Name: isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice
Uploaded: 2013-10-19T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH HL109478 (KNF). Författarna erkänner och tackar Gina Kim och Joann Taylor för deras hjälp med att isolera och bibehålla PASMC i kulturen.

Institutional Animal Care och användning kommittén vid Northwestern University godkänt detta protokoll. Ett. Lungartären Isolering från neonatala möss - Dag ett <ol><li> Förbered Komplett M199 media - Mix 400 ml M199 med 100 ml (slutlig koncentration = 20%) värmeinaktiverat FBS och 5 ml (slutlig koncentration = 1%) penicillin / streptomycin. </li><li> Förbered Serumfritt M199 Media - Mix 500 ml M199 med 5 ml (slutlig koncentration = 1%) penicillin...

<ol>
	<li>Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+the+pulmonary+vascular+bed+in+fetal+lambs.">Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs.</a> Circulation. 53, 144-151 (1976).</li><li>Walsh-Sukys, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn+in+the+era+before+nitric+oxide:+practice+variation+and+outcomes.">Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes.</a> Pediatrics. 105, 14-20 (2000).</li><li>Khemani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+hypertension+in+formerly+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia:+clinical+features+and+outcomes+in+the+surfactant+era.">Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era.</a> Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).</li><li>Jobe, A. H., Bancalari, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchopulmonary+dysplasia.">Bronchopulmonary dysplasia.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).</li><li>Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+echocardiography+for+the+diagnosis+and+management+of+pulmonary+vascular+disease+in+young+children+with+chronic+lung+disease.">Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease.</a> Pediatrics. 121, 317-325 (2008).</li><li>Check, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+growth+restriction+and+pulmonary+hypertension+in+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia.">Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia.</a> J. Perinatol. , (2013).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+increases+phosphodiesterase+5+expression+and+activity+in+ovine+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 102, 226-233 (2008).</li><li>Aschner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+nitric+oxide+synthase+gene+transfer+enhances+dilation+of+newborn+piglet+pulmonary+arteries.">Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries.</a> Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).</li><li>Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hypoxia+increases+cytosolic+calcium+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).</li><li>Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+activation+by+hypoxia+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+is+age+and+site+specific.">RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific.</a> Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).</li><li>Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibroblast+growth+factor-2+expression+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+involves+increased+reactive+oxygen+species+generation.">Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).</li><li>Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturational+shift+from+PKCzeta+and+voltage-gated+K++channels+to+RhoA/Rho+kinase+in+pulmonary+vasoconstriction.">Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction.</a> Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).</li><li>Wedgwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+regulates+extracellular+superoxide+dismutase+activity+and+expression+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension.</a> Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+increases+PDE5+activity+in+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).</li><li>Chester, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinaciguat,+a+soluble+guanylate+cyclase+activator,+augments+cGMP+after+oxidative+stress+and+causes+pulmonary+vasodilation+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).</li><li>Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+voltage+gated+potassium+channel+responses+in+a+fetal+lamb+model+of+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).</li><li>Olschewski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+K(Ca)+channel+to+membrane+potential+and+O2+sensitivity+is+decreased+in+an+ovine+PPHN+model.">Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).</li><li>Aslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+lung+injury+in+a+murine+model+of+neonatal+chronic+lung+disease.">Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).</li><li>Balasubramaniam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+angiogenic+cells+restore+lung+alveolar+and+vascular+structure+after+neonatal+hyperoxia+in+infant+mice.">Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase-4+inhibition+attenuates+pulmonary+inflammation+in+neonatal+lung+injury.">Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury.</a> Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+attenuates+pulmonary+inflammation+and+fibrin+deposition,+mortality+and+right+ventricular+hypertrophy+in+neonatal+hyperoxic+lung+injury.">Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury.</a> Respir. 10, 30 (2009).</li><li>Ladha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+improves+alveolar+growth+and+pulmonary+hypertension+in+hyperoxia-induced+lung+injury.">Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury.</a> Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+hyperoxia+increases+mitochondrial+oxidation+and+increases+phosphodiesterase+5+activity+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106, 526-535 (2010).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Generated+at+Mitochondrial+Complex+III+Triggers+Acute+Responses+to+Hypoxia+in+the+Pulmonary+Circulation.">Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).</li><li>Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+NADPH-oxidase+is+activated+in+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction.">Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+and+Inhaled+Nitric+Oxide+Normalize+Phosphodiesterase+5+Expression+and+Activity+in+Neonatal+Lambs+with+Persistent+Pulmonary+Hypertension.">Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).</li></ol>

I detta manuskript, beskriver vi för första gången isolering av PASMC från möss vid P7, P14, och P21. För att åstadkomma detta, är en uppslamning av agaros och 0,2 pM partiklar järn infunderas genom RV in i PA. På grund av den lilla storleken av järnpartiklarna, kan de inte passera genom lungans kapillärbädd och således deponeras i den lilla PA. Lungorna är uppblåsta, bort och identifieras. De järninnehållande fartyg dras ur lösningen med hjälp av en magnet. I slutändan är de fartyg stryks i ett v?...

Pulmonell hypertension är normalt under intrauterin liv sedan moderkakan verkar som en signifikant organ för gasutbyte och endast 10% av hjärtminutvolymen cirkuleras genom lungkärlen. In utero, pulmonary trycken liknar systemiska tryck på grund av förhöjd pulmonell vaskulär resistens . Som dräktigheten fortskrider, det finns snabba tillväxten av den lilla PA i lungorna, förbereda fostret för den dramatiska ökningen av pulmonell blodflöde som inträffar vid födseln 1. När den normala perinatal övergången misslyckas i kortsiktiga och fullgångna spädbarn, är resultatet persistent pulmonell hypertension hos den nyfödde (PPHN). PPHN är ett kliniskt syndrom som orsakas av många olika underliggande sjukdomar. Men alla dessa spädbarn har gemensamma patofysiologiska funktioner såsom förhöjd pulmonell vaskulär resistens, hypoxemi, och höger-till-vänster shuntning av blodflödet över långlivade foster anslutningar såsom ductus arteriosus eller föramen ovale. PPHN drabbar 2-6 per 1000 levande födda och förmedlar en 8-10% risk för mortalitet samt betydande kortsiktiga och långsiktiga morbiditet 2. Dessutom kan mycket låg födelsevikt prematurer utvecklar pulmonell hypertension som ett resultat av deras underliggande lungsjukdom. Den vanligaste bakomliggande lungsjukdom av för tidigt födda barn är bronkopulmonell dysplasi (BPD). Medan den totala risken för BPD korrelerar med gestationsålder och födelsevikt, är det fortfarande oklart varför en delmängd av dessa spädbarn utvecklar betydande pulmonell hypertension och hur man på lämpligt behandla dessa barn. Dåliga resultat, inklusive förlängda sjukhusvistelser och ökad dödlighet, är vanliga 3-6. Historiskt sett har ovin fetal PASMC eller svin fetal PASMC från friska djur som använts för att studera de signaleringsvägar involverade i det normala pulmonella vaskulära övergång efter födseln. Dessa är vanligen isolerade från femte generationens motstånd PA av enn får eller svin fostret som levereras och avlivas innan någon spontan andning 7-9. Dessutom har vissa forskare isoleras och utnyttjas PASMC från något äldre och spontanandning lamm och smågrisar vid 3 dagar, 2 veckor och 4 veckor 10-12. På senare tid har vissa grupper isoleras framgångsrikt och utnyttjade PASMC isolerad från lamm med PPHN att undersöka derangements i signalvägar i sjukdomstillståndet 13-17. Dessa celler har visat sig vara ett värdefullt verktyg för att undersöka vilka signalvägar är avgörande i både normala och sjuka kort sikt och sikt lungkärlsväggarnas muskulatur. Däremot ger de inte insikt i de signalvägar påverkas hos prematura barn med pulmonell hypertension. Inte heller tillåter möjligheterna för genetisk manipulation sett i musmodeller av sjukdomen. Råtta och mus modeller har länge använts för att modellera BPD och mer nyligen används för att modellera pulmonell hypertension uppstått genom BPD 18-22. Neonatala råttor är lockande att arbeta med på grund av sin större storlek, men de också lider av brist på möjligheter till genetisk modifiering. Genetiskt modifierade djur har i stor utsträckning använts för att undersöka effekterna av specifika genen mål på hela djuret fysiologi hos neonatala möss, men hittills ingen tidigare har framgångsrikt isolerat PASMC från dessa små möss. Genom att isolera PASMC, kan ökad information erhållas om hur vägar förändras som svar på stimuli från omgivningen och / eller genetisk modifiering specifikt i lungartären glatt muskulatur. Dessutom kan leva PASMC avbildas i realtid för att undersöka snabba förändringar i viktiga signalmolekyler såsom kalcium och reaktiva syreradikaler 23-25. Vi beskrev nyligen den framgångsrika isoleringen av PASMC från vuxna möss med användning av en variant av tekniken med Marshall et al. 26 används för att isolera råtta PASMC 23,25,26. Vi har nu anpassat ennd utvidgades denna teknik till små möss 7-21 dagars ålder (P7, P14, och P21). Den primära begränsningen till denna nya PASMC isoleringsteknik är att den kräver flera möss för att generera tillräckligt med celler för experiment och att cellerna växer mycket långsamt, som är karaktäristisk för primära glatta muskelceller. Trots dessa begränsningar anser vi denna teknik för att isolera neonatal mus PASMC kommer att möjliggöra förbättrad undersökning av viktiga signalvägar involverade i utvecklingen av pulmonell hypertension och representerar betydande framsteg på detta område.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard Parker surgical blade handle</td>
			<td>BD</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel surgical blades #10 (sterile)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657 and 306646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter (24 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoject blunt cannula (15 G)</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>SWD202314Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9782896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal magnet particle collector</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-01D</td>
			<td>This is a critical tool for the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353001, 353004, and 353003</td>
			<td>Any brand of tissue culture plates will be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors (4 &#189; inch stainless steel)</td>
			<td>American Diagnostic Corporation</td>
			<td>3424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (4 inch stainless steel)</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>L5-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TX16777-164NWU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone/Thermo Scientific</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>Heat inactivate at 55 &#176;C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron particles (iron (II, III) oxide powder)</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>#31,006-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (made to 80 U/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butlet Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-U</td>
			<td>Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-desmin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8281</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle myosin</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-562</td>
			<td>Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-red anti-rabbit secondary</td>
			<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
			<td>R-6394</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE300</td>
			<td>Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-AK800-0001</td>
			<td>This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sildenafil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ-0003</td>
			<td>A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice

Pulmonell hypertension är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet hos spädbarn. Historiskt sett har det funnits betydande studie av signalvägar involverade i vaskulär glatt muskulatur kontraktion i PASMC från foster får. Även fåren gör en utmärkt modell för begreppet pulmonell hypertension, de är mycket dyra och saknar fördelen av genmanipulation hittades i möss. Omvänt var oförmågan att isolera PASMC från möss en betydande begränsning av det systemet. Här har vi beskrivit isolering av primära kulturer av mus PASMC från P7, P14, och P21-möss med användning av en variant av den tidigare beskrivna tekniken enligt Marshall et al. 26 som tidigare användes för att isolera råtta PASMC. Dessa murina PASMC utgör ett nytt verktyg för att studera signalvägar under nyföddhetsperioden. Kortfattat, en uppslamning av 0,5% (vikt / volym) agaros + 0,5% järnpartiklar i M199 media infunderas i pulmonella vaskulära bädden via den högra ventrikeln (RV). Denjärnpartiklarna är 0,2 mikrometer i diameter och kan inte passera genom lungkapillärt sängen. Således är de järn loger i de små lungartärerna (PA). Lungorna är uppblåsta med agaros, bort och identifieras. De järn-kärlen dras ned med en magnet. Efter kollagenas (80 U / ml) behandling och ytterligare dissociation, kärlen tas i en vävnadsodlingsskål i M199-medium innehållande 20% fetalt bovint serum (FBS), och antibiotika (M199 komplett medium) för att tillåta cellmigration på odlingsskålen . Denna initiala platta av celler är en 50-50 blandning av fibroblaster och PASMC. Således är samma rullgardinsmeny procedur upprepas flera gånger för att uppnå en mer ren PASMC befolkning och ta bort eventuella järn. Glatta muskelceller identitet bekräftas genom immunfärgning för glatt muskulatur myosin och desmin.

Under och efter isolering, är PASMC granskas både av ljusmikroskop och genom immunfärgning för mjuka markörer muskelcell. Genom ljusmikroskop tidigt i protokollet, är PASMC ses migrera på vävnadsodlingsskål från lilla jäminnehållande fartyg (Figur 1A). Efter sammanslagning plattorna ett till tre om dagen tretton, då järnpartiklarna inte längre ses som de har dragits ut i det slutliga pooling steget. Istället är en population av PASMC sett på vävnadsodlingsskål (Figur 1B).</st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice at JoVE.com

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Vi har utvecklat en ny och reproducerbar metod för att isolera primära kulturer av lungartären glatta muskelceller (PASMC) från möss så unga som P7, vilket möjliggör bättre studie av de signalvägar involverade i neonatal glatta muskelceller kontraktion och avslappning.

Isolering av lungartären glatta muskelceller från neonatala möss

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca 2 + Övergående Påvisande i glatt muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolering av mänskliga Umbilical arteriella glatta muskelceller (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolering och odling av pulmonell endotelceller från neonatala möss

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitokondriell Isolering från skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering och odling av individuella Myofibers och deras satellit celler från vuxna skelettmuskulatur

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolering, kultur, och transplantation av muskelsatellitceller

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av murin Coronary vaskulära glatta muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Mäta spridningen av vaskulära glatta muskelceller med hjälp av Klicka kemi

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering och karakterisering av exosomer från skelettmuskulaturfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...