Name: yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Andrea Kremsreiter per l&#39;eccellente assistenza tecnica. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato da NIH GM096088 e Vilas fiducia della University of Wisconsin - Madison.

1. Metodi di lievito luminometria Utilizzare ceppo BYYT di Saccharomyces cerevisiae. Si tratta di un yvc1-tok1-derivato di BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Trasformare cellule con i-equorina esprimendo pEVP1/Aeq plasmide Leu-selezionabili e ura selezionabili rat--TRPV4 esprimendo plasmide p416GPDV4, come descritto in Batiza et al. 26 e Loukin et al. 24 Con metodi sta...

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	<li>Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+TRP+channels.">An introduction to TRP channels.</a> Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).</li><li>Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+family+of+ion+channels.">The transient receptor potential family of ion channels.</a> Genome Biol. 12, 218 (2011).</li><li>Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vallinoid+transient+receptor+potential+channel+Trpv4:+From+structure+to+disease.">The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease.</a> Prog. Biophys. Mol. 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Chem. 278, 27129-27137 (2003).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+and+arachidonic+acid+use+epoxyeicosatrienoic+acids+to+activate+TRPV4+channels.">Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels.</a> Nature. 424, 434-438 (2003).</li><li>Vriens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+swelling,+heat,+and+chemical+agonists+use+distinct+pathways+for+the+activation+of+the+cation+channel+TRPV4.">Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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H., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypotonic+shocks+activate+rat+TRPV4+in+yeast+in+the+absence+of+polyunsaturated+fatty+acids.">Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids.</a> FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+reveals+multiple+gating+mechanisms+of+TRPV4.">Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).</li><li>Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. 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L., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmo-protective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell-wall-compromized+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 294, (1999).</li><li>Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).</li><li>Loukin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+a+region+important+for+gating+of+the+yeast+K++channel+Ykc1.">Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1.</a> EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. 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Come indicato nella Premessa, i metodi comunemente usati per studiare le funzioni TRPV4 talvolta portato a incongruenze e controversie. Le due serie di metodi qui descritti offrono alcuni vantaggi e possono integrare i metodi esistenti. Mentre si descrivono solo gli studi sulla TRPV4, i metodi possono essere estesi a studiare altri canali ionici pure. 1. Metodi di lievito luminometria Lievito in erba ha un nativo di Ca 2 +-risposta afflusso allo shock ip...

TRP (potenziali recettori transitori) comprendono sette sottofamiglie di canali di comunicazione che servono funzioni sensoriali 1,2. Nei mammiferi, TRPV, sottofamiglia vanilloid del TRP, ha sei varietà. TRPV4 (tipo 4) 3,4 risponde al calore, alcune sostanze chimiche, gonfiore osmotico, o shear stress. Il gene TRPV4 stato ripetutamente isolato mediante candidato-gene e / o espressione clonazione 5-8. Quest&#39;ultimo metodo seguito la risposta del prodotto genico di ipo-osmolarità. TRPV4 è espresso in quasi tutti gli organi e le funzioni per lo sviluppo, fisiologia, patologia o di molti tipi di cellule disparate 3,4. Striking sono le autosomiche dominanti umano mutazioni TRPV4&gt; 50, causando neuropatie periferiche e / o displasie scheletriche (anomalie nello sviluppo scheletrico) 9-11. La gamma di displasie scheletriche da lievi tipo brachyomia 3 (tipo 3 nanismo), displasia spondilometafisaria tipo Kozlowski, a Severe displasie, alcuni causando la morte neonatale o embrionale. Anche se tutte le maniere di meccanismi sembrano possibili, nessuno spiega la diversità, la complessità, la variabilità e sovrapposizioni occasionali di queste malattie 4. Come altri canali TRP 1, TRPV4 è un tetramero. Nel ratto o TRPV4 umana, ogni subunità è costituita da 871 residui. Il suo elemento centrale è il sei transmembrana una eliche (S1-S6), che sono probabilmente disposti in un modo simile a K + canali voltaggio-dipendenti. Lì, S1 a S4 formare un dominio periferico e la S5 e S6 formano il dominio permeazione poro. Tra S5 e S6 di TRPV4 è un&#39;elica poro breve seguito dal LDLFKLTIGMGDL sequenza, quattro delle quali presumibilmente convergono per formare il filtro catione. Il 470-residuo N-terminale del segmento citoplasmatico contiene 6 ripetizioni ankyrin, noti per legare le proteine ​​o piccoli ligandi. Il 152-residuo segmento citoplasmatica C-terminale include una sequenza-calmodulina legame tra gli altri possibili siti che legano oti suoi elementi 3. TRPV4 è un canale cationico che esclude essenzialmente anioni 1. Mentre la sua funzione fisiologica è per trasdurre stimoli a Ca 2 + afflusso, è anche permeabile ai cationi attraverso una sequenza permeabilità Eisenman IV, favorendo bivalente a P Ca: P Na ~ 7 12. Conduttanza monocanale rettifica a ~ 90 pS verso l&#39;esterno e verso l&#39;interno ~ 40 pS 6,13,14. Eterologamente espressa corrente (in basso) può essere attivato da ipo-osmotico gonfiore, sforzo di taglio, o di calore 15. Inoltre è stato attivato da acidi grassi polinsaturi 16,17 e l&#39;estere sintetico phorbal 4αPDD 18. Allo stato attuale, il più potente agonista è GSK1016790A 19 e antagonista è GSK2193874, efficace nel 10 -9 a 10 -8 M 20, entrambi scoperti da alta velocità, schermo piccolo-molecolare. Due settori chiave della ricerca TRPV4 rimangono confuse: (1) Anche se TRPV4 è ampiamente studiato per la sua mechanosensitivity, la sua base molecolare è controversa. Un modello descrive ipo-osmolarità qualche modo attiva la fosfolipasi A2 (PLA2) per produrre l&#39;acido grasso polinsaturo (PUFA) acido arachidonico (AA), che viene convertito in acido epoxyeicosatrienoic (TEE) da un epoxygenase, e il legame di EET attiva TRPV4 16, 17. Eppure, TRPV4 si è dimostrato di rispondere direttamente ai membrana tratto 14 (sotto), fornendo una spiegazione più semplice. (2) Le patologie mutanti TRPV4 sono sconcertanti. Alla base, si ha la necessità di sapere se le malattie sono dovute alla perdita, la riduzione o l&#39;aumento di attività di canale. Anche qui, la letteratura è tutt&#39;altro che chiara. Mentre alleli multipli scheletrico-displasia sono stati segnalati per avere attività superiori, (guadagno-di-funzione, GOF) 4,21, vari sono stati segnalati per aver ridotto le attività (perdita-di-funzione, LOF) 10,22. Uno studio sistematico di 14 alleli li ha trovati pertutte le mutazioni essere GOF (sotto) 23. L&#39;affermazione che alcuni sono LOF sembra contraddire il fenotipo di TRPV4-/ - topo knockout, che sono vitali o fertili, con solo piccoli difetti, nonostante una perdita completa della funzione TRPV4. Una parte di queste polemiche ha origine metodologica. I laboratori usano metodi diversi, o varianti di un metodo, e utilizzano diversi standard di giudizio. Più comunemente, TRPV4 viene transitoriamente espresso in cellule di mammifero in coltura (HEK, CHO, HeLa) e l&#39;ascesa di interno [Ca 2 +] sulla agonista o stimolazione ipotonico è registrato con il colorante fluorescente + sensibile Ca 2, Fura-2. L&#39;eccessivo affidamento su questo test fluorimetrico è stato criticato 1. Il livello di espressione in differenti popolazioni, la distribuzione in esso, nonché la concentrazione di colorante efficace, deve essere controllato e documentato. Più attendibile è esami elettrofisiologici diretti. Anche questo, come commonly praticato, inoltre, non è senza problemi. Poiché i livelli di espressione in cellule coltivate individuali sono difficili da controllare, correnti di cellule intere hanno grandi variazioni. Inoltre, perché le correnti sono piccole, statistiche affidabili dovranno fare affidamento su campioni di grandi dimensioni, spesso non è pratico. Raramente sono stati effettuati gli esami di patch-clamp. Alcune di queste registrazioni mostrano gruppi di scoppi di attività che rendono la valutazione statistica impegnativo 16,17. Per capire meglio il mechanosensitivity molecolare, abbiamo sviluppato due sistemi aggiuntivi per esaminare TRPV4. (1) Per isolare TRPV4 lontano dai suoi abituali partner di mammiferi, abbiamo espresso ratto TRPV4 in erba lievito 24. Espressione funzionale di TRPV4 in questo contesto evolutivamente distante ha dimostrato che potrebbe ancora rispondere alla forza osmotica senza i suoi abituali partner. Perché il lievito non rilascia acidi grassi polinsaturi come AA o EET, e il suo genoma non ha PLA2 o epoxygenase geni, questa espresSsion dimostra anche che non sono necessari per TRPV4 di percepire la forza. Avere TRPV4 in eucarioti biologicamente più suscettibili molecolari permette anche manipolazioni efficiente avanti o indietro genetici 25. (2) Per le analisi biofisiche di TRPV4 in profondità, abbiamo espresso TRPV4 in ovociti di Xenopus. A differenza delle cellule coltivate, che producono sub-nA a nA (10 -10 a 10 -9 A) correnti, un ovocita esprime correnti μA di (10 -6 a 10 -4 A). Molto più grande segnale su rumore consente una migliore quantificazione e comparazione più sicuri. TRPV4, così espresso, può anche essere esaminata come singole molecole utilizzando una patch clamp. Un singolo ovocita permette il campionamento di patch ripetuto, ancora una volta rendendo quantificazione più attendibile. Tali studi hanno dimostrato che canale TRPV4 stessa può essere attivata direttamente con la forza membrana tratto 14. Le analisi hanno inoltre dimostrato che 14 rappresentative alleli scheletrico-displasia sono tutte le mutazioni guadagno-di-funzione. Inoltre, il Degree di questa costitutiva Ca 2 + perdite parallelo alla gravità delle malattie scheletriche 23. A causa della loro novità e l&#39;utilità, le modalità dettagliate di questi due metodi sono riuniti qui per consentire repliche in futuro la ricerca sulle TRPV4 o canali simili.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td style="width:93px;">Wescor</td>
			<td style="width:119px;">Wescor 5500</td>
			<td style="width:167px;">Logan, UT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sirius Single Tube Luminometer </td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berhold</td>
			<td style="width:119px;">Sirius </td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microplate luminometer</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold </td>
			<td style="width:119px;">Mithras LB940</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luminometry software</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold</td>
			<td style="width:119px;">MikroWin2000</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">Patch clamp and software</td>
			<td style="width:93px;">Axon Instrument</td>
			<td style="width:119px;">HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software </td>
			<td>Union City, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">manometer</td>
			<td style="width:93px;">Bio-Tec</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Winooski, VT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipet puller</td>
			<td style="width:93px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:119px;">Model P-97</td>
			<td>Novata, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:93px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanoinject II</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material:</td>
			<td style="width:93px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">luciferin coelenterazine</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Carlsbad, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T7 RNA polymerase reaction</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">mMessage mMachine</td>
			<td>Austin, TX, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ruthenium red </td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">micropipets </td>
			<td style="width:93px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;">100 microliter micropipets</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-fidelity PfuUtra polymerase </td>
			<td style="width:93px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>La Jolla, CA, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4

TRPV4 (Transient Receptor Potenziali, famiglia vanilloid, tipo 4) è ampiamente espressa nei tessuti vertebrati ed è attivato da diversi stimoli, tra cui da forze meccaniche. Alcune mutazioni TRPV4 causano complesso osso ereditaria o patologie neuronali umano. Wild-type o mutante TRPV4 transgeni sono comunemente espresse in cellule di mammifero in coltura ed esaminati dalla Fura-2 fluorometria e da elettrodi. In termini di meccanismo mechanosensitivity e le basi molecolari delle malattie, la letteratura attuale è confusa e controversa. Per completare metodi esistenti, si descrivono due metodi aggiuntivi per esaminare le proprietà molecolari di TRPV4. (1) Rat TRPV4 e un transgene aequorina si trasformano in lievito in erba. Uno shock ipo-osmtic della popolazione trasformante produce un segnale luminometrici causa della combinazione di equorina con Ca 2 +, rilasciato attraverso il canale TRPV4. Qui TRPV4 è isolato dai suoi abituali partner di proteine ​​di mammiferie rivela la propria mechanosensitivity. (2) cRNA di TRPV4 viene iniettato in oociti di Xenopus. Dopo un adeguato periodo di incubazione, la corrente TRPV4 macroscopico viene esaminato con un morsetto di tensione a due elettrodi. L&#39;attuale aumento dopo la rimozione di osmoticum inerti dal bagno ovocita è indicativo di mechanosensitivity. I microampere (10 -6 a 10 -4 A) correnti da ovociti sono molto più grandi rispetto alle subnano-to nA (10 -10 a 10 -9 A) correnti da cellule in coltura, producendo quantificazioni più chiare e valutazioni più sicuri. Correnti microscopiche che riflettono le attività delle proteine ​​dei singoli canali possono anche essere direttamente registrati sotto una patch clamp, in on-cella o in modalità asportato. Lo stesso ovocita fornisce più campioni di patch, consentendo la replica dei dati migliori. Aspirazioni applicate le patch possono attivare TRPV4 per valutare direttamente mechanosensitivity. Tali metodi dovrebbero anche essere utile nello studio di altri tipi di canali TRP.

In un tipico esperimento luminometria, una serie di 400-1,200 mOsm shock ipotonici non si raggiunge con l&#39;aggiunta di 200 ml di soluzione d&#39;urto di diversa bassa osmolarità a 20 ml di cultura a 1.400 mOsm. L&#39;attività TRPV4 è evidente quando il RLU della disposizione sperimentale è confrontata con quella di due controlli negativi: cellule di lievito trasformate con il plasmide p416GPDV4 vuoto o uno che contiene il gene TRPV4 con una mutazione nel filtro di ioni (Figura 1) 24...

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Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

Per completare i metodi comunemente usati per studiare TRPV4 di, sono descritti due metodi: la sua mechanosensitivity può essere studiato da Ca 2 + luminometria-aequorina in lievito transgenico upon sfida ipo-osmotico. Può pure esaminato TRPV4-RNA oociti di Xenopus iniettati da cellula intera clamp a due elettrodi tensione o Patch Clamp on-cella o modalità asportato.

Lievito luminometrici e<em&gt; Xenopus</em&gt; ovocita elettrofisiologiche Esami del mechanosensitivity molecolare del TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

Research

JoVE Journal

Biology

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

Una tecnica rapida per la visualizzazione di Live cellule di lievito immobilizzato

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

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Biologia

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