Name: detection of the genome and transcripts of a persistent dna virus in neuronal tissues by fluorescent in situ hybridization combined with immunostaining
Uploaded: 2014-01-23T14:45:00
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हम एचएसवी -1 से नमूने उपलब्ध कराने के लिए एन Sawtell (सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल के मेडिकल सेंटर, सिनसिनाटी, ओहियो, संयुक्त राज्य अमरीका), एस Efstathiou (कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय, ब्रिटेन) और जेम्स हिल (LSU स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र न्यू ऑरलियन्स, यूएसए) धन्यवाद क्रमशः, चूहों और खरगोशों से संक्रमित है, और अभिकर्मकों के लिए, उपयोगी विचार विमर्श के लिए एच. Masumoto (Kazusa डीएनए अनुसंधान संस्थान, चिबा, जापान) और एस Khochbin (Institut अल्बर्ट Bonniot, ग्रेनोबल, फ्रांस). यह काम (पी एल, http://www.cnrs.fr को ATIP कार्यक्रम,) केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique (CNRS) से अनुदान, फ्रेंच राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR) (ANR-05-MIIM द्वारा वित्त पोषित किया गया 008-01, CENTROLAT, <a href="http://www.agencenationale-recherche.fr">http://www.agencenationale-recherche.fr</a> ), FINOVI फाउंडेशन ( <a href="http://www.finovi.org/:fr:start">http://www.finovi.org/:fr:start</a> ), LABEX DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) Université डी ल्योन की, इस कार्यक्रम के भीतर &quot;Investissemenटीएस डी &#39;Avenir &quot;(ANR-11-IDEX-0007) ANR द्वारा संचालित ( <a href="http://www.agence-nationale-recherche.fr">http://www.agence-nationale-recherche.fr</a> ), ल एसोसिएशन ला Recherche contre Le कैंसर (एआरसी-7979 और एआरसी-डालना 4910, <a href="http://www.arc-cancer.net">http://www.arc-cancer.net</a> ), ला लीग नेशनल Contre ले कैंसर (LNCC, <a href="http://www.ligue-cancer.net">http://www.ligue-cancer.net</a> ), और इंका (EpiPro कार्यक्रम, <a href="http://www.e-cancer.fr">http://www.e -cancer.fr</a> ). एफसी और पी एल CNRS शोधकर्ताओं हैं.

इस विधि में पहले 22 प्रकाशित एक अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था. Ish, यदि और मछली पर सामान्य पृष्ठभूमि और पारंपरिक हेरफेर के वर्णन के लिए, हम निम्नलिखित उपलब्ध साहित्य 23 सुझाव है. 1. पशु संक?...

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल माउस neuronal ऊतक वर्गों के न्यूरॉन्स के भीतर एचएसवी -1 अव्यक्त जीनोम का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. वायरल जीन अभिव्यक्ति के विनियमन के रास्ते के बारे में हमारी समझ neuronal ऊतकों के भीत...

<html> दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 (एचएसवी -1) इसे दोहराने और प्रसार करने के लिए समय - समय reactivates जिसमें से परिधीय तंत्रिका तंत्र, के त्रिपृष्ठी ganglia (टीजी) के न्यूरॉन्स में एक लंबी अवधि के अव्यक्त संक्रमण की स्थापना, एक लगातार मानव neurotropic वायरस है. एचएसवी -1 जीनोम यह मेजबान सेल जीनोम 1,2 में एकीकृत नहीं है जो के रूप में MULTICOPY chromatinized plasmids बनी हुई है, जहां मेजबान न्यूरॉन के नाभिक में एक 150 केबी dsDNA स्थानीयकृत है. विलंबता के दौरान एचएसवी -1 replicative चक्र आनुवंशिक कार्यक्रम जोरदार दमित है, और जीन अभिव्यक्ति विलंबता स्थापना से पुनर्सक्रियन 3 की दीक्षा के लिए विलंबता जुड़े प्रतिलेख (LAT) लोकस, तक ही सीमित है. अक्षां एक एक प्रमुख 2 केबी स्थिर कमंद में संसाधित लंबे 8.5 केबी noncoding शाही सेना, और कई miRNA 4-7 पैदा करता है. एचएसवी -1 विलंबता इस प्रकार वायरल जीनोमिक डीएनए, अक्षां शाही सेना, और detectable replicative चक्र प्रोटीन के अभाव की उपस्थिति की विशेषता है. &quot;ontent&gt; पशु मॉडल, मुख्य रूप से माउस और खरगोश, मानव में विलंब के कई सुविधाओं recapitulating प्रयोगात्मक मॉडल हैं. उन मॉडलों के मुख्य हितों की है कि वे असुरक्षित मेजबानों में एचएसवी -1 विलंबता की शारीरिक पहलुओं का अध्ययन करने की अनुमति है. पिछले दशकों में , जैसे आनुवंशिक रूप से संशोधित वायरस और चूहों के रूप में कई प्रयोगात्मक उपकरण, शरीर क्रिया विज्ञान, जेनेटिक्स, और जानवरों के ऊतकों से एचएसवी -1 विलंबता, सेलुलर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. अब तक, वायरल जीनोमिक डीएनए का पता चला और मात्रा निर्धारित दक्षिणी धब्बा द्वारा किया गया था और अलग TGS से qPCR. हालांकि, वर्तमान में ऊतक वर्गों 8. नतीजतन, विलंबता नियमित स्वस्थानी संकरण में शाही सेना द्वारा LAT आरएनए का पता लगाने के बजाय के माध्यम से ऊतकीय वर्गों पर मूल्यांकन किया है पर स्वस्थानी संकरण में से एचएसवी -1 जीनोम का पता लगाने के लिए उपलब्ध कोई विधि नहीं है वायरल जीनोम का पता लगाने. यह वायरल जीनोम की उपस्थिति, थी पर आधारित संक्रमित कोशिकाओं को चिह्नित करना असंभव हो गया है क्योंकितकनीकी सीमा इस तरह के वायरल जीनोम और सेलुलर और वायरल जीन अभिव्यक्ति या मेजबान सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 9,10 के बीच रिश्ते के रूप में मेजबान वायरस बातचीत के कई पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए एक बड़ी खामी रही है. सबसे महत्वपूर्ण बात है, अव्यक्त संक्रमण की सेल करने वाली सेल विविधता अपेक्षाकृत बेरोज़गार बना रहता है और चूहों में और SCID चूहों 11-17 में प्रत्यारोपित मानव संवेदी नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स में विलंबता की एक प्रमुख विशेषता होना दिखाया गया है. आमतौर पर, यह सेल प्रति एचएसवी -1 जीनोम प्रतिलिपि संख्या 5 से कई सैकड़ों तक की हो सकती है कि qPCR द्वारा दिखाया गया था. अक्षां विलंबता और पुनर्सक्रियन का एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में प्रकट होता है, पृथक न्यूरॉन्स पर और सीटू पीसीआर में qPCR डेटा गुप्त रूप से संक्रमित न्यूरॉन्स का केवल एक उप, के रूप में कम के रूप में 30%, अक्षां ठिकाना 11,12,18-21 व्यक्त करता है कि संकेत दिया. कैसे मेजबान सेल और वायरस विलंबता स्थापना पर ऊतक प्रभाव के भीतर सेलुलर पर्यावरण औरवायरल जीन अभिव्यक्ति अस्पष्ट बनी हुई है. यहाँ हम जानवर neuronal ऊतक वर्गों के भीतर कम प्रतिलिपि एचएसवी -1 जीनोमिक डीएनए के कुशल पता लगाने के लिए स्वस्थानी संकरण (मछली) विधि में एक मजबूत फ्लोरोसेंट वर्णन. इस विधि से डिजाइन और मेजबान सेल के अंदर परमाणु के घटकों 22 के साथ वायरल जीनोम की बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है कि उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए पहुँच पाने के लिए हमारे द्वारा इस्तेमाल किया गया है. इसके अतिरिक्त, हम वायरल जीन अभिव्यक्ति को विनियमित कि वायरस मेजबान बातचीत का वर्णन करने के लिए एक अनूठा उपकरण है जो आरएनए और प्रोटीन के साथ वायरल डीएनए के साथ पता लगाने के लिए एक से अधिक धुंधला विधि का वर्णन. विधि को भी इस तरह के वर्गों की एक बड़ी संख्या में संक्रमित न्यूरॉन्स बढ़ाता रूप एचएसवी -1 अव्यक्त जीनोम का पता लगाने की आवश्यकता विश्लेषण की एक व्यापक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. एक महत्वपूर्ण कदम के संकरण के लिए वायरल डीएनए सुलभ बनाने के लिए प्रतिजन पुनर्प्राप्ति उपचार लागू करने के लिए है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल भी पता लगाने के लिए कुशल हो सकता हैजानवरों के ऊतकों के भीतर पारंपरिक डीएनए मछली दृष्टिकोण से वर्तमान में पता लगाने योग्य नहीं हैं जो अन्य dsDNA वायरस, के.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="822">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:203px;">Balb/c mice</td>
			<td style="width:189px;">Janvier, France</td>
			<td style="width:93px;"> </td>
			<td style="width:337px;">6 week-old females</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;">HSV-1 strains</td>
			<td>SC16 strain (wild type)</td>
			<td></td>
			<td style="width:337px;">See Labetoule, M. et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 217&#8211;225, for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K2753</td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1251</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:337px;">Suspend 4g of PFA in 90mL of water. Add 50&#181;L of 1N NaOH, and heat at 60&#176;C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30min. Add 10mL of 10X PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 &#176;C in 5mL tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Physiological Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">07982-100TAB-F</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBS, pH 7.4 (sterile)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>84100</td>
			<td>Prepare a 20% sucrose solution in 1X PBS.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:203px;">Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound -</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Large vector DNA purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12462</td>
			<td style="width:337px;">To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nick translation kit</td>
			<td>Roche Applied Sciences</td>
			<td>10 976 776 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cy3-dCTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53021</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">0.5M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">G50 Mini spin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-5330-01 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Salmon sperm DNA 10mg/mL</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ethanol molecular biology grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87047</td>
			<td>Prepare a 70% solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formamid Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td>Caution. Manipulate under fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HSV-1 biotinylated commercial probe </td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ENZ-40838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ImmEdge hydrophobic pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20X Saline Sodium Citrate (SSC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6639</td>
			<td>Prepare a 2X SSC solution in ddH20.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:337px;">Prepare a 10% stock solution in water and store at +4&#176;C. Prepare the 0.5% solution in 1X PBS right before use.</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:102px;">10mM sodium citrate pH 6.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td style="width:337px;">Prepare a 100mM stock solution (10X). Weigh 10,5g of citric acid (MW 210.14. Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400mL water. Adjust pH at 6.0 with 1N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500mL with distilled water. Dilute 10 times in distilled water before use.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Methanol, molecular biology grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dextran sulfate - MW 500 000</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0606-A</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Denhardt&#39;s solution (100X)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1020-A</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rubber Cement &#34;FixoGum&#34;</td>
			<td>Marabut</td>
			<td>290110000</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:203px;">DNA purification kit - Qiaquick PCR purification kit -</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">T7 in vitro transcription kit</td>
			<td>Ambion / Life Technologies</td>
			<td>AM1314</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Biotin-16-UTP</td>
			<td>Roche Applied Sciences</td>
			<td>11388908910</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">RNA purification mini-column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73404</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ribonucleoside Vanadyl Complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1402S</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3410</td>
			<td style="width:337px;">Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td style="width:337px;">prepare a 10mg/mL solution in RNAse free water</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Primary antibodies</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td style="width:337px;">The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;">Secondary fluorescent antibodies</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:337px;">The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are AlexaFluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with AlexaFluor 488 (reference A11001)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:203px;">Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + AlexaFluor 350 (blue fluorescence)</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>#T20937</td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">TSA kits are also available from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:203px;">Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + AlexaFluor 488 (green fluorescence)</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>#T20932</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td style="width:337px;">Prepare a 0.5&#181;g/mL solution in 1X PBS immediatly before use. Discard the remaining solution.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">22x50mm coverslip. n&#176;1.5 glass.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-04</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:203px;"> Mounting medium with anti-fading agent - Vectashield -</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:337px;">Another conventional product is Fluoromount G from electron microscopy Science</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Superfrost glass slides</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td style="width:337px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Equipment / material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Reference</td>
			<td>Note</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Needle for infection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Glass micropipette hot drawn. Home made.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dissection equipement</td>
			<td>Moria, France</td>
			<td></td>
			<td>Microsurgical scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:189px;">Cole Palmer Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Easyload Masterflex</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micro-syringe pump device (Nano Pump)</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>KDS310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cryostat</td>
			<td>Leica France</td>
			<td>CM 1510-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td>Ultra Low -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Domestic microwave oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dry block heater</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022670204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Incubator Slide moat</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>240000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coplin Jar</td>
			<td>Dominique Dutscher</td>
			<td>68512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Staining glass container</td>
			<td>Dominique Dutscher</td>
			<td>68506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:337px;">The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective x40 LD NeoFluor N.A 0.6, and x100 PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43 and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of the genome and transcripts of a persistent dna virus in neuronal tissues by fluorescent in situ hybridization combined with immunostaining

एक जीन की एकल कोशिका codetection अपने उत्पाद शाही सेना और सेलुलर नियामक प्रोटीन जीन अभिव्यक्ति विनियमन अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस विषाणु विज्ञान के क्षेत्र में एक चुनौती है, विशेष रूप से परमाणु नकल लगातार डीएनए वायरस के लिए अपने अध्ययन के लिए पशु मॉडल शामिल है. दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 (एचएसवी -1) परिधीय न्यूरॉन्स में एक जीवन भर अव्यक्त संक्रमण स्थापित करता है. अव्यक्त वायरस यह reactivates और एक नया ददहा प्रकरण लाती है जहाँ से जलाशय के रूप में कार्य करता है. एचएसवी -1 विलंबता की कोशिका जीव विज्ञान के कारण पशु मॉडल में बगल में एचएसवी -1 जीनोम का पता लगाने के तरीकों की कमी के कारण भाग में, खराब समझ बनी हुई है. हम दृष्टिकोण कुशलता से संक्रमित पशु मॉडल से neuronal ऊतकों के वर्गों के भीतर कम प्रतिलिपि वायरल जीनोम का पता लगाने स्वस्थानी संकरण (मछली) में एक डीएनए फ्लोरोसेंट वर्णन. विधि गर्मी आधारित प्रतिजन unmasking पर निर्भर करता है, और सीधे लेबल घर का बना डीएनए जांच, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच. हम एक ट्रिपल stai विकसितनिंग दृष्टिकोण, प्रत्येक धुंधला आवश्यकता को समायोजित करने के लिए peroxidase आधारित संकेत प्रवर्धन का उपयोग कर, आरएनए मछली और immunofluorescence के साथ डीएनए मछली के संयोजन. एक बड़ा सुधार confocal माइक्रोस्कोपी और व्यापक क्षेत्र पारंपरिक epifluorescence द्वारा उच्च संकल्प पर imaged किया जा सकता है कि 10 माइक्रोन ऊतक वर्गों, कम पृष्ठभूमि संकेतों के भीतर प्राप्त करने की क्षमता है. इसके अतिरिक्त, ट्रिपल धुंधला सेलुलर और वायरल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ काम किया. पूरा प्रोटोकॉल ऊतक के भीतर एंटीबॉडी और जांच पैठ को समायोजित करने के लिए 2.5 दिन लेता है.

व्यापक परीक्षण के कई महीनों के बाद, हम गर्मी आधारित रासायनिक unmasking स्वस्थानी संकरण में फ्लोरोसेंट के लिए अव्यक्त एचएसवी -1 जीनोम उपलब्ध कराया कि खोज की. प्रक्रिया के दौरान, हम विभिन्न unmasking प्रक्रिय?...

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Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

हम पशु मॉडल के ऊतक वर्गों के भीतर एक लगातार डीएनए वायरस के जीनोम का पता लगाने के लिए सीटू संकरण प्रोटोकॉल में एक फ्लोरोसेंट की स्थापना की. इस प्रोटोकॉल वायरल जीनोम की codetection अपने आरएनए उत्पादों, और एकल कक्षों के भीतर वायरल या सेलुलर प्रोटीन से संक्रमण की प्रक्रिया का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है.

फ्लोरिसेंट द्वारा neuronal ऊतकों में एक लगातार डीएनए वायरस के जीनोम और देखिए की जांच सीटू संकरण Immunostaining के साथ संयुक्त

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

डबल प्रतिदीप्ति बगल में</emताजा ब्रेन धारा में> संकरण

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

ग्लूटामेट और गाबा की फास्ट माइक्रो योणोगिनेसिस: Synaptic एकता की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Neuronal फायरिंग दरों के हेरफेर से astrocytic रिसेप्टर्स की Plasticity उत्प्रेरण

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

लगातार और व्यापक Neuronal पारगमन के लिए नवजात माउस ब्रेन की Intracerebroventricular वायरल इंजेक्शन

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

उच्च संकल्प का उपयोग मस्तिष्क वर्गों में Axonally स्थानीयकृत mRNAs का पता लगाने<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

संयुक्त तरीके का उपयोग एक्जॉन शाखाओं में बंटी और Neuronal Morphogenesis के दौरान के प्लाज्मा झिल्ली प्रसव भूमिका को परिभाषित करने के लिए

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Neuronal गतिविधि के बाह्य रिकॉर्डिंग जाग चूहों में neuroactive पदार्थों के Microiontophoretic आवेदन के साथ संयुक्त

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

डबल प्रतिदीप्ति का मेल<em&gt; बगल में</em&gt; माउस मस्तिष्क वर्गों में तीन जीनों की अभिव्यक्ति की जांच के लिए Immunolabelling साथ संकरण

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

आरएनए द्वारा टिड्ड एंटीना में गंधी रिसेप्टर जीन का स्थानीयकरण<em&gt; क्षेत्र में</em&gt; संकरण

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

कुतर नाभिक के भीतर डोपामाइन D1-अल्फा रिसेप्टर की पहचान सीटू का पता लगाने प्रौद्योगिकी में एक अभिनव आरएनए द्वारा Accumbens

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...