Name: yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Andrea Kremsreiter for utmerket teknisk assistanse. Arbeid i vårt laboratorium er støttet av NIH GM096088 og Vilas stoler ved University of Wisconsin - Madison.

En. Gjær Luminometry Metoder Bruk belastning BYYT av Saccharomyces cerevisiae. Det er en yvc1-tok1-derivat av BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transform celler med Leu-valgbar aequorin-uttrykke plasmid pEVP1/Aeq og ura-valgbar rotte-TRPV4-uttrykke plasmid p416GPDV4, som beskrevet i Batiza et al. 26 og Loukin et al. 24 Bruk standard metoder for plasmid konstruksjon o...

<ol>
	<li>Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+TRP+channels.">An introduction to TRP channels.</a> Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).</li><li>Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+family+of+ion+channels.">The transient receptor potential family of ion channels.</a> Genome Biol. 12, 218 (2011).</li><li>Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vallinoid+transient+receptor+potential+channel+Trpv4:+From+structure+to+disease.">The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).</li><li>Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+puzzle+of+TRPV4+channelopathies.">The puzzle of TRPV4 channelopathies.</a> EMBO Rep.. , (2013).</li><li>Liedtke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanilloid+receptor-related+osmotically+activated+channel+(VR-OAC),+a+candidate+vertebrate+osmoreceptor.">Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor.</a> Cell. 103, 525-535 (2000).</li><li>Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OTRPC4,+a+nonselective+cation+channel+that+confers+sensitivity+to+extracellular+osmolarity.">OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity.</a> Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).</li><li>Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trp12,+a+novel+Trp+related+protein+from+kidney.">Trp12, a novel Trp related protein from kidney.</a> FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).</li><li>Delany, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+human+vanilloid+receptor-like+protein,+VRL-2.">Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2.</a> Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).</li><li>Rock, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+in+TRPV4+cause+autosomal+dominant+brachyolmia.">Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia.</a> Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).</li><li>Krakow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+gene+encoding+the+calcium-permeable+ion+channel+TRPV4+produce+spondylometaphyseal+dysplasia,+Kozlowski+type+and+metatropic+dysplasia.">Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia.</a> Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).</li><li>Camacho, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+TRPV4+mutations+in+nonlethal+and+lethal+metatropic+dysplasia.">Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia.</a> Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).</li><li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+permeation+through+the+cation+channel+TRPV4.">Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+TRPV4+gating+by+intra-+and+extracellular+Ca2.">Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2.</a> Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+brachyolmia-causing+mutant+TRPV4+channels+respond+directly+to+stretch+force.">Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force.</a> J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).</li><li>Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-modulated+diversity+of+TRPV4+channel+gating:+activation+by+physical+stresses+and+phorbol+ester+derivatives+through+protein+kinase+C-dependent+and+-independent+pathways.">Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways.</a> J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+and+arachidonic+acid+use+epoxyeicosatrienoic+acids+to+activate+TRPV4+channels.">Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels.</a> Nature. 424, 434-438 (2003).</li><li>Vriens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+swelling,+heat,+and+chemical+agonists+use+distinct+pathways+for+the+activation+of+the+cation+channel+TRPV4.">Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).</li><li>Vincent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+TRPV4+modulators.">Identification and characterization of novel TRPV4 modulators.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).</li><li>Willette, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+activation+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid+subtype+4+channel+causes+endothelial+failure+and+circulatory+collapse:+Part+2.">Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).</li><li>Thorneloe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orally+active+TRPV4+channel+blocker+prevents+and+resolves+pulmonary+edema+induced+by+heart+failure.">An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+dysplasia+caused+by+a+constitutive+activated+transient+receptor+potential+vanilloid+4+(TRPV4)+cation+channel+mutation.">Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation.</a> Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).</li><li>Lamande, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TRPV4+cause+an+inherited+arthropathy+of+hands+and+feet.">Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet.</a> Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Basal+Activity+Is+a+Key+Determinant+in+the+Severity+of+Human+Skeletal+Dysplasia+Caused+by+TRPV4+Mutations.">Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypotonic+shocks+activate+rat+TRPV4+in+yeast+in+the+absence+of+polyunsaturated+fatty+acids.">Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids.</a> FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+reveals+multiple+gating+mechanisms+of+TRPV4.">Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).</li><li>Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+respond+to+hypotonic+shock+with+a+calcium+pulse.">Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse.</a> J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmoprotective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell+wall-compromised+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Denis, V., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+Ca(2+)+release+in+yeast+is+triggered+by+hypertonic+shock+and+mediated+by+a+TRP+channel+homologue.">Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue.</a> J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).</li><li>Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+perturbations+sensitize+osmotic+down-shock+activated+Ca2++influx,+a+yeast+&amp;#34;deletome&amp;#34;+analysis.">Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast &amp;#34;deletome&amp;#34; analysis.</a> FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).</li><li>Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmo-protective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell-wall-compromized+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 294, (1999).</li><li>Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).</li><li>Loukin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+a+region+important+for+gating+of+the+yeast+K++channel+Ykc1.">Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1.</a> EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC1+forms+the+stretch-activated+cation+channel+in+vertebrate+cells.">TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells.</a> Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).</li></ol>

Som nevnt i innledningen, metodene som vanligvis brukes til å studere TRPV4 funksjoner noen ganger ført til uoverensstemmelser og kontroverser. De to settene med metodene som beskrives her har noen fordeler, og kan utfylle eksisterende metoder. Mens vi beskrive bare de studier på TRPV4, kan metodene bli utvidet for å studere andre ionekanaler også. En. Gjær Luminometry Metoder Spirende gjær har en innfødt Ca 2 +-tilstrømningen respons på hypo-o...

Trps (transient receptor potensialer) omfatter syv underfamilier av sjonskanaler som tjener sensoriske funksjoner 1,2. I pattedyr, TRPV, den vanilloid underfamilie av trps, har seks varianter. TRPV4 (type 4) 3,4 reagerer på varme, visse kjemikalier, osmotisk hevelse, eller skjærspenning. Den TRPV4 genet ble gjentatte ganger isolert av kandidat-gen og / eller uttrykk kloning 5-8. Den sistnevnte metode fulgt genproduktet respons på hypo-osmolaritet. TRPV4 er uttrykt i nesten alle organer og funksjoner i utvikling, fysiologi, eller patologi av mange ulike celletyper 3,4. Slående er&gt; 50 menneske autosomal dominant TRPV4 mutasjoner, forårsaker perifere nevropatier og / eller skjelett dysplasier (unormalt i utviklingen av skjelettet) 9-11. Skjelett dysplasiene variere fra mild brachyomia type 3 (type-tre dverger), spondylometaphyseal dysplasi Kozlowski type, til Severe dysplasier, noen forårsaker neonatal eller embryonale død. Selv om alle oppførsel av mekanismene synes mulig, forklarer ingen av mangfold, kompleksitet, variasjon, og sporadiske overlappinger av disse sykdommene fire. Som andre TRP kanaler 1, er TRPV4 en tetramer. I rotte-eller human TRPV4 blir hver underenhet besto av 871 rester. Den sentrale element er seks transmembrane en helikser (S1-S6), som sannsynligvis anordnet på en måte lik den spenningsstyrte K +-kanaler. Der S1 til S4 danne en perifer domenet og S5 og S6 danne gjennomtrengelighet pore domenet. Mellom S5 og S6 i TRPV4 er en kort pore helix, etterfulgt av sekvensen LDLFKLTIGMGDL, fire av hvilke formodentlig konvergerer for å danne kation-filter. Den 470-residuum N-terminalt cytoplasmatisk segment inneholder 6 Ankyrin gjentas, kjent for å binde proteiner eller små ligander. Den C-terminale 152-resten cytoplasmisk segmentet omfatter en kalmodulin-bindende sekvens blant andre mulige områder som binder othennes elementer tre. TRPV4 er et kation kanal som i hovedsak utelukker anioner en. Mens dets fysiologiske funksjon er å transduce stimuli til Ca 2 + innstrømning, er det også gjennomtrengelig for andre kationer med en Eisenman IV permeabilitet sekvens, favoriserer divalent ved et P Ca: P Na ~ 7 12. Single-kanals konduktans utbedrer på ~ 90 pS utover og ~ 40 pS innover 6,13,14. , Heterologt uttrykt strøm (nedenfor) kan aktiveres ved hypo-osmotiske hevelse, skjærspenning, eller varme 15.. Det blir også aktivert av flerumettede fettsyrer 16,17 og det syntetiske phorbal ester 4αPDD 18.. I dag er den mest potente agonist GSK1016790A 19 og antagonist er GSK2193874, effektiv i 10 -9 til 10 -8 M 20, begge oppdaget av høy gjennomstrømning, små-molekylære skjermen. To sentrale områder av TRPV4 forskning forbli forvirrende: (1) Selv som TRPV4 er i stor grad undersøkt for sin mechanosensitivity, er den molekylære basis kontroversielt. En modell beskriver hypo-osmolaritet eller annen måte aktiverer fosfolipase A2 (PLA2) for å frembringe den polyumettede fettsyren (PUFA) arakidonsyre (AA), som omdannes til epoxyeicosatrienoic syre (EET) av en epoxygenase, og bindingen av EET aktiverer TRPV4 16, 17. Likevel TRPV4 i seg selv har vist seg å reagere direkte for å strekke membranen 14 (nedenfor), som gir en enklere forklaring. (2) De TRPV4 mutant patologi er forvirrende. På fundamentet, må man vite hvorvidt sykdommer er på grunn av tap, reduksjon eller økning av kanal aktiviteter. Selv her, er litteraturen langt fra klart. Mens flere skjelett-dysplasi alleler ble rapportert å ha høyere aktivitet, (gain-of-funksjon, GOF) 4,21, flere ble rapportert å ha redusert aktivitet (tap-av-funksjon, LOF) 10,22. En systematisk undersøkelse av 14 alleler fant dem tilalle bli GOF mutasjoner (nedenfor) 23. Påstanden om at noen er Lofs synes å motsi fenotype av trpV4-/ - knockout mus, som er levedyktig eller fruktbare, med bare mindre feil, til tross for et fullstendig tap av TRPV4 funksjon. En del av disse kontroversene har metodisk opprinnelse. Laboratorier bruker ulike metoder, eller varianter av én metode, og bruke forskjellige dommer standarder. Mest vanlig er TRPV4 forbigående uttrykt i dyrkede pattedyrceller (HEK, CHO, HeLa) og fremveksten av interne [Ca 2 +] på agonist eller hypoton stimulering er registrert med Ca 2 +-sensitive fluorescerende fargestoff, Fura-2. Den over-avhengighet av denne fluorometrisk analysen har blitt kritisert en. Uttrykket nivå i forskjellige populasjoner, fordeling i denne, så vel som den effektive fargestoff konsentrasjon, må kontrolleres og dokumentert. Mer pålitelig er den direkte elektrofysiologiske undersøkelser. Selv dette, som commonly praktiseres, er heller ikke uten problemer. På grunn av at ekspresjonsnivåene i individuelle dyrkede celler er vanskelig å kontrollere, hel-celle-strømmer har store variasjoner. Videre, fordi strømmen er liten, vil pålitelig statistikk nødt til å stole på store utvalgsstørrelser, ofte ikke praktisk. Patch-clamp undersøkelser har sjelden blitt utført. Noen slike opptak viser klynger av aktivitets bursts som gjør statistisk evaluering utfordrende 16,17. For bedre å forstå den molekylære mechanosensitivity, har vi utviklet ytterligere to systemer for å undersøke TRPV4. (1) For å isolere TRPV4 bort fra sin vanlige pattedyr partnere, har vi uttrykt rotte TRPV4 i spirende gjær 24. Funksjonell uttrykk for TRPV4 i dette evolusjonært fjernt sammenheng viste at det fortsatt kunne svare på saltkraft uten sine vanlige partnere. Fordi gjær gir ingen flerumettede fettsyrer som AA eller EET, og dens genom har ingen PLA2 eller epoxygenase gener, dette EXPREssion viser også at de ikke er pålagt for TRPV4 å oppfatte kraft. Å ha TRPV4 i de molekylære biologisk mest mottagelig eukaryoter kan også effektiv fremtids eller reverse-genetiske manipulasjoner 25. (2) For dybde biofysiske analyser av TRPV4, uttrykte vi TRPV4 i Xenopus oocytter. I motsetning dyrkede celler, som gir sub-nA til Na (10 -10 til 10 -9 A) strømninger, uttrykker en eggcelle strømninger i μA-tallet (10 -6 til 10 -4 A). Mye større signal over støy gir bedre kvantifisering og mer trygg sammenligning. TRPV4, så uttrykt, kan også bli undersøkt som individuelle molekyler ved hjelp av en patch clamp. En enkelt eggcelle tillater gjentatt patch prøvetaking, igjen gjør kvantifisering mer pålitelig. Slike studier har vist at TRPV4 kanalen i seg selv direkte kan aktiveres ved membran strekk kraft 14.. Analyser viste også at 14 representative skjelett-dysplasi alleler er alle gain-of-funksjon mutasjoner. Videre dgree av dette konstituerende Ca 2 + lekkasje paralleller alvorlighetsgraden av skjelettsykdommer 23. På grunn av sin nyhet og nytte, er de detaljerte prosedyrer for disse to metodene samlet her for å tillate gjennomkjøringer i fremtidig forskning på TRPV4 eller lignende kanaler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td style="width:93px;">Wescor</td>
			<td style="width:119px;">Wescor 5500</td>
			<td style="width:167px;">Logan, UT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sirius Single Tube Luminometer </td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berhold</td>
			<td style="width:119px;">Sirius </td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microplate luminometer</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold </td>
			<td style="width:119px;">Mithras LB940</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luminometry software</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold</td>
			<td style="width:119px;">MikroWin2000</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">Patch clamp and software</td>
			<td style="width:93px;">Axon Instrument</td>
			<td style="width:119px;">HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software </td>
			<td>Union City, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">manometer</td>
			<td style="width:93px;">Bio-Tec</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Winooski, VT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipet puller</td>
			<td style="width:93px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:119px;">Model P-97</td>
			<td>Novata, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:93px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanoinject II</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material:</td>
			<td style="width:93px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">luciferin coelenterazine</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Carlsbad, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T7 RNA polymerase reaction</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">mMessage mMachine</td>
			<td>Austin, TX, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ruthenium red </td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">micropipets </td>
			<td style="width:93px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;">100 microliter micropipets</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-fidelity PfuUtra polymerase </td>
			<td style="width:93px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>La Jolla, CA, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4

TRPV4 (Transient Receptor potensialer, vanilloid familie, type 4) er mye uttrykt i virveldyr vev og aktiveres av flere stimuli, inkludert ved mekaniske krefter. Visse TRPV4 mutasjoner føre komplekse arvelig bein eller nevronale patologier i menneskelig. Vill-type eller mutert TRPV4 transgener er vanligvis uttrykt i dyrkede pattedyrceller og undersøkt av Fura-2 fluorometri, og ved elektroder. I form av mekanismen av mechanosensitivity og de molekylære baser av sykdommer, er dagens litteratur forvirrende og kontroversielt. For å komplettere eksisterende metoder, beskriver vi ytterligere to metoder for å undersøke de molekylære egenskaper TRPV4. (1) Rat TRPV4 og en aequorin transgenet blir forvandlet til spirende gjær. En hypo-osmtic sjokk av transform befolkningen gir en luminometric signal på grunn av kombinasjonen av aequorin med Ca 2 +, sluppet gjennom TRPV4 kanal. Her TRPV4 er isolert fra sin vanlige pattedyrpartnerproteinerog avslører sin egen mechanosensitivity. (2) cRNA av TRPV4 injiseres i Xenopus oocytter. Etter en egnet inkubasjonsperiode blir den makroskopiske TRPV4 strøm undersøkt med en to-elektrodespenningsklemme. Den nåværende økningen ved fjerning av inert osmoticum fra eggcelle bad er et tegn på mechanosensitivity. De microampere (10 -6 til 10 -4 A) strømmer fra ubefruktede egg er mye større enn de subnano-til nanoAmpere (10 -10 til 10 -9 A) strømmer fra dyrkede celler, noe som gir klarere kvantifisering og mer trygg vurderinger. Mikroskopiske strømmer reflekterer aktivitetene til individuelle kanalproteiner kan også bli direkte registrert under en patch clamp, i on-celle eller fjernet modus. Det samme eggcelle gir flere patch prøver, slik at bedre data replikering. Innsugingsdeler brukes på patcher kan aktivere TRPV4 å vurdere mechanosensitivity direkte. Disse metoder skal også være anvendbare i studiet av andre typer av TRP-kanaler.

I et typisk eksperiment luminometry, er et område på 400-1,200 mOsm hypotoniske ned støt oppnås ved å tilsette 200 ul av støt løsninger av forskjellige lav osmolaritet til 20 pl av kulturen ved 1 400 mOsM. Den TRPV4 aktivitet er tydelig når RLU av den eksperimentelle blir sammenlignet med to negative kontroller: gjærcelle transformert med tom p416GPDV4 plasmid eller en som inneholder TRPV4 genet med en mutasjon ved ione filteret (figur 1) 24. I e...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 at JoVE.com

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

For å komplettere brukte metodene for å studere TRPV4 tallet, er to metoder beskrevet: Its mechanosensitivity kan studeres av Ca 2 +-aequorin luminometry i transgen gjær ved hypo-osmotisk utfordring. Det kan også undersøkes i TRPV4-RNA injisert Xenopus oocytter ved hel-celle-to-elektrodespenningsklemme eller lapp klemmes fast i on-celle eller skåret ut-modus.

Gjær Luminometric og<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytten Elektro Undersøkelser av Molecular Mechanosensitivity av TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

Research

JoVE Journal

Biology

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiske Rensing av Highly Active gjær ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

Den<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter Cut-open vaselin Gap Voltage-klemme teknikk med fluorometri

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Surface Sprer og Farging av gjær Kromosomer

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...