Name: isolation and quantification of botulinum neurotoxin from complex matrices using the botest matrix assays
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays at JoVE.com

De auteurs willen graag H. Olivares en D. Ruge bedanken voor waardevolle discussies en adviezen. Dit onderzoek werd mede ondersteund door een NSF SBIR award (IIP-1127245 om BioSentinel Inc) en het Ministerie van Defensie contract (W81XWH-07-2-0045 te BioSentinel Inc).

1. Bereiding van Assay Reagents <ol><li> Ontdooi 200x dithiothreitol (DTT), 10x Matrix bindingsbuffer (10x Binding buffer hierna), 10x neutralisatie buffer (pH alleen voedsel of onevenwichtige monsters) en BoTest 10x reactiebuffer (10X Reaction Buffer hierna) bij kamertemperatuur (KT) gedurende 15 min of totdat het volledig ontdooid. Zie tabel 1 voor een overzicht van buffers en reagentia die in dit protocol. Zie tabel 2 voor een lijst van materialen en apparatuur die nodig is voor di...

Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren BoNT / A-complex, holotoxine of Clostridium kweeksupernatant in complexe matrices. Het protocol is hetzelfde, echter, bij het ​​testen van andere BoNT serotypen (bijv. BoNT / B, E en F) met hun respectievelijke Matrix assays 56,60, hoewel assaygevoeligheid zullen verschillen en serotypes en assays. Dit protocol houdt geen rekening met elk type monster mogelijk enkele wijzigingen nodig zijn, afhankelijk van de specifieke vloeist...

Botulinum neurotoxinen (Bonts) zijn de dodelijkste bekende stoffen, met intraveneuze menselijke dodelijke doses geschat op 1-3 ng / kg 1,2. Zeven structureel vergelijkbare serotypen van BoNT, A tot en met G, bestaan ​​elk uit een zware keten domein verantwoordelijk voor celbinding, opname en translocatie naar het cytosol en een lichte keten die een zink-endopeptidase 3-5 codeert. De exquise toxiciteit van BoNT voortvloeit uit, voor een deel, de specifieke binding en inwerking motorische neuronen in de neuromusculaire verbinding 6. Eenmaal binnen het neuron, het lichte keten endopeptidase splitst specifiek een of meer van de oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment eiwitreceptor (SNARE) proteïnen vereist voor vesikel fusie, remmende neurotransmitter en leidt tot zwakke verlamming 7-14. Algemeen bekend als de ziekte &#39;botulisme, &quot;verlamming van het diafragma en tussenribspieren door BoNT uiteindelijk totrespiratoire insufficiëntie en de dood, tenzij een vroege diagnose en behandeling zijn ontvangen. Menselijke voedselbotulisme wordt meestal geassocieerd met BoNT serotypen A, B, E en F (BoNT / A, BoNT / B, enz.) en meestal het gevolg van de inname van besmet voedsel 15,16, hoewel verscheidene gevallen wondbotulisme werden gemeld bij intraveneuze druggebruikers 17,18. In de Verenigde Staten, infantiel botulisme als gevolg van de inname van Clostridium sporen door kinderen onder de leeftijd van een is de meest voorkomende vorm van botulisme 19-21. Echter, door voedsel overgedragen BoNT uitbraken als gevolg van onjuist thuis inblikken en verwerking van levensmiddelen werden gemeld in zowel de Verenigde Staten en in het buitenland. Tussen 2000-2009 werden ten minste 338 gevallen van voedselbotulisme wereldwijd gemeld waaronder zes dodelijke slachtoffers 22. De mogelijkheid om voedselbotulisme uitbraken snel en gevoelig op te sporen is een kritische indicatie dat een vroege diagnose zou kunnen helpen 23,24. Bovendien zal detectiemethoden die kosteneffectief en routinematig testen van voedsel laten leiden tot een betere voedselzekerheid. Neuronale specificiteit en lange biologische halfwaardetijd BoNT maakt het een krachtige therapeutische ook. In de Verenigde Staten, zijn BoNT-gebaseerde geneesmiddelen goedgekeurd door de Food and Drug Administration voor de behandeling van cosmetische voorwaarden en-neuromusculaire-gerelateerde aandoeningen, waaronder glabellalijnen, cervicale dystonie, migraine, overactieve blaas, en scheelzien. Tal van &quot;off-label&quot;-toepassingen zijn gedocumenteerd, met inbegrip van hoge-dosis behandelingen voor ernstige spier-disfunctie 25-28. Nauwkeurige kwantificering toxine is essentieel voor een juiste dosering, als onderdosering kan leiden tot ineffectieve behandeling, terwijl overdosering brengt patiënten met een risico van potentieel schadelijke bijwerkingen. Helaas is er geen gestandaardiseerde potentie assayprotocol gedeeld over fabrikanten, wat resulteert in eenheid definitie ongelijkheid tussen BoNT-based drug products 29-31. De standaard test voor BoNT de muizen bioassay waarin BoNT-houdende monsters intraperitoneaal worden geïnjecteerd in muizen en het aantal sterfgevallen geconstateerd gedurende 1-7 dagen 16,32,33. De muis bioassay is zeer gevoelig met detectielimiet (LOD) van 5-10 pg BoNT / A 34, maar de ethische bezorgdheid over het gebruik van dieren, de hoge kosten van de opleiding van personeel en het onderhoud dier faciliteiten, lange assay keer, en het gebrek aan gestandaardiseerde protocollen geleid tot oproepen om gestandaardiseerde, diervrije BoNT testen en kwantificeringsmethoden 35-39 ontwikkelen. Onlangs werden een aantal alternatieve BoNT kwantificeringsmethoden ontwikkeld die muis of bijna-bioassay gevoeligheid 40-49 bieden. Deze methoden vaak gebruikt fluorescentie, massa-spectrometrie, of immunologische methoden en bieden testtijden aanzienlijk korter dan de bioassay in muizen zonder dierproeven. Massaspectrometrie benaderingen gecombineerd met immunologische techniqwaarden bleken te detecteren en kwantificeren BoNT in voedsel en andere complexe monsters, maar de opleiding van personeel eisen en gespecialiseerde apparatuur limiet deze assays 50-55. De meeste andere alternatieve tests zijn niet direct van toepassing op complexe steekproeven of missen de doorvoer nodig is voor routine BoNT testen. De sterk variabele aard van voedsel monster viscositeit, pH, zoutgehalte, en matrixbestanddelen presenteert een bijzonder moeilijke uitdaging wanneer het proberen om in vitro assay methodes met gevoeligheid voor de extreme kracht van BoNT overeen te ontwikkelen. Zelfs eenvoudige en relatief goedaardige buffersystemen, zoals die welke voortvloeien uit resuspensie van BoNT gebaseerde geneesmiddelen bevatten zout, albumine, suiker en stabilisatoren (bijvoorbeeld excipiënten) die grote invloed in vitro potentie BoNT 56. Toxine zuivering vereist voor nauwkeurige activiteit testen van alle maar de eenvoudigste monsters 56-59. DeBoTest Matrix testen werden ontworpen voor een snelle, high-throughput, en consistente kwantificering van BoNT van zeer complexe monsters met behulp van apparatuur vaak gevonden in onderzoekslaboratoria 56,60. Deze testen gebruiken paramagnetische kralen covalent gebonden aan serotype-specifieke anti-BoNT antilichamen te binden en afzonderen BoNT uit een steekproef en verwijder storende matrix verbindingen door wassen. Na het wassen wordt gebonden BoNT proteolytische activiteit dan gekwantificeerd in een geoptimaliseerde reactie buffer met behulp van een verslaggever compatibel met de BoNT serotype wordt getest. Deze reporters fluorogene eiwitten bestaande uit een N-terminale cyaan fluorescerend eiwit (CFP) deel en een C-eindstandige geel fluorescerend proteïne derivaat (Venus) groep verbonden door een BoNT substraat, SNAP25 residuen 141-206 of synaptobrevin residuen 33-94 die de BoTest A / E of B / D / F / G verslaggevers, respectievelijk 45. Reporter splitsing door BoNT wordt bewaakt door middel Förster resonance energie-overdracht (FRET). Als thij verslaggever is intact, excitatie van GVB resulteert in FRET naar Venus, afschrikken GVB emissie en spannende Venus emissie. Splitsing van de reporter door BoNT FRET voorkomt, wat leidt tot een toename GVB emissie en afname Venus emissie. BoNT activiteit kan dan kwantitatief worden gemeten met behulp van de verhouding van het GVB en Venus uitstoot. LOD onder 3 pg mogelijk uit een breed scala van voedingsmiddelen met behulp van een high-throughput 96-well plaat formaat 56. Verhoogde gevoeligheid kan worden verkregen met grotere monstervolumes aangezien de test maakt concentratie van het toxine op de korrel oppervlak. De BoTest Matrix assays voor Bonts A, B, E, en F werden ontwikkeld en getest met voedings-, farmaceutische, en milieu-monsters 56,60. Hier beschrijven we de procedures voor het uitvoeren van deze tests voor de detectie van BoNT lage complexiteit (bijv. farmaceutische, BoNT in buffer) en grote complexiteit (bijvoorbeeld voeding, milieu) monsters. Specifieke verwerkingsmethodenvoor verschillende soorten monsters worden in dit protocol en soorten monsters hier niet beschreven kan meestal worden aangepast met behulp van een combinatie van de gepresenteerde methoden. Het protocol is ontwikkeld en getest met BoNT / A, maar is aan te passen aan andere BoNT serotypen middel van hun respectieve testen zoals elders 56,60 aangetoond.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit</td>
			<td style="width:107px;">BioSentinel</td>
			<td style="width:104px;">A1015</td>
			<td style="width:245px;">Detection kits for BoNT/B and F are also available.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">Varioskan Flash fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">5250040</td>
			<td style="width:245px;">Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">96-well Magnetic Bead Separation Plate</td>
			<td style="width:107px;">V&#38;P Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">VP771H</td>
			<td style="width:245px;">Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:192px;">Magnetic Bead-Compatible Plate Washer</td>
			<td style="width:107px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:104px;">ELx405 VSRM</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for automated plate washing.&#160; Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for samples needing centrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:192px;">MixMate plate mixer</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:104px;">22674200</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Used at room temperature or at 25 &#176;C If temperature control is available</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">EDTA-free Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">4693132001</td>
			<td style="width:245px;">Only required for food or environmental testing.&#160; Protease inhibitors must be EDTA-free.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">BoNT/A&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for standardization and quantification purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Black, Flat-bottomed 96-well Plates</td>
			<td style="width:107px;">NUNC</td>
			<td style="width:104px;">237105</td>
			<td style="width:245px;">Plates should not be treated</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">96-well Plate Sealing Tape</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">15036</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of botulinum neurotoxin from complex matrices using the botest matrix assays

Nauwkeurige detectie en kwantificering van botulinum neurotoxine (BoNT) in complexe matrices is vereist voor de farmaceutische-, milieu-, en voedsel steekproeven. Rapid BoNT testen van levensmiddelen is nodig tijdens uitbraak forensisch onderzoek, patiënt de diagnose en voedselveiligheid testen is nauwkeurig de werkzaamheid is vereist voor BoNT-based drug fabricage van de producten en de veiligheid van de patiënt. Het op grote schaal gebruikt bioassay in muizen voor BoNT testen is zeer gevoelig, maar mist de precisie en doorvoer nodig is voor een snelle en routinematige BoNT testen. Bovendien is de bioassay&#39;s gebruik van dieren heeft geleid tot oproepen van geneesmiddel regelgevende instanties en voorstanders van dieren-rechten in de VS en het buitenland om de muis bioassay voor BoNT testen vervangen. Verschillende in vitro vervangende tests zijn ontwikkeld die goed werken met gezuiverd BoNT in eenvoudige buffers, maar de meeste niet aangetoond voor testen in zeer complexe matrices zijn. Hier, een protocol voor de detectie vanBoNT in complexe matrices met de BoTest Matrix assays gepresenteerd. De test bestaat uit drie delen: Het eerste deel omvat de voorbereiding van de monsters voor het testen, het tweede deel is een immunoprecipitatie stap met behulp van anti-BoNT-antilichaam beklede paramagnetische kralen te zuiveren BoNT uit de matrix, en het derde deel kwantificeert de geïsoleerde Bont proteolytische activiteit met behulp van een fluorogeen reporter. Het protocol is geschreven voor high throughput testen in 96-well platen met zowel vloeibare als vaste matrices en is ongeveer 2 uur handmatig preparaat met in totaal assay tijd van 4-26 uur, afhankelijk van het type monster toxine belasting en de gewenste gevoeligheid. Gegevens zijn weergegeven voor BoNT / A test met fosfaat gebufferde zoutoplossing, een geneesmiddel, kweeksupernatant, 2% melk en verse tomaten en omvat bespreking van kritische parameters voor de test succesvol.

Een diagram waarin de stappen beschreven protocol wordt getoond in figuur 2. De test vereist tussen 4-26 uur in beslag, afhankelijk van het type monster en de gewenste assaygevoeligheid, maar slechts ~ 2 uur van hands-on tijd. De test wordt uitgevoerd in 96-well platen en afhankelijk van het soort test wordt uitgevoerd, kan triplo getest tot 20 monsters waaronder normen per plaat. Figuur 3 toont representatieve analyseresultaten met BoNT / A holotoxine spike...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays at JoVE.com

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

De BoTest Matrix botulinum neurotoxine (BoNT) opsporingsanalyses snel te zuiveren en te kwantificeren BoNT uit een reeks van monstermatrices. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van BoNT uit zowel vaste als vloeibare matrices en demonstreren van de test met BOTOX, tomaten en melk.

Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Wholemount Immunohistochemie voor het openbaren van Complex Brain Topografie

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Productie en isolatie van axonen van sensorische neuronen voor Biochemische analyse met behulp van poreuze filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Een hoog gehalte Imaging Assay voor Identificatie van botulineneurotoxine Remmers

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Externe excitatie van neuronen Met behulp van elektrische en magnetische velden in een-en twee-dimensionale culturen

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Opsomming van neurale stamcellen Met behulp van klonen Testen

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Lichtgeïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten met behulp van het PRIMO-systeem voor micro patronen om Celresponsen te bestuderen op extracellulaire matrix eiwitten

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...