Name: transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر جين شين من مستشفى ماساتشوستس العام للتبرع سخي من الشتلات نيكوتيانا benthamiana. ساعد جين بوش لنا إلى حد كبير في تقديم المشورة في زراعة النباتات وإنشاء منطقة غرفة النمو. عرضت توم فيرانتي من معهد ويس مساعدة حاسمة مع المجهري متحد البؤر. فإن الكتاب أود أن أشكر بصفة خاصة دون انجبير من مستشفى بوسطن للأطفال ومعهد لويس التبرع السخي من جين غون واللوازم المرتبطة بها. وقدمت التمويل لهذا المشروع من خلال اتفاقية تعاون مع وزارة الطاقة وكالة مشاريع البحوث المتقدمة (ARPA-E جائزة # DE-000079) لنظام تقييم الأداء، JCW، وأطباء العالم، ومن خلال Chimerion التكنولوجيا الحيوية، وشركة لMJV.

1. تصميم متواليات تقسم بدلا من ذلك لاستهداف متعددة العضيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المواقع للتعبير البروتين النهائي. لهذا العمل، وتكون الفائدة في استهداف بلاستيدات الخضراء، بيروكسية، والعصارة الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction...

<ol>
	<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait+stacking+in+transgenic+crops:+challenges+and+opportunities.">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li><li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+plant+splicing+code:+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements.">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li><li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon.">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li><li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age.">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li><li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing.">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li><li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5'-+and+3'-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments.">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li><li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana.">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li><li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement.">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts.">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li><li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes.">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li><li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5'+mRNA+tags.">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle:+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes.">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li><li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides,+metabolic+pathways,+and+defense+mechanisms.">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC)+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene.">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li></ol>

في هذه الدراسة، تم وصفها استراتيجيات بسيطة لإضفاء الطابع المحلي على البروتين المعدلة وراثيا واحد لمقصورات الخلوية متعددة في النباتات. كان الهدف لتصميم بناء من شأنه أن التعبير عن جين واحد في عضية أكثر من واحد في نيكوتيانا benthamiana. وتشمل استراتيجيات التصميم الرشي?...

هذا العمل هو مشروع الهندسة / البيولوجيا التركيبية التمثيل الغذائي حيث صممت الخلايا النباتية للتعبير عن البروتين مراسل في العضيات متعددة ولكن فقط مع بناء الحمض النووي واحد. نهج واحد لاستهداف البروتينات لأكثر من موقع واحد ينطوي على استنساخ نسخ جينية متعددة، كل منها يحتوي على الببتيد توطين مختلفة. يجب إدخال كل نسخة قبل إعادة تحويل المتعاقبة، أو بدلا من ذلك، من خلال backcrossing التحويلات واحدة 1. وهذا ينطوي على الاستنساخ إضافية، ويقتصر تلو الآخر علامة التعريب في محطة. طريقة أخرى لتوطين البروتين إلى مواقع متعددة من خلال الربط البديلة 2-5. وكتب الحمض النووي الريبي من جين واحد، ولكن يتم معالجتها نسخ مختلفة من النص بشكل مختلف، وغالبا في أكثر من طريقة واحدة لكل خلية. هذا يمكن أن يؤدي في أكثر من الحمض النووي الريبي رسول في الخلية نسخها من جين واحد. هذه MESSENGE مختلفةيمكن الرنا ص ترميز لالإسوية مختلفة من نفس البروتين، أو في حالة وجود انزياح الإطار، وهو بروتين مختلفة تماما. على الرغم من أن وصفت الربط البديلة في الأدب لسنوات عديدة، وفقط يتم توضيح آليات العمل والجهات المانحة الحفظ ولصق مواقع مستقبلات مؤخرا 6. كما ويجري وصف هذه المواقع على نحو أفضل، فإنها تفتح فرصا للهندسة. وتواجه المهندسين الأيض النباتية مع التحدي عند التعبير عن بروتين في العضيات متعددة. لبروتين الذي هو أن تكون مترجمة إلى عضية أكثر من واحد، ويجب على مهندس استنساخ نفس الجين عدة مرات، مع كل تسلسل إشارة منفصلة توجيهها إلى عضية من الفائدة. لجين واحد في ثلاثة العضيات، وهذا هو ببساطة ثلاثة جينات. ولكن لالأيضية مسار ستة الجينات، وهذا يوسع إلى 18 الجينات، وهو جهد كبير الاستنساخ. الجمع بين متواليات توطين متعددة في، علامة جين واحد تقسم بدلا من ذلك،ificantly يقلل من هذا الجهد. على سبيل المثال، إعادة هندسة التنفس الضوئي والتوليف isoprenoid 7،8 9،10 تشمل كلا من البلاستيدات الخضراء وperoxisomes. في حالتنا نحن استغل مواقع لصق كما لوحظ في نظام thaliana نبات الأرابيدوبسيس الطبيعية الموصوفة سابقا 6. نحن أعيد تصميمه بعقلانية تسلسل مرنا مغادرة مواقع لصق الطبيعية وحدها، ولكن وضعت تسلسل التي من شأنها أن ترميز-بلاستيدات الخضراء أو العلامات التي تستهدف بيروكسية ضمن الإنترونات تقسم بدلا من ذلك (الشكل 1). البروتين المعبر عنه قد أو قد لا يكون علامة، اعتمادا على ما إذا كان رفعه ما قبل مرنا أن المشفرة على أنها إنترون (أرقام 1G و1H). لمزيد من المعلومات حول تصميم بنيات قدمت في هذا العمل، الرجاء مراجعة المقالة رفيق 11. لأن هذا لا يزال هناك جهد كبير الاستنساخ، جيبسون التجمع، طريقة جديدة لاستنساخ بنيات الحمض النووي، هو شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في البناء. طريقة جيبسون يمكن استخدامها لأي تسلسل، بغض النظر عن المواقع تقييد (الشكل 2) 12-14. مزيج محددة من الانزيمات يسمح لخطوة واحدة، والتجمع متساوي الحرارة. في هذه الطريقة، فقد تم تصميم عدة أجزاء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل خطي بحيث يكون تسلسل تداخل ~ 50 نقطة. جيبسون التجمع مزيج إنزيم يساعد على هضم جزئيا أجزاء الحمض النووي الخطية، وفضح خيوط واحدة من متواليات مثلي. وهذه التسلسلات واحد الذين تقطعت بهم السبل جزئية إعادة صلب في خليط التفاعل، مما أدى إلى، خطوة واحدة، تسلسل مستقلة، خالية من ربط رد فعل subcloning السريع. يصف هذا العمل 1) تصميم عقلاني يبني تقسم بدلا من ذلك للتعبير في البلاستيدات الخضراء النباتية، peroxisomes، وcytosols، 2) الاستنساخ باستخدام طريقة خالية من ربط جديدة من جيبسون التجمع، 3) إيصالها إلى خلايا نبات التبغ مع جين غون، و 4) النتائج التي تظهر استهداف عضية، كما لوحظ مع GFPومتحد البؤر المجهري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td style="width:167px;">Design specifically for construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneBlocks</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td>500 bp oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApE software</td>
			<td style="width:191px;">U Utah</td>
			<td style="width:119px;">(download)</td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28004</td>
			<td>Used to purify PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Master Mix with GC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0532S</td>
			<td>Used to PCR-amplify gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibson assembly reaction mix</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2611L</td>
			<td>Master mix of the following 9 ingredients</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M Tris-HCl pH7.5</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">T1075</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M MgCl2</td>
			<td style="width:191px;">G Biosiences</td>
			<td style="width:119px;">82023-086</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M DTT</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG-8000</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">19966</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1124,0005</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:191px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">T5E4111K</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208L</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibthon.org</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Website to simplify calculations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid PLUS Maxi kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12963</td>
			<td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Gun system</td>
			<td style="width:191px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">165-2451</td>
			<td>Includes all parts necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nicotania benthamiana</td>
			<td style="width:191px;">(n/a)</td>
			<td style="width:119px;">(n/a)</td>
			<td>Gift of Jen Sheen, MGH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5 X MP</td>
			<td>Imaging of resultant cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deep well slides</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71561-01</td>
			<td>Used for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A Plasmid Editor (ApE) </td>
			<td style="width:191px;">University of Utah </td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gibthon:Ligation calculator</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

من أجل استهداف بروتين واحد لالعضيات التحت خلوية متعددة، النباتات عادة تكرار الجينات ذات الصلة، والتعبير عن كل جينة على حدة باستخدام استراتيجيات التنظيمية المعقدة بما في ذلك الفرق المروجين و / أو متواليات إشارة. وتواجه المهندسين وعلماء الأحياء الاصطناعية الأيض المهتمين في استهداف الإنزيمات إلى عضية خاص مع التحدي: للحصول على البروتين الذي هو أن تكون مترجمة إلى عضية أكثر من واحد، ويجب على مهندس استنساخ نفس الجين عدة مرات. ويعرض هذا العمل حل لهذه الاستراتيجية: تسخير الربط البديلة للمرنا. هذه التكنولوجيا يستفيد من اليخضور وأنشأت بيروكسية استهداف تسلسل ويجمع بينهما في مرنا واحد هو أن تقسم بدلا من ذلك. يتم إرسال بعض المتغيرات لصق إلى بلاستيدات الخضراء، وبعض إلى بيروكسية، وبعض إلى العصارة الخلوية. هنا تم تصميم هذا النظام لاستهداف متعدد عضية مع الربط البديلة. في هذا العمل، وكان من المتوقع أن تكون EXPR GFPessed في بلاستيدات الخضراء، العصارة الخلوية، وبيروكسية من خلال سلسلة من تصميم بعقلانية 5 &#39;مرنا به. هذه العلامات لديها القدرة على تقليل كمية الاستنساخ المطلوبة عند تحتاج إلى أن تتجلى في العضيات التحت خلوية متعددة الجينات مغاير. تم تصميم البناءات في العمل السابق 11، وكانت المستنسخة باستخدام جيبسون التجمع، وربط الأسلوب مستقلة الاستنساخ التي لا تتطلب الإنزيمات قيود. أدخلت البلازميدات الناتجة في نيكوتيانا benthamiana خلايا البشرة ورقة مع بروتوكول تعديل الجينات بندقية. أخيرا، لوحظت الأوراق تتحول مع المجهري متحد البؤر.

كان جهد التصميم نتيجة لتخطيط كبير. رواية لهذا المشروع هو استخدام الربط بديلة لإنشاء ما قبل مرنا التي يتم ترجمتها إلى البروتينات وأعرب تفاضلي. يتم التعبير عن هذه البروتينات في العضيات المختلفة، في هذه الحالة بلاستيدات الخضراء، بيروكسية و / أو العصارة الخلوية. نحن تكي?...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun at JoVE.com

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

يصف هذا العمل طريقة جديدة لاستهداف انتقائي العضيات التحت خلوية في النباتات، ويعاير باستخدام BIORAD جين غون.

عابر التعبير الجيني في التبغ باستخدام الجمعية جيبسون وجين غون

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

تقرير من خارج الخلية الميكروبية نشاط انزيم في المياه، والتربة، والرواسب باستخدام إنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية فحوصات

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

نص والمستقلب التنميط لتقييم شجرة التبغ والحور كمادة وسيطة لصناعة القائمة على الحيوية

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

تتبع التلوث الميكروبي في بيئات البيع بالتجزئة عن طريق نيون مسحوق - A التجزئة أطعمة معلبة البيئة مثال

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

التعبير عن المؤتلف سلولاز Cel5A من<em&gt; الترايكوديرما reesei</em&gt; في نباتات التبغ

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

فحص المواد الغذائية للفئة 1 Integrons وجين كاسيتات

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

تحكم بوساطة رني من الأفلاتوكسين في الفول السوداني: طريقة لتحليل الإنتاج السموم الفطرية والتعبير التحوير في الفول السوداني /<em&gt; الرشاشيات</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

أوزة إيمبروفيسوس بالانوس "نموذج البحرية"-استزراع و "التعبير الجيني"

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

توميفاسينس المتبعة و rhizogenes المتبعة-بوساطة التحول من البطاطا ونشاط المروج الجين صابرين ب Staining غوس

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

اختبار أوراق منفصلة لتبسيط دراسات التعبير الجيني في البطاطا أثناء الإصابة عن طريق مضغ الحشرات مندوكا sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

تقدير مؤشر منطقة الورق باستخدام ثلاث طرق متميزة في مواقف نفضي نقية

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...