Name: yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 at JoVE.com

نود أن نشكر اندريا Kremsreiter للحصول على مساعدة فنية ممتازة. ويدعم عمل في مختبرنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM096088 وفيلاس الثقة من جامعة ويسكونسن - ماديسون.

1. طرق Luminometry الخميرة استخدام سلالة BYYT من خميرة الخباز. بل هو yvc1-tok1 المشتقة من BY4741 (ماتا، ura3D0، his3D1، leu2D0، lys2D0، yvc1 :: HIS3، tok1 :: kanMX4). تحويل الخلايا مع، معربا عن البلازميد aequorin pEVP1/Aeq-ليو اختيار والجرذان، معربا عن البلازم?...

<ol>
	<li>Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+TRP+channels.">An introduction to TRP channels.</a> Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).</li><li>Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+family+of+ion+channels.">The transient receptor potential family of ion channels.</a> Genome Biol. 12, 218 (2011).</li><li>Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vallinoid+transient+receptor+potential+channel+Trpv4:+From+structure+to+disease.">The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).</li><li>Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+puzzle+of+TRPV4+channelopathies.">The puzzle of TRPV4 channelopathies.</a> EMBO Rep.. , (2013).</li><li>Liedtke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanilloid+receptor-related+osmotically+activated+channel+(VR-OAC),+a+candidate+vertebrate+osmoreceptor.">Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor.</a> Cell. 103, 525-535 (2000).</li><li>Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OTRPC4,+a+nonselective+cation+channel+that+confers+sensitivity+to+extracellular+osmolarity.">OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity.</a> Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).</li><li>Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trp12,+a+novel+Trp+related+protein+from+kidney.">Trp12, a novel Trp related protein from kidney.</a> FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).</li><li>Delany, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+human+vanilloid+receptor-like+protein,+VRL-2.">Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2.</a> Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).</li><li>Rock, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+in+TRPV4+cause+autosomal+dominant+brachyolmia.">Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia.</a> Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).</li><li>Krakow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+gene+encoding+the+calcium-permeable+ion+channel+TRPV4+produce+spondylometaphyseal+dysplasia,+Kozlowski+type+and+metatropic+dysplasia.">Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia.</a> Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).</li><li>Camacho, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+TRPV4+mutations+in+nonlethal+and+lethal+metatropic+dysplasia.">Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia.</a> Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).</li><li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+permeation+through+the+cation+channel+TRPV4.">Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+TRPV4+gating+by+intra-+and+extracellular+Ca2.">Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2.</a> Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+brachyolmia-causing+mutant+TRPV4+channels+respond+directly+to+stretch+force.">Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force.</a> J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).</li><li>Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-modulated+diversity+of+TRPV4+channel+gating:+activation+by+physical+stresses+and+phorbol+ester+derivatives+through+protein+kinase+C-dependent+and+-independent+pathways.">Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways.</a> J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+and+arachidonic+acid+use+epoxyeicosatrienoic+acids+to+activate+TRPV4+channels.">Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels.</a> Nature. 424, 434-438 (2003).</li><li>Vriens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+swelling,+heat,+and+chemical+agonists+use+distinct+pathways+for+the+activation+of+the+cation+channel+TRPV4.">Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).</li><li>Vincent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+TRPV4+modulators.">Identification and characterization of novel TRPV4 modulators.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).</li><li>Willette, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+activation+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid+subtype+4+channel+causes+endothelial+failure+and+circulatory+collapse:+Part+2.">Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).</li><li>Thorneloe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orally+active+TRPV4+channel+blocker+prevents+and+resolves+pulmonary+edema+induced+by+heart+failure.">An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+dysplasia+caused+by+a+constitutive+activated+transient+receptor+potential+vanilloid+4+(TRPV4)+cation+channel+mutation.">Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation.</a> Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).</li><li>Lamande, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TRPV4+cause+an+inherited+arthropathy+of+hands+and+feet.">Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet.</a> Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Basal+Activity+Is+a+Key+Determinant+in+the+Severity+of+Human+Skeletal+Dysplasia+Caused+by+TRPV4+Mutations.">Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypotonic+shocks+activate+rat+TRPV4+in+yeast+in+the+absence+of+polyunsaturated+fatty+acids.">Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids.</a> FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+reveals+multiple+gating+mechanisms+of+TRPV4.">Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).</li><li>Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+respond+to+hypotonic+shock+with+a+calcium+pulse.">Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse.</a> J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmoprotective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell+wall-compromised+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Denis, V., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+Ca(2+)+release+in+yeast+is+triggered+by+hypertonic+shock+and+mediated+by+a+TRP+channel+homologue.">Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue.</a> J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).</li><li>Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+perturbations+sensitize+osmotic+down-shock+activated+Ca2++influx,+a+yeast+&amp;#34;deletome&amp;#34;+analysis.">Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast &amp;#34;deletome&amp;#34; analysis.</a> FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).</li><li>Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmo-protective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell-wall-compromized+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 294, (1999).</li><li>Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).</li><li>Loukin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+a+region+important+for+gating+of+the+yeast+K++channel+Ykc1.">Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1.</a> EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC1+forms+the+stretch-activated+cation+channel+in+vertebrate+cells.">TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells.</a> Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).</li></ol>

كما جاء في المقدمة، الطرق المستخدمة شيوعا لدراسة وظائف TRPV4 أدى في بعض الأحيان في التناقضات والخلافات. مجموعتين من الأساليب المذكورة هنا توفر بعض المزايا ويمكن أن تكمل الطرق القائمة. في حين وصفنا فقط على الدراسات TRPV4، ويجوز تمديد الطرق لدراسة قنوات الأيونات الأخرى كذ?...

تضم الحزب الراديكالي عبر الوطني (إمكانات مستقبلات عابرة) سبعة تحت العوائل من القنوات الموجبة التي تخدم الوظائف الحسية 1،2. في الثدييات، TRPV، فصيلة vanilloid من الحزب الراديكالي عبر الوطني، لديه ستة أصناف. TRPV4 (نوع 4) 3،4 يستجيب للحرارة وبعض المواد الكيميائية، وتورم التناضحي، أو إجهاد القص. تم عزل الجين TRPV4 مرارا وتكرارا من قبل مرشح الجينات و / أو التعبير استنساخ 5-8. يتبع الأسلوب الأخير استجابة الجين المنتج لقصور الأسمولية. وأعرب عن TRPV4 في ما يقرب من جميع الأجهزة وظائف في تطوير وظائف الأعضاء، علم الأمراض أو من العديد من أنواع الخلايا المختلفة 3،4. لفتا هي&gt; 50 جسمية الإنسان الطفرات TRPV4 المهيمنة، مما تسبب اعتلال الأعصاب الطرفية و / أو خلل التنسج العظمي (تشوهات في الهيكل العظمي التنمية) 9-11. خلل التنسج العظمي تتراوح بين معتدلة نوع brachyomia 3 (نوع 3 التقزم) وخلل التنسج spondylometaphyseal نوع كوزلوفسكي، لسفإعادة خلل التنسج، مما تسبب في بعض وفيات الولدان أو الجنينية. على الرغم من جميع الخلق من الآليات يبدو ممكنا، لا شيء يفسر التنوع والتعقيد، وتقلب، والتداخل في بعض الأحيان من هذه الأمراض 4. مثل القنوات الأخرى TRP 1، TRPV4 هو tetramer. في الفئران أو TRPV4 الإنسان، يتكون كل الوحيدات من 871 المخلفات. العنصر المركزي هو الغشاء ستة من اللوالب (S1-S6)، والتي من المرجح رتبت بطريقة مشابهة لK + قنوات الجهد بوابات. هناك، S1 إلى S4 تشكيل المجال الطرفية وS5 S6 وتشكل المجال تخلل المسام. S5 S6 بين وTRPV4 من هو الحلزون المسام قصيرة تليها LDLFKLTIGMGDL تسلسل، أربعة منها تتلاقى يفترض أن يشكل مرشح الموجبة. و470-بقايا الجزء حشوية N-محطة يحتوي على 6 يكرر ankyrin، والمعروف أن ربط البروتينات أو بروابط صغيرة. ويشمل الجزء حشوية 152-C-بقايا محطة تسلسل ملزمة كالمودولين بين المواقع المحتملة الأخرى التي تربط التمديدعناصر لها 3. TRPV4 هي قناة الموجبة التي تستثني أساسا الأنيونات 1. بينما وظيفتها الفسيولوجية هو تنبيغ المحفزات لكا 2 + تدفق، بل هو أيضا قابلة للاختراق لالكاتيونات الأخرى مع تسلسل نفاذية آيزنمان الرابع، لصالح ثنائي التكافؤ في كاليفورنيا P: P نا ~ 7 12. يصحح على قناة واحدة تصرف في ~ 90 ~ PS الخارج والداخل 40 PS 6،13،14. أعرب Heterologously الحالية (أدناه) يمكن تفعيلها من خلال الاسموزي للفراش لا تسبب تورم، وإجهاد القص، أو الدفء 15. يتم تنشيط أيضا من قبل الأحماض الدهنية غير المشبعة و16،17 استر phorbal الاصطناعية 4αPDD 18. في الوقت الحاضر، وناهض هو أقوى GSK1016790A 19 وخصم هو GSK2193874 وفعالة في 10 -9 إلى 10 -8 M 20، وكلاهما اكتشف بواسطة الإنتاجية العالية، وشاشة صغيرة الجزيئية. يظل مجالين رئيسيين للبحوث TRPV4 مربكة: (1) وحتى يتم دراسة TRPV4 إلى حد كبير عن mechanosensitivity لها، أساسها الجزيئي أمر مثير للجدل. يصف نموذج واحد قصور الأسمولية ينشط بطريقة أو بأخرى فسفوليباز A2 (PLA2) لإنتاج حمض غير مشبع الدهنية (بوفا) حمض الأراكيدونيك (AA)، والتي يتم تحويلها إلى حمض epoxyeicosatrienoic (EET) من قبل epoxygenase، وربط EET ينشط TRPV4 16، 17. بعد، وقد تبين TRPV4 نفسها للرد مباشرة على غشاء تمتد 14 (أدناه)، وتوفير أبسط تفسير. (2) وأمراض متحولة TRPV4 محيرة. في الأساس، ويحتاج المرء إلى معرفة ما إذا كانت الأمراض هي نتيجة لفقدان أو تخفيض، أو زيادة أنشطة القناة. حتى هنا، فإن الأدب هو أبعد ما يكون عن الوضوح. في حين تم الإبلاغ عن عدة الأليلات الهيكل العظمي، خلل التنسج لديك أنشطة العالي، (مكاسب من وظيفة، GOF) 4،21، تم الإبلاغ عن عدة أن ينخفض ​​الأنشطة (الخسارة من وظيفة، LOF) 10،22. دراسة منهجية ل14 الأليلات جدت لها أنجميع الطفرات أن صندوق القناص (أدناه) 23. الادعاء بأن بعضها LOFs يبدو أن تتعارض مع النمط الظاهري من trpV4 / - خروج المغلوب الماوس، والتي هي قابلة للحياة أو الخصبة، مع عيوب طفيفة فقط، على الرغم من خسارة كاملة من وظيفة TRPV4. وهناك جزء من هذه الخلافات وأصله المنهجية. مختبرات استخدام أساليب مختلفة، أو أنواع من أسلوب واحد، وتوظيف معايير التحكيم المختلفة. الأكثر شيوعا، وأعرب عن TRPV4 عابر في خلايا الثدييات مثقف (كلوة الجنين البشري، شو، هيلا) مسجلة وصعود الداخلية [كا 2 +] على ناهض أو التحفيز ناقص التوتر مع كا 2 صبغة الفلورسنت الحساسة لل+، FURA-2. وقد انتقد الاعتماد المفرط على هذا الاختبار فلوروميتريك 1. مستوى التعبير في مختلف قطاعات السكان، والتوزيع فيه، فضلا عن تركيز الصبغة فعالة، يجب أن يكون للرقابة وتوثيقها. هو أكثر موثوقية الامتحانات الكهربية مباشرة. حتى هذا، كما commonlذ يمارس، هو أيضا لا يخلو من المشاكل. لأن مستويات التعبير في الخلايا المستزرعة الفردية هي من الصعب السيطرة عليها، والتيارات خلية كاملة لديها اختلافات كبيرة. أبعد من ذلك، لأن التيارات الصغيرة، وسوف إحصاءات موثوقة أن تعتمد على عينات كبيرة الحجم، غالبا ما تكون غير عملية. ونادرا ما أجريت فحوصات التصحيح، المشبك. تظهر بعض هذه التسجيلات مجموعات من رشقات نارية النشاط التي تجعل التقييم الإحصائية تحديا 16،17. إلى فهم أفضل للmechanosensitivity الجزيئية، قمنا بتطوير نظامين إضافية لدراسة TRPV4. (1) لعزل TRPV4 بعيدا عن شركائها الثدييات المعتادة، أبدينا TRPV4 الفئران في مهدها الخميرة 24. أظهرت التعبير الوظيفي للTRPV4 في هذا السياق بعيدة تطويريا أنه لا يزال من الممكن الرد على القوة الاسموزي دون شركائها المعتادة. لأن الخميرة لا تقدم أي PUFAs مثل AA أو EET، والجينوم لا يوجد لديه PLA2 أو epoxygenase الجينات، وهذا expreيظهر ssion أيضا أن لا حاجة لها للTRPV4 لاستشعار القوة. وجود TRPV4 في حقيقيات النوى الجزيئية البيولوجية الأكثر قابلية يسمح أيضا التلاعب فعالة إلى الأمام أو عكس الوراثية 25. (2) لفي عمق التحليلات الفيزيائية الحيوية من TRPV4، عبرنا عن TRPV4 في البويضات القيطم. على عكس الخلايا المستزرعة، والتي تسفر الفرعية غ لنا (10 -10 إلى 10 -9 A) التيارات، بويضة عن التيارات في لأمبير (10 -6 إلى 10 -4 A). إشارة أكبر بكثير على الضوضاء يسمح أفضل الكمي والمقارنة أكثر ثقة. TRPV4، لذلك أعرب، ويمكن أيضا أن تدرس كما الجزيئات الفردية باستخدام المشبك التصحيح. A بويضة واحدة يسمح أخذ العينات التصحيح المتكررة، مرة أخرى مما يجعل الكمي أكثر موثوقية. وأظهرت هذه الدراسات أن TRPV4 قناة نفسها يمكن تفعيلها مباشرة بالقوة تمتد غشاء 14. وأظهرت التحاليل أيضا أن 14 ممثل الأليلات الهيكل العظمي، خلل التنسج كلها مكاسب من وظيفة الطفرات. علاوة على ذلك، degrه ه من هذا التسرب + التأسيسية كا 2 يوازي شدة الأمراض الهيكل العظمي 23. لأن الجدة وجدواها، ويتم تجميع الإجراءات التفصيلية من هاتين الطريقتين هنا للسماح مكررات في البحوث المستقبلية على TRPV4 أو قنوات مماثلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td style="width:93px;">Wescor</td>
			<td style="width:119px;">Wescor 5500</td>
			<td style="width:167px;">Logan, UT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sirius Single Tube Luminometer </td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berhold</td>
			<td style="width:119px;">Sirius </td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microplate luminometer</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold </td>
			<td style="width:119px;">Mithras LB940</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luminometry software</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold</td>
			<td style="width:119px;">MikroWin2000</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">Patch clamp and software</td>
			<td style="width:93px;">Axon Instrument</td>
			<td style="width:119px;">HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software </td>
			<td>Union City, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">manometer</td>
			<td style="width:93px;">Bio-Tec</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Winooski, VT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipet puller</td>
			<td style="width:93px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:119px;">Model P-97</td>
			<td>Novata, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:93px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanoinject II</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material:</td>
			<td style="width:93px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">luciferin coelenterazine</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Carlsbad, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T7 RNA polymerase reaction</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">mMessage mMachine</td>
			<td>Austin, TX, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ruthenium red </td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">micropipets </td>
			<td style="width:93px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;">100 microliter micropipets</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-fidelity PfuUtra polymerase </td>
			<td style="width:93px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>La Jolla, CA, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4

وأعرب عن TRPV4 (عابر مستقبلات الإمكانيات، والأسرة vanilloid، نوع 4) على نطاق واسع في أنسجة الفقاريات ويتم تفعيلها من خلال العديد من المحفزات، بما في ذلك القوات الميكانيكية. الطفرات TRPV4 معينة يسبب العظام وراثية معقدة أو الأمراض العصبية في الإنسان. وأعرب البرية من نوع أو متحولة الجينات المحورة TRPV4 عادة في خلايا الثدييات مثقف وفحصها من قبل FURA-2 قياس التألق والأقطاب الكهربائية. من حيث آلية mechanosensitivity والأسس الجزيئية للأمراض، والأدب الحالي هو مربكة ومثيرة للجدل. لاستكمال الأساليب القائمة، ونحن تصف طريقتين إضافية لدراسة الخصائص الجزيئية للTRPV4. (1) يتم تحويلها الجرذ TRPV4 والتحوير aequorin في مهدها الخميرة. صدمة للفراش لا تسبب osmtic من السكان المحولة تعطي إشارة luminometric بسبب مزيج من aequorin مع كا 2 +، الذي صدر من خلال قناة TRPV4. هنا يتم عزل TRPV4 من البروتينات شريك الثدييات المعتادةويكشف mechanosensitivity الخاصة. (2) يتم حقن كرنا من TRPV4 في البويضات القيطم. بعد فترة مناسبة من الحضانة، يتم فحص TRPV4 الحالية العيانية مع الجهد المشبك يومين القطب. الارتفاع الحالي على إزالة osmoticum خاملة من الحمام البويضة يدل على mechanosensitivity. ومكرو أمبير (10 -6 إلى 10 -4 أ) التيارات من البويضات تكون أكبر بكثير من subnano إلى nanoAmpere (10 -10 إلى 10 -9 A) التيارات من الخلايا المستزرعة، مما أسفر عن quantifications أكثر وضوحا وأكثر ثقة المقررة. ويمكن أيضا أن التيارات المجهرية التي تعكس أنشطة البروتينات قناة الفردية تكون مسجلة مباشرة تحت المشبك التصحيح، في على خلايا أو وضع رفعه. يوفر نفس البويضة عينات التصحيح متعددة، مما يسمح نسخ البيانات على نحو أفضل. يمكن تطبيقها على الشحوم بقع تفعيل TRPV4 لتقييم mechanosensitivity مباشرة. ينبغي أيضا أن تكون هذه الأساليب مفيدة في دراسة أنواع أخرى من القنوات TRP.

في تجربة نموذجية luminometry، ويتحقق مجموعة من 400-1،200 الميلي أسمول الصدمات ناقص التوتر إلى أسفل من خلال إضافة 200 ميكرولتر من الحلول صدمة مختلفة الأسمولية المنخفضة إلى 20 ميكرولتر من الثقافة في 1،400 الميلي أسمول. النشاط TRPV4 هو واضح عند مقارنة RLU من التجريبية إلى أن اثنين من الض...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 at JoVE.com

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

لاستكمال الأساليب المستخدمة شيوعا لدراسة TRPV4، ويتم وصف طريقتين: mechanosensitivity ويمكن لها أن تدرسها كا 2 + luminometry-aequorin في الخميرة المعدلة وراثيا على التحدي للفراش لا تسبب الاسموزي. فإنه يمكن أيضا أن تدرس في TRPV4-RNA حقن البويضات القيطم من قبل خلية كاملة يومين الجهد الكهربائي المشبك المشبك أو التصحيح في خلية أو في وضع رفعه.

Luminometric الخميرة و<em&gt; القيطم</em&gt; سيت الكهربية الامتحانات من Mechanosensitivity الجزيئي للTRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

Research

JoVE Journal

Biology

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

تقنية التصوير السريع للخلايا الخميرة لايف مشلول

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

عملية الوحش الأخضر لتوليد سلالات الخميرة حمل حذوفات متعددة الجينات

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

ال<em&gt; القيطم</em&gt; سيت قص مفتوحة الفازلين جاب الجهد المشبك تقنية مع التألق

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...