Name: yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 at JoVE.com

Vi vill tacka Andrea Kremsreiter för utmärkt tekniskt stöd. Arbetet i vårt laboratorium stöds av NIH GM096088 och Vilas förtroende för University of Wisconsin - Madison.

1. Jäst luminometri Metoder Använd stam BYYT av Saccharomyces cerevisiae. Det är en yvc1-tok1-derivat av BY4741 (MATa, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Trans celler med leu-valbara aequorin-uttryckande plasmid pEVP1/Aeq och ura-valbara råtta-TRPV4-uttryckande plasmid p416GPDV4, enligt beskrivningen i Batiza et al. 26 och Loukin et al. 24 Använd standardmetoder för plasmid ko...

<ol>
	<li>Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+TRP+channels.">An introduction to TRP channels.</a> Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).</li><li>Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+family+of+ion+channels.">The transient receptor potential family of ion channels.</a> Genome Biol. 12, 218 (2011).</li><li>Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vallinoid+transient+receptor+potential+channel+Trpv4:+From+structure+to+disease.">The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).</li><li>Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+puzzle+of+TRPV4+channelopathies.">The puzzle of TRPV4 channelopathies.</a> EMBO Rep.. , (2013).</li><li>Liedtke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanilloid+receptor-related+osmotically+activated+channel+(VR-OAC),+a+candidate+vertebrate+osmoreceptor.">Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor.</a> Cell. 103, 525-535 (2000).</li><li>Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OTRPC4,+a+nonselective+cation+channel+that+confers+sensitivity+to+extracellular+osmolarity.">OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity.</a> Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).</li><li>Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trp12,+a+novel+Trp+related+protein+from+kidney.">Trp12, a novel Trp related protein from kidney.</a> FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).</li><li>Delany, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+human+vanilloid+receptor-like+protein,+VRL-2.">Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2.</a> Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).</li><li>Rock, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+in+TRPV4+cause+autosomal+dominant+brachyolmia.">Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia.</a> Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).</li><li>Krakow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+gene+encoding+the+calcium-permeable+ion+channel+TRPV4+produce+spondylometaphyseal+dysplasia,+Kozlowski+type+and+metatropic+dysplasia.">Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia.</a> Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).</li><li>Camacho, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+TRPV4+mutations+in+nonlethal+and+lethal+metatropic+dysplasia.">Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia.</a> Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).</li><li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+permeation+through+the+cation+channel+TRPV4.">Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+TRPV4+gating+by+intra-+and+extracellular+Ca2.">Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2.</a> Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+brachyolmia-causing+mutant+TRPV4+channels+respond+directly+to+stretch+force.">Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force.</a> J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).</li><li>Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-modulated+diversity+of+TRPV4+channel+gating:+activation+by+physical+stresses+and+phorbol+ester+derivatives+through+protein+kinase+C-dependent+and+-independent+pathways.">Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways.</a> J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+and+arachidonic+acid+use+epoxyeicosatrienoic+acids+to+activate+TRPV4+channels.">Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels.</a> Nature. 424, 434-438 (2003).</li><li>Vriens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+swelling,+heat,+and+chemical+agonists+use+distinct+pathways+for+the+activation+of+the+cation+channel+TRPV4.">Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).</li><li>Vincent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+TRPV4+modulators.">Identification and characterization of novel TRPV4 modulators.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).</li><li>Willette, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+activation+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid+subtype+4+channel+causes+endothelial+failure+and+circulatory+collapse:+Part+2.">Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).</li><li>Thorneloe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orally+active+TRPV4+channel+blocker+prevents+and+resolves+pulmonary+edema+induced+by+heart+failure.">An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+dysplasia+caused+by+a+constitutive+activated+transient+receptor+potential+vanilloid+4+(TRPV4)+cation+channel+mutation.">Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation.</a> Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).</li><li>Lamande, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TRPV4+cause+an+inherited+arthropathy+of+hands+and+feet.">Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet.</a> Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Basal+Activity+Is+a+Key+Determinant+in+the+Severity+of+Human+Skeletal+Dysplasia+Caused+by+TRPV4+Mutations.">Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypotonic+shocks+activate+rat+TRPV4+in+yeast+in+the+absence+of+polyunsaturated+fatty+acids.">Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids.</a> FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+reveals+multiple+gating+mechanisms+of+TRPV4.">Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).</li><li>Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+respond+to+hypotonic+shock+with+a+calcium+pulse.">Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse.</a> J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmoprotective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell+wall-compromised+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Denis, V., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+Ca(2+)+release+in+yeast+is+triggered+by+hypertonic+shock+and+mediated+by+a+TRP+channel+homologue.">Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue.</a> J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).</li><li>Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+perturbations+sensitize+osmotic+down-shock+activated+Ca2++influx,+a+yeast+&amp;#34;deletome&amp;#34;+analysis.">Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast &amp;#34;deletome&amp;#34; analysis.</a> FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).</li><li>Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmo-protective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell-wall-compromized+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 294, (1999).</li><li>Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).</li><li>Loukin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+a+region+important+for+gating+of+the+yeast+K++channel+Ykc1.">Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1.</a> EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC1+forms+the+stretch-activated+cation+channel+in+vertebrate+cells.">TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells.</a> Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).</li></ol>

Som nämnts i inledningen, de metoder som vanligen används för att studera TRPV4 fungerar ibland lett till inkonsekvenser och kontroverser. De två uppsättningarna av metoder som beskrivs här erbjuder några fördelar och kan komplettera de befintliga metoderna. Medan vi beskriva endast de studier TRPV4 kan metoderna utökas för att studera andra jonkanaler samt. 1. Jäst luminometri Metoder Knoppande jäst har en nativ Ca2 +-inflöde svar på hypo-...

TRP (transient receptor potentialer) bestå av sju underfamiljer av katjonkanaler som tjänar sinnesfunktioner 1,2. I däggdjur TRPV, den vanilloid underfamilj av TRP, har sex sorter. TRPV4 (typ 4) 3,4 reagerar för värme, vissa kemikalier, osmotisk svullnad eller skjuvspänning. Den TRPV4 genen upprepade isoleras genom kandidat-gen och / eller uttryck kloning 5-8. Den senare metoden följde genprodukten svar på hypo-osmolaritet. TRPV4 uttrycks i nästan alla organ och funktioner i utvecklingen, fysiologi eller patologi av många olikartade celltyper 3,4. Särskilt slående är de&gt; 50 mänsklig autosomala dominanta TRPV4 mutationer, vilket orsakar perifera neuropatier och / eller skelettdysplasier (avvikelser i skelettet) 9-11. De skelettdysplasier variera från milda brachyomia typ 3 (typ-3 dvärgväxt), spondylometaphyseal dysplasi Kozlowski typ, för att Severe dysplasias, några orsakar neonatal eller embryonal död. Även om alla former av mekanismer verkar vara möjligt, förklarar ingen mångfald, komplexitet, föränderlighet, och enstaka överlappningar av dessa sjukdomar 4. Liksom andra TRP-kanaler 1, är TRPV4 en tetramer. I råtta eller människa TRPV4 är varje subenhet består av 871 rester. Dess centrala del är det sex trans en helixar (S1-S6), vilket sannolikt är arrangerade på ett sätt som liknar spänningskänsliga K +-kanaler. Där, S1 till S4 bildar en perifer domän och S5 och S6 bildar trängning por domänen. Mellan S5 och S6 i TRPV4 är en kort por helix följd av sekvensen LDLFKLTIGMGDL, fyra av vilka förmodligen konvergerar för att bilda katjonen filtret. Den 470-rester N-terminal cytoplasmatisk segment innehåller 6 ankyrin upprepningar, kända för att binda proteiner eller små ligander. Den C-terminala 152-rester cytoplasmatisk segment inkluderar en kalmodulinbindande sekvens bland andra möjliga platser som binder othennes element 3. TRPV4 är en katjon-kanal som väsentligen exkluderar anjoner 1. Även om dess fysiologiska funktion är att omvandla stimuli till Ca2 + inflöde, är det också genomsläpplig för andra katjoner med en Eisenman IV permeabilitet sekvens, gynnar tvåvärda på en P Ca: P Na ~ 7 12. Single-kanal konduktans rättar till ~ 90 pS utåt och ~ 40 pS inåt 6,13,14. Heterologt uttryckt Ström (nedan) kan aktiveras av hypo-osmotiska svullnad, skjuvspänning, eller värme 15. Det är också aktiveras av fleromättade fettsyror 16,17 och den syntetiska phorbal ester 4αPDD 18. För närvarande är den mest potenta agonisten GSK1016790A 19 och antagonisten är GSK2193874, effektiv i 10 -9 till 10 -8 M 20, båda upptäcktes av hög genomströmning, små-molekyl skärmen. Två viktiga områden för TRPV4 forskning förblir förvirrande: (1) Även som TRPV4 i stor utsträckning studerats för sin mechanosensitivity, är dess molekylära grunden kontroversiell. En modell beskriver hypo-osmolaritet på något sätt aktiverar fosfolipas A2 (PLA2) för att producera fleromättad fettsyra (PUFA) arakidonsyra (AA), som omvandlas till epoxyeicosatrienoic syra (EET) av en epoxygenase, och bindningen av EET aktiverar TRPV4 16, 17. Ändå TRPV4 själv har visat att direkt svara på membran sträcka 14 (nedan), vilket ger en enklare förklaring. (2) De TRPV4 muterade patologier är förbryllande. I grunden måste man veta om de sjukdomar som beror på förlust, minskning eller ökning av kanalverksamhet. Även här är litteraturen långt ifrån klart. Medan flera skelett-dysplasi alleler rapporterades ha högre aktiviteter, (gain-of-function, GOF) 4,21, flera rapporterades ha minskat aktiviteter (förlust-av-funktion, LOF) 10,22. En systematisk studie av 14 alleler fann demalla vara GOF mutationer (nedan) 23. Påståendet att vissa är LOF&#39;er tycks motsäga fenotypen av trpV4-/ - knockout-mus, som är livskraftiga och fertila, med endast mindre defekter, trots en total förlust av TRPV4 funktion. En del av dessa kontroverser har metodologiska ursprung. Laboratorier använder olika metoder, eller varianter av en metod, och använder olika bedömningsstandarder. Vanligast är TRPV4 transient uttrycks i odlade däggdjursceller (HEK, CHO, HeLa) och uppkomsten av interna [Ca2 +] vid agonist eller hypoton stimulering registreras med Ca2 +-känsliga fluorescerande färg, Fura-2. Den övertro på denna fluorometriska analysen har kritiserats 1. Expressionsnivån i olika populationer, fördelningen däri, såväl som den effektiva färgämneskoncentrationen, måste kontrolleras och dokumenteras. Mer tillförlitliga är de direkta elektrofysiologiska undersökningar. Trots detta, eftersom commonly praktiseras, är inte heller utan problem. Eftersom expressionsnivåerna i enskilda odlade celler är svåra att kontrollera, helcells-strömmar har stora variationer. Vidare, eftersom strömmarna är små, kommer tillförlitlig statistik måste förlita sig på stora provstorlekar, ofta inte praktiskt. Patch-clamp undersökningar har sällan utförts. Några sådana inspelningar visar kluster av aktivitets skurar som gör statistisk utvärdering utmanande 16,17. För att bättre förstå den molekylära mechanosensitivity, har vi utvecklat ytterligare två system för att undersöka TRPV4. (1) För att isolera TRPV4 bort från sina däggdjurs partner vanliga, har vi uttryckt råtta TRPV4 i spirande jäst 24. Funktionell uttryck för TRPV4 i detta evolutionärt avlägsna sammanhang visade att det fortfarande kan svara på osmotisk kraft utan sin vanliga partner. Eftersom jäst ger inga PUFA såsom AA eller EET, och dess arvsmassa har inga PLA2 eller epoxygenase gener, detta expression visar också att de inte behövs för TRPV4 att avkänna kraften. Att ha TRPV4 i de molekylära biologiskt mest mottagliga eukaryoter också möjliggör en effektiv framåt eller bakåt-genetiska manipulationer 25. (2) För djupgående biofysikaliska analyser av TRPV4 uttryckte vi TRPV4 i Xenopus oocyter. Till skillnad från odlade celler, som ger under nA till nA (10 -10 till 10 -9 A) strömmar, uttrycker en äggcell strömmar i iA: s (10 -6 10 -4 A). Mycket större signal över buller ger bättre kvantifiering och mer självsäker jämförelse. TRPV4, så uttrycks, kan också undersökas som enskilda molekyler med hjälp av en patch clamp. En enda äggcell tillåter upprepad patch provtagning, återigen gör kvantifiering mer tillförlitlig. Dessa studier visade att TRPV4 kanalen själv direkt kan aktiveras genom membranet sträckkraft 14. Analyser visade också att 14 representativa skelett-dysplasi alleler är alla gain-of-function mutationer. Vidare degree av denna konstitutiva Ca2 + läckage paralleller svårighetsgraden av skelettsjukdomar 23. På grund av deras nyhet och användbarhet, är de detaljerade förfaranden för dessa två metoder samlats här för att möjliggöra replikationer i framtida forskning på TRPV4 eller liknande kanaler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td style="width:93px;">Wescor</td>
			<td style="width:119px;">Wescor 5500</td>
			<td style="width:167px;">Logan, UT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sirius Single Tube Luminometer </td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berhold</td>
			<td style="width:119px;">Sirius </td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microplate luminometer</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold </td>
			<td style="width:119px;">Mithras LB940</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luminometry software</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold</td>
			<td style="width:119px;">MikroWin2000</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">Patch clamp and software</td>
			<td style="width:93px;">Axon Instrument</td>
			<td style="width:119px;">HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software </td>
			<td>Union City, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">manometer</td>
			<td style="width:93px;">Bio-Tec</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Winooski, VT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipet puller</td>
			<td style="width:93px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:119px;">Model P-97</td>
			<td>Novata, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:93px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanoinject II</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material:</td>
			<td style="width:93px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">luciferin coelenterazine</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Carlsbad, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T7 RNA polymerase reaction</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">mMessage mMachine</td>
			<td>Austin, TX, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ruthenium red </td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">micropipets </td>
			<td style="width:93px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;">100 microliter micropipets</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-fidelity PfuUtra polymerase </td>
			<td style="width:93px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>La Jolla, CA, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid familj, typ 4) är allmänt uttryckt i ryggradsdjur vävnader och aktiveras av olika stimuli, bland annat genom mekaniska krafter. Vissa TRPV4 mutationer orsakar komplexa ärftliga ben eller neuronala sjukdomar i människa. Vildtyp eller mutant TRPV4 transgenerna vanligen uttrycks i odlade däggdjursceller och undersöktes med Fura-2 fluorometri och genom elektroderna. När det gäller mekanismen för mechanosensitivity och de molekylära grunderna för de sjukdomar, är den nuvarande litteraturen förvirrande och kontroversiell. För att komplettera befintliga metoder, beskriver vi två ytterligare metoder för att undersöka molekylära egenskaper TRPV4. (1) Rat TRPV4 och en aequorin transgen förvandlas till spirande jäst. En hypo-osmtic chocken av trans befolkningen ger en luminometrisk signal på grund av kombinationen av aequorin med Ca2 +, frigörs genom TRPV4 kanalen. Här TRPV4 är isolerad från sina vanliga däggdjur partnerproteineroch avslöjar sin egen mechanosensitivity. (2) cRNA av TRPV4 injiceras i Xenopus-oocyter. Efter en lämplig inkubationsperiod, är den makroskopiska TRPV4 nuvarande undersöktes med ett två-elektrodspänningsklämma. Den nuvarande ökningen vid avlägsnande av inert osmotikum från äggcellen badet indikerar mechanosensitivity. De mikroampere (10 -6 10 -4 A) strömmar från ägg är mycket större än de subnano-till nanoampere (10 -10 till 10 -9 A) strömmar från odlade celler, vilket ger tydligare kvantifieringar och mer självsäkra bedömningar. Mikroskopiska strömmar återspeglar verksamheten i enskilda kanalproteiner kan också vara direkt registrerat under en patch clamp, i den cell eller utskurna läge. Samma äggcellen ger flera patch prover så att bättre datareplikering. Sug tillämpas på plåstren kan aktivera TRPV4 att direkt bedöma mechanosensitivity. Dessa metoder skulle också vara användbara vid studiet av andra typer av TRP-kanaler.

I ett typiskt luminometri experiment, är ett område av 400-1,200 mOsM hypotona ner stötar uppnås genom att tillsätta 200 l av chocklösningar av olika låg osmolaritet till 20 l av kultur på 1.400 mOsM. Den TRPV4 aktivitet är uppenbar när RLU hos experiment jämförs med den av två negativa kontroller: jästceller transformerade med tom p416GPDV4 plasmid eller en som innehåller TRPV4 gen med en mutation vid den jon-filter (fig. 1) 24. I en typis...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 at JoVE.com

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

För att komplettera vanligaste metoderna för att studera TRPV4 s, finns två metoder beskrivs: Dess mechanosensitivity kan studeras av Ca2 +-aequorin luminometri i transgena jäst på hypoosmotisk utmaning. Det kan också undersökas i TRPV4-RNA injiceras Xenopus oocyter genom hel-cell två-elektrodspänning klämma eller patch klämma in på-cell eller utskurna läge.

Jäst luminometrisk och<em&gt; Xenopus</em&gt; oocyt Elektrofysiologiska Undersökningar av Molecular Mechanosensitivity av TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

Research

JoVE Journal

Biology

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

En snabb teknik för visualisering av Live Immobiliserade jästceller

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Registrering av jonkanaler Uttryckt i Xenopus oocyter

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualisera RNA lokalisering i Xenopus Oocyter

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mus Oocyte mikroinjektion, mognad och ploidi bedömning

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Konkurrenskraftiga Genomic skärmar av streckkodade Jäst bibliotek

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiska Rening av högaktiv Jäst Ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Den gröna monster Process för generering av jäststammar Redovisat flera Gene Strykningar

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

Den<em&gt; Xenopus</em&gt; Äggcellen Cut-öppen vaselin Gap spänning-clamp teknik med fluorometri

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Ytspridning och immunfärgning av Jäst Kromosomer

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...