Name: isolation and quantification of botulinum neurotoxin from complex matrices using the botest matrix assays
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить H. Olivares и Д. Руге за ценные обсуждения и консультации. Это исследование было поддержано частично за счет премии NSF SBIR (МИП-1127245 в BioSentinel Инк) и Министерства обороны контракта (W81XWH-07-2-0045 в BioSentinel Inc.)

1. Подготовка реагентов для анализа <ol><li> Thaw 200x дитиотреитола (DTT), 10x Матрица Связывающий буфер (10х буфера для связывания далее), 10x нейтрализации буфера (рН пищевых или несбалансированные образцы только) и 10x BoTest Реакционный буфер (10х реакционного буфера далее) при комнатной температуре (...

Этот протокол описывает процедуры для количественного BoNT / A сложный, голотоксина или Clostridium супернатанта культуры в комплексных матриц. Протокол то же самое, однако, при тестировании других серотипов ботулинического токсина (например BoNT / B, E, и F) с соответствующими Matrix анализ?...

Нейротоксинов ботулина (BoNTs) являются самыми смертоносными вещества, известные, с внутривенных человека смертельных доз оценивается в 1-3 нг / кг 1,2. Семь структурно подобные серотипов BoNT, помечены через G, существует, каждый из которых состоит из тяжелой цепи домена, ответственного за связывание клеток, поглощение, и транслокации в цитозоль и легкой цепи, которая кодирует цинка эндопептидазы 3-5. Изысканный токсичность BoNT результатом, в частности, его специфического связывания и вступление в моторных нейронов в нервно-мышечном соединении 6. Оказавшись внутри нейрона, легкой цепи эндопептидаза специально расщепляет один или несколько из растворимого N-этилмалеимид чувствительных рецепторов белка привязанность фактором (SNARE) белков, необходимых для слияния пузырьков, ингибирования высвобождение нейромедиаторов и приводит к вялым параличом 7-14. Обычно известный как болезнь &quot;ботулизма&quot;, паралич диафрагмы и межреберных мышц по BoNT в конечном итоге приводитдыхательная недостаточность и смерть, если ранней диагностики и лечения принимаются. Человека пищевого ботулизма чаще всего ассоциируется с ботулинического токсина серотипов A, B, E, и F (BoNT / A, BoNT / B, и т.д.) и обычно возникает в результате употребления в пищу загрязненных продуктов питания 15,16, хотя несколько случаев раны ботулизма было зарегистрировано среди потребителей инъекционных наркотиков 17,18. В Соединенных Штатах, детский ботулизм в результате проглатывания Clostridium спор детьми в возрасте до одного является наиболее распространенной формой ботулизма 19-21. Тем не менее, были зарегистрированы пищевые вспышки ботулинического токсина в результате неправильного домашнего консервирования и переработки пищевых продуктов как в Соединенных Штатах и ​​за рубежом. Между 2000-2009 было зарегистрировано по меньшей мере 338 случаев пищевого ботулизма во всем мире в том числе шесть погибших 22. Способность быстро и чутко обнаружить пищевого происхождения вспышек ботулизма является одним из важнейших признаков того, что может помочь ранней диагностики 23,24. Кроме того, методы обнаружения, которые позволяют экономически эффективным и рутинное тестирование питания приведет к улучшению продовольственной безопасности. Нейронов специфика Бонт и долго биологического полураспада также делает его мощным терапевтическим. В Соединенных Штатах, наркотики ботулинического токсина типа на основе утверждаются по контролю за продуктами и лекарствами для лечения косметических состояний и нервно-мышечных расстройств, связанных в том числе глабеллярных линий, цервикальной дистонии, мигрени, гиперактивного мочевого пузыря, и косоглазия. Многочисленные &quot;не по прямому назначению&quot; приложений задокументированы, в том числе высоких доз лечения тяжелой дисфункцией мышц 25-28. Точная токсин количественное имеет решающее значение для правильного дозирования, как недокомпенсация может привести к неэффективному лечению в то время как передозировка ставит пациентов риску потенциально вредных побочных эффектов. К сожалению, ни стандартизированный протокол потенции анализ не является общим для производителей, в результате чего неравенства четкости блок между ботулинического токсина типа на основе произво наркотиковк.т.н. 29-31. Стандартный тест на BoNT является биоанализа мыши, в котором BoNT-содержащие образцы инъецировали внутрибрюшинно мышам и количество смертей, зарегистрированных в течение 1-7 дней 16,32,33. Биологический мыши очень чувствительна с пределов обнаружения (LOD) 5-10 пг BoNT / A 34, однако этические опасения по поводу использования животных, высокая стоимость обучения персонала и поддержание объектов животного, длинные раз анализе и отсутствие стандартизированные протоколы привели призывы разработать стандартизированную, животное без Бонт тестирования и методы количественной 35-39. В последнее время несколько альтернативные методы ботулинического токсина количественного были разработаны, которые предлагают мыши или почти мыши чувствительность биопроб 40-49. Эти методы обычно используют флуоресценцию, масс-спектрометрии, или иммунологические методы и предлагают раз опробования значительно короче биопроб мыши без использования животных. Масс-спектрометрии подходов в сочетании с иммунологической TechniqЕЭС были показаны для выявления и количественной BoNT содержится в продуктах питания и других сложных образцов, однако требования к обучению персонала и предел специализированное оборудование этих анализов 50-55. Большинство других альтернативных анализы не всегда применимы к сложной образца тестирования или не хватает пропускной способности, необходимой для регулярного тестирования ботулинического токсина. Сильно варьирует характер образца пищевой вязкости, рН, содержание солей и матричных компонентов представляет особенно трудную задачу, пытаясь развить в пробирке методы анализа с чувствительностью, чтобы соответствовать крайнюю потенцию BoNT. Кроме того, даже простые и относительно доброкачественные буферные системы, такие, как в результате ресуспендированием лекарственных продуктов ботулинического токсина типа на основе, содержат соли, альбумина и сахара стабилизаторы (т.е. наполнители), что значительно повлиять в пробирке BoNT потенции 56. Очистка Токсин требуется для точной деятельности тестирования всех, кроме простейших образцов 56-59. BoTest Матричные анализы предназначен для быстрого, высокой пропускной способностью, и в соответствии количественное BoNT от очень сложных образцов с использованием оборудования обычно встречаются в научно-исследовательских лабораториях 56,60. Эти анализы использовать парамагнитные шарики, ковалентно связанные с серотипа конкретных анти-ботулинического токсина антител связываться и поглощения Бонт из образца, а затем удалить вмешиваясь матричные соединения промывкой. После промывания, граница протеолитическую активность ботулинического токсина затем количественно в оптимизированном реакционного буфера, используя репортер, совместимый с серотип ботулинического токсина проходит испытания. Эти репортеры флуорогенные белки, состоящие из N-концевой голубой флуоресцентный белок (СФП) фрагмент и желтый флуоресцентный производной (Венера) фрагмент С-концевой белок, связанный с помощью ботулинического токсина подложки, SNAP25 остатков 141-206 или синаптобревин остатков 33-94 составляющих BoTest / E или B / D / F / G репортеры, соответственно 45. Репортер расщепление BoNT контролируется с использованием Förster резонансный перенос энергии (FRET). При тон репортер не повреждена, возбуждение CFP приводит лад с Венеры, закалки эмиссию CFP и интересно излучение Венеры. Расщепление репортера по BoNT предотвращает FRET, что приводит к увеличению эмиссии CFP и снижения выброса Венера. BoNT активность может быть количественно измерена с помощью соотношение количества выбросов CFP и Венеры. LOD ниже 3 мкг возможны из широкого спектра пищевых продуктов с использованием высокой пропускной формат 96-луночный планшет 56. Увеличение чувствительности могут быть получены с использованием больших объемов образцов, так как анализ позволяет концентрацию токсина на поверхности шарика. Матрица анализы BoTest для BoNTs А, В, Е и F были разработаны и протестированы с пищевой, фармацевтической, и проб окружающей среды 56,60. Здесь мы описываем процедуры для выполнения этих анализов для обнаружения BoNT в низкой сложности (например, фармацевтической, BoNT в буфере) и высокая сложность (например, продукты питания, экологической) образцы. Конкретные методы обработкина несколько типов образцов, рассматриваются в данном протоколе и типов образцов, не описанные здесь, как правило, могут быть адаптированы с помощью комбинации представленных методов. Протокол был разработан и испытан с BoNT / A, но адаптированы к условиям других серотипов ботулинического токсина использовали свою анализов, как показано в другом месте 56,60.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit</td>
			<td style="width:107px;">BioSentinel</td>
			<td style="width:104px;">A1015</td>
			<td style="width:245px;">Detection kits for BoNT/B and F are also available.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">Varioskan Flash fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">5250040</td>
			<td style="width:245px;">Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">96-well Magnetic Bead Separation Plate</td>
			<td style="width:107px;">V&#38;P Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">VP771H</td>
			<td style="width:245px;">Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:192px;">Magnetic Bead-Compatible Plate Washer</td>
			<td style="width:107px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:104px;">ELx405 VSRM</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for automated plate washing.&#160; Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for samples needing centrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:192px;">MixMate plate mixer</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:104px;">22674200</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Used at room temperature or at 25 &#176;C If temperature control is available</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">EDTA-free Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">4693132001</td>
			<td style="width:245px;">Only required for food or environmental testing.&#160; Protease inhibitors must be EDTA-free.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">BoNT/A&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for standardization and quantification purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Black, Flat-bottomed 96-well Plates</td>
			<td style="width:107px;">NUNC</td>
			<td style="width:104px;">237105</td>
			<td style="width:245px;">Plates should not be treated</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">96-well Plate Sealing Tape</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">15036</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of botulinum neurotoxin from complex matrices using the botest matrix assays

Точное обнаружение и количественное определение ботулинического нейротоксина (ботулинического токсина) в комплексных матриц требуется для фармацевтической, экологических и испытаний образцов пищевых продуктов. Быстрое BoNT тестирование продуктов питания необходим во время вспышки экспертизы, диагностики пациента и тестирования безопасности пищевых продуктов в то время как точная потенции испытания для производства ботулинического токсина типа на основе лекарственного препарата и безопасности пациентов. Широко используется мышь биопроб для тестирования ботулинического токсина очень чувствительна, но не хватает точности и пропускной необходимое для быстрого и регулярного тестирования ботулинического токсина. Кроме того, использование биоанализе в животных привело к призывам лекарственного продукта регулирующими органами и сторонниками за права животных в США и за рубежом, чтобы заменить биоанализ мыши для тестирования ботулинического токсина. Несколько в пробирке запасные анализы были разработаны, которые хорошо работают с очищенной BoNT в простых буферов, но большинство из них не было показано, что применимо к тестированию в очень сложных матриц. Здесь, протокол для обнаруженияBoNT в комплексных матриц с использованием BoTest Matrix анализов представлена. Анализ состоит из трех частей: Первая часть включает в себя подготовку образцов для тестирования, вторая часть является шагом иммунопреципитацию использованием анти-Бонт антител покрытием парамагнитные шарики, чтобы очистить Бонт из матрицы, и третья часть количественно протеолитической изолированной Бонт в Деятельность, использующая флуорогенный репортер. Протокол написана для высокой пропускной тестирования в 96-луночных планшетах с использованием как жидкие, так и твердые матрицы и требует около 2 ч ручного приготовления с всего раз анализе 4-26 часов в зависимости от типа образца, токсинов нагрузки и желаемого чувствительности. Данные представлены для BoNT / A тестирования с забуференным фосфатом физиологическим раствором, лекарственного продукта, культурального супернатанта, 2% молока и свежих томатов и включает обсуждение критических параметров успеха анализа.

Схема подведения шаги в описанной протокола показано на рисунке 2. Анализ требует от 4-26 часов, чтобы завершить в зависимости от типа образца и желаемой чувствительности анализа, но только ~ 2 часа из практического времени. Анализ проводят в 96-луночных планшетах и, в зависимости ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays at JoVE.com

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

BoTest Матрица нейротоксин ботулизма (BoNT) анализы обнаружения быстро очистить и количественно Бонт из целого ряда образцов матриц. Здесь мы приводим протокол для обнаружения и количественного определения BoNT от обоих твердых и жидких матриц и продемонстрировать анализа с помощью ботокса, помидоры, и молока.

Выделение и количественная оценка ботулинического нейротоксина Из комплексных матриц с использованием BoTest Matrix Анализы

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Вскрытие и культуры мышь дофаминергической и стриатуме эксплантов в трехмерных Анализы коллагеновой матрице

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Wholemount иммуногистохимии для выявления сложной топографии мозга

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Получение и выделение Аксоны от сенсорных нейронов для биохимического анализа, используя пористые фильтры

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Высокое содержание изображений Пробирной для идентификации ботулинического нейротоксина ингибиторов

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Внешнее возбуждение Нейроны Использование электрических и магнитных полей в одно- и двумерных культур

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Перечень нервных стволовых клеток, с помощью клоновых Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Светиндуцированная молекулярная адсорбция белков с использованием системы PRIMO для микро-паттернинга для изучения реакции клеток на внеклеточные матричные белки

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...