><li> 1x MBS: Verdünnen Sie 100 ml 10x MBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser auf 1 l 1x MBS zu machen. Hinzufügen v...

<ol>
	<li>Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Syndromes of the head and neck. , (1990).</li><li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+birth+defects:+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention.">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+:+I.">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I.</a> Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).</li><li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+II.+The+prosencephalic+neural+plate+and+neural+folds:+Implications+for+the+genesis+of+cephalic+human+congenital+abnormalities.">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities.</a> Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).</li><li>Lievre, A. L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras.">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li><li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).</li><li>Trainor, P., Tam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+of+the+mouse+embryo-+codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+the+branchial+arches.">Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches.</a> Dev. 121, 2569-2582 (1995).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. , (2000).</li><li>Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino+injection+in+Xenopus.">Morpholino injection in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li></ol>

Kritische Schritte und Einschränkungen: Der EAD Gesichtstransplantation Verfahren ist zeit-und arbeitsintensiv. Es erfordert Übung, ruhige Hände und Fingerfertigkeit zu perfektionieren. Die Gesichtstransplantation Protokoll beruht auf der Fähigkeit des Forschers, um effizient zu entfernen und Transplantatgewebe. Wenn man zu lange braucht, um die Transplantation in das Wirts Gesicht einfügen, wird der Host Gesicht beginnen, sich zusammenzuziehen und zu heilen. Pinzetten können verwendet werden, um den Gesich...

Um Mechanismen bei kraniofazialen Entwicklung zugrunde liegenden Gesichtsschädelfehlbildungen 1-2, wichtige Gewebe und deren Signalbeiträge zu verstehen, müssen identifiziert werden. In dem Frosch Xenopus laevis, Teil des Gesichts, einschließlich der Mund-und Nasenlöcher Form aus der &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD), wo Ektoderm und Endoderm direkt nebeneinander 3-4. Der EAD dient auch als Signalzentrum, um das umliegende Gewebe, einschließlich der Schädel Neuralleiste, die die Kiefer und andere Gesichtsbereiche 5 bildet beeinflussen. Um Gene, die EAD-Funktion beitragen zu identifizieren, wurde eine &quot;Gesichtstransplantation&quot;-Technik entwickelt, bei der Gewebe wird von einem Spender in eine Wirts Embryo verpflanzt, nach dem Entfernen der entsprechenden Host-Region. Nach der Transplantation, was Gesichtsentwicklung beurteilt. Somit werden die Auswirkungen der Funktionsverlust (LOF) oder Überfunktion (GOF) für ein spezifisches Gen in der EAD lokal analysiert, wobei der Rest der head und Körper von Wildtyp-Gewebe besteht. Die wechselseitige Transplantation durchgeführt werden kann, in dem Wildtyp-Gewebe wird in Embryonen mit globaler LOF oder GOF in bestimmten Genen transplantiert. Transplantation wurde häufig in Xenopus verwendet und Küken studiert 6. Zum Beispiel hat Xenopus Transplantation homo neurale Induktion, Objektiv und neuronalen Kompetenz und Neuralleiste Migration 7-10 gerichtet. Wachtel-Küken chimären Transplantation hat die Entwicklung der anterioren Neuralplatte vorderen neuronalen Grat, Neuralleiste und Schädelknochen 11-14 analysiert. Dies ist die erste Transplantation Technik für die Untersuchung der Schädelentwicklung in Xenopus. Diese Technik hat eine neue Rolle für den Wnt-Inhibitoren Frzb1 und Halbmond bei der Regulierung der Basalmembran Bildung im Mund mutmaßlichen 5 demonstriert. Xenopus laevis ist ein ideales Modell für die Untersuchung der Schädelentwicklung als Embryonen groß sind, entwickeln extern einnd das Gesicht ist gut sichtbar, so dass die Mikromanipulation und Bild der Entwicklung. Mechanismen, die Gesichtsentwicklung konserviert erscheinen, die anzeigt, dass Ergebnisse in der Frosch machte einen Einblick in die menschliche Entwicklung 4,15-16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Pasteur pipette</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">14672-400</td>
			<td style="width:128px;">Lime Glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Size 5 3/4&#8217;&#8217;</td>
			<td style="width:128px;">Cotton Plugged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;">Disposable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:195px;">Graduated Transfer Pipette</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">16001-180</td>
			<td style="width:128px;">Disposable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Polyethylene</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:195px;">#5/45 forceps</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools by Dupont medical</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">11251-35</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">Angled 45 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="81" rowspan="3" style="height:81px;width:195px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">11000-20</td>
			<td style="width:128px;">Straight; serrated tip</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Stainless Steel;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">20cm long</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">FHC</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">30-30-1</td>
			<td style="width:128px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">100mm each</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Cover slip&#160;</td>
			<td rowspan="4" style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">48393 252&#160;</td>
			<td style="width:128px;">24x60mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">micro cover glass</td>
			<td style="width:136px;">or&#160;</td>
			<td style="width:128px;">or&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">(for glass bridges)</td>
			<td style="width:136px;">48393 230</td>
			<td style="width:128px;">24x40mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">No.1.5</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F9378</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Needle Puller&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">Needle Puller: discontinued Filament: FB300B</td>
			<td rowspan="3" style="width:128px;">The most similar, currently available&#160; needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">Model P-80</td>
			<td style="width:101px;">Flaming / Brown micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">(discontinued)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Stereomicroscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zeiss Stemi 1000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:195px;">Stereomicroscope Lighting by Fostec</td>
			<td style="width:101px;">Fostec</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;">Use a light box with 2 fiberoptic arms.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">26018-17</td>
			<td style="width:128px;">Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Length: 17cm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="101" rowspan="3" style="height:101px;width:195px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">26016-12</td>
			<td style="width:128px;">Jaw opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Length: 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:195px;">Tungsten Needles</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">10130-05</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">0.125mm Rod diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Van Aken Plastalina</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Blick&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">#33268-2981</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Modeling Clay- white, red or yellow</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">mMessage mMashine SP6 or T7 Kit</td>
			<td style="width:101px;">Ambion</td>
			<td style="width:136px;">AM1340</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facial transplants in xenopus laevis embryos

Craniofacial Geburtsschäden treten in 1 aus jeden 700 Lebendgeburten, aber Ätiologie wird selten aufgrund der begrenzten Verständnis der kraniofazialen Entwicklung bekannt. Um festzustellen, wo Signalwege und Gewebe während der Strukturierung der Entwicklungs Gesicht handeln, hat eine &quot;Gesichtstransplantation&quot;-Technik in Embryonen von dem Frosch Xenopus laevis entwickelt. Eine Region der vermutlichen Gesichtstücher (die &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD)) von einem Spender an Schwanzknospen-Embryonen Stufe entfernt und auf eine Wirtsembryo der gleichen Stufe, aus dem die äquivalenten Bereich entfernt wurde transplantiert. Dies kann verwendet werden, um einen chimären Gesicht, wo der Host-oder Spendergewebe hat einen Verlust oder Gewinn von Funktion in einem Gen, und / oder enthält einen Label-Linie zu erzeugen. Nach der Heilung wird das Ergebnis der Entwicklung überwacht und anzeigt Rollen der Signalweg innerhalb des Spenders oder des umgebenden Wirtsgewebe. Xenopus ist ein wertvolles Modell für die Entwicklung Fläche, wie der Gesichtsbereich groß ist und leicht eineccessible für die Mikromanipulation. Viele Embryonen untersucht werden können, die über einen kurzen Zeitraum, da die Entwicklung rasch erfolgt. Ergebnisse in der Frosch sind relevant für die menschliche Entwicklung, da craniofacial Prozesse erscheinen zwischen Xenopus und Säugetieren konserviert.

Transplantierte Gewebe sollten vollständig nach der Transplantation in die Wirtskopf eingesetzt werden, wie in 3A gezeigt, und haben eine Glasbrücke entsprechend auf dem Gesicht des Embryos platziert, wie in Abbildung 2Bc gezeigt. Das transplantierte Spendergewebe muss korrekt für die Host-Öffnung bemessen sein, für die Transplantation erfolgreich zu sein. Die EAD Gewebe nicht aus dem Kopf herausragen, in irgendeiner Weise, wie in den 3B und 3C zu ...

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Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Eine Technik zum Trans &quot;Extreme Anterior Domain&quot; Gesichtsgewebe zwischen Xenopus laevis-Embryonen entwickelt. Tissue kann von einem Gen-Expression Hintergrund in eine andere verschoben werden, so dass die Untersuchung der lokalen Anforderungen für kraniofaziale Entwicklung und zur Signalisierung von Wechselwirkungen zwischen Gesichtsregionen.

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Forschung

Biologie

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...