Name: transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00
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저자는 담배 benthamiana 모종의 관대 한 기부에 대한 매사 추세 츠 종합 병원의 젠 쉰에게 감사의 말씀을 전합니다. 젠 부시 대통령은 식물 성장 및 성장 챔버 영역을 설정하는 조언에 크게 도움을주었습니다. Wyss 다음 연구소의 톰 Ferrante의 공 초점 현미경에 중요한 도움을 제공했다. 저자는 특히 보스턴 아동 병원의 돈 Ingber과 유전자 총과 관련된 공급의 관대 한 기부에 대한 Wyss 다음에 연구원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 프로젝트에 대한 자금 조달은 PAS, JCW 및 MDM에 대한 에너지 고급 연구 프로젝트 기관의 부 (ARPA-E 상 # DE-000079)와 협력 계약을 통해 제공되며, Chimerion 생명 공학, 주식 회사를 통해 MJV에 대한했습니다.

대상으로 여러 세포 기관에 대한 대안 - 접합 시퀀스의 1. 디자인 <ol><li> 최종 단백질 발현을위한 사이트를 확인합니다. 이 작품의 경우, 관심이 엽록체, 퍼 옥시 및 세포질을 대상으로합니다. </li><li> 관심의 세포 기관에 단백질을 표적으로하는 것으로 알려진 단백질과 DNA 시퀀스를 식별하기 위해 문학을 사용합니다. 이 경우 엽록체는 애기 장대의 L-isoaspartate의 methyltransferase <s...

<ol>
	<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait+stacking+in+transgenic+crops:+challenges+and+opportunities.">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li><li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+plant+splicing+code:+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements.">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li><li>Hickey, S. 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J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5'+mRNA+tags.">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. 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본 연구에서는 단순한 전략은 식물의 여러 세포 구획에 단일 유전자 변형 단백질을 지역화에 대해 설명합니다. 목표는 담배 benthamiana에 하나 이상의 소기관으로 단일 유전자를 발현 할 구조물을 설계하는 것이었다. 전략은 합리적 GFP 기반의 DNA 구조의 설계, 깁슨 조립, 유전자 총을 가진 잎의 세포에 플라스미드의 전달 및 공 초점 현미경과 결과의 관찰이 (가) 있습니다. <p class="jove_content...

이 작품은 식물 세포가 여러 세포 기관에서 리포터 단백질을 발현하도록 설계하지만, 단 하나의 DNA 구조를 가진 것을 특징으로 대사 공학 / 합성 생물학 프로젝트입니다. 둘 이상의 위치로 단백질을 표적으로하는 하나의 접근법은 여러 복제 유전자 사본 다른 지역화 펩티드를 포함하는 각을 포함한다. 각 복사본은 하나의 변환 1을 역 교배에 의해, 또는 연속 재 변환에 의해 도입, 또는해야합니다. 이 추가 복제를 포함하고, 말단 당 하나의 지역화 태그에 의해 제한됩니다. 여러 위치에 단백질을 집중하는 또 다른 방법은 다른 접합 2-5을 통해서이다. RNA는 단일 유전자로부터 전사되지만, 전 사체의 다른 복사본은 셀 당 하나 이상의 방법으로 종종 다르게 처리된다. 이것은 단일 유전자로부터 전사 셀에 둘 이상의 메신저 RNA가 발생할 수있다. 이러한 다양한 MESSENGER RNA를 동일한 단백질의 상이한 이소 형을 위해 인코딩 또는 틀 이동, 모두 다른 단백질의 경우에 할 수있다. 대안적인 스 플라이 싱은 수년 동안 문헌에 기술되어 있지만, 작업 및 보존 공여체 및 수용체 스플 라이스 위치의기구는 더 최근 6 해명되고있다. 이 사이트는 더 나은 기술되고있다, 그들은 엔지니어링에 대한 기회를 엽니 다. 여러 소기관의 단백질을 발현 할 때 식물 대사 엔지니어는 도전에 직면하고 있습니다. 하나 이상의 세포 기관에 국한되어 단백질의 경우, 엔지니어는 관심의 세포 기관에 지시 별도의 신호 순서와 동일한 유전자 각을 여러 번 복제해야합니다. 세 소기관에 단일 유전자의 경우, 이는 단순히 세 유전자이다. 그러나 여섯 유전자 대사 경로에 대해,이 18의 유전자 복제 상당한 노력을 확장합니다. 하나의 대안 - 접합 유전자 기호에 여러 현지화 시퀀스를 결합ificantly이 노력을 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 리엔지니어링 광호흡 7,8 및 이소 프레 노이드 합성 9,10는 엽록체와 퍼 옥시 솜을 모두 포함한다. 자연 애기 장대 시스템에서 관찰로 우리의 경우에 우리는 이전 6 설명 스플 라이스 사이트를 이용했다. 우리는 이성적으로 만 자연 스플 라이스 사이트를 떠나 mRNA의 순서를 재 설계하지만, 대안 - 접합 인트론 (그림 1)에서 엽록체 또는 퍼 옥시 타겟팅 태그를 인코딩 할 순서를 배치. 발현 된 단백질 또는 인코딩 사전의 mRNA는 인트론 (그림 1g 및 1H)로 적출 여부에 따라 태그가있을 수도 있고 없을 수도 있습니다. 이 연구에서 제시 한 구조의 설계에 대한 자세한 내용은 관련 기사 11를 참조하십시오. 이것은 여전히​​ 상당한 클로닝 노력 깁슨 조립체, DNA 구조를 클로닝하기위한 새로운 방법이므로, U는건설에 나오지. 깁슨 방법에 관계없이 제한 부위 (그림 2) 12 ~ 14의 모든 순서에 사용될 수있다. 효소의 특정 혼합 한 단계 등온 조립을 허용한다. 이 방법에서는, 몇개의 이중 가닥 선형 DNA의 부품들은 50 ~ BP의 겹치는 서열을 갖도록 설계된다. 깁슨 조립체 효소 믹스는 부분적 상동 서열의 단일 가닥을 노광, 선형 DNA의 부분 소화. 이러한 부분적인 단일 가닥 서열은 신속한 원스텝, 순서에 관계없이, 결찰 미사용 서브 클로닝 반응의 결과, 반응 혼합물에 재 어닐링된다. 이 작품은 식물의 엽록체, 퍼 옥시 솜 및 cytosols의 표현을위한 1) 합리적인 설계 대안 접합 구조를 설명, 2) 자신의 복제 깁슨 어셈블리의 새로운 결찰없는 방법을 사용, 3) 유전자 총을 가진 담배 잎의 세포에 자신의 배달하고, GFP 관찰로, 세포 기관 타겟팅을 보여주는 4) 결과및 공 초점 현미경.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td style="width:167px;">Design specifically for construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneBlocks</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td>500 bp oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApE software</td>
			<td style="width:191px;">U Utah</td>
			<td style="width:119px;">(download)</td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28004</td>
			<td>Used to purify PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Master Mix with GC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0532S</td>
			<td>Used to PCR-amplify gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibson assembly reaction mix</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2611L</td>
			<td>Master mix of the following 9 ingredients</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M Tris-HCl pH7.5</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">T1075</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M MgCl2</td>
			<td style="width:191px;">G Biosiences</td>
			<td style="width:119px;">82023-086</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M DTT</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG-8000</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">19966</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1124,0005</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:191px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">T5E4111K</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208L</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibthon.org</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Website to simplify calculations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid PLUS Maxi kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12963</td>
			<td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Gun system</td>
			<td style="width:191px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">165-2451</td>
			<td>Includes all parts necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nicotania benthamiana</td>
			<td style="width:191px;">(n/a)</td>
			<td style="width:119px;">(n/a)</td>
			<td>Gift of Jen Sheen, MGH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5 X MP</td>
			<td>Imaging of resultant cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deep well slides</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71561-01</td>
			<td>Used for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A Plasmid Editor (ApE) </td>
			<td style="width:191px;">University of Utah </td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gibthon:Ligation calculator</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

여러 세포 내 소기관으로 단백질을 단일 타겟하기 위하여, 식물은 일반적으로 중요한 유전자를 복제하고, 차동 촉진제 및 / 또는 신호 서열을 포함한 복잡한 규제 전략을 사용하여 개별적으로 각각의 유전자 표현. 대사 엔지니어와 특정 세포 기관에 효소를 표적에 관심이 합성 생물학은 도전에 직면하고 있습니다 : 하나 이상의 세포 기관에 국한되어 단백질의 경우, 엔지니어는 동일한 유전자를 여러 번 복제해야합니다. 이 작품은이 전략에 대한 솔루션을 제공합니다 :의 mRNA의 스 플라이 싱을 활용. 이 기술은 설립 엽록체와 퍼 옥시 대상 시퀀스를 활용하고 선택적으로 접합되어 하나의 mRNA로 결합. 일부 스플 라이스 변종은 세포질에 퍼 옥시 일부, 일부, 엽록체로 전송됩니다. 여기에 시스템은 여러 세포 기관이 스 플라이 싱 타겟팅을 위해 설계되었습니다. 이 작품에서는, GFP는 EXPR이 될 것으로 예상했다합리적으로 설계된 5 &#39;의 mRNA 태그 일련의 엽록체, 세포질 및 페 록시에 essed. 이 태그는 이종 유전자가 여러 세포 내 소기관으로 표현 될 필요가있을 때 요구 복제의 양을 줄일 수있는 가능성이있다. 구문은 전작 11에 설계되었으며, 깁슨 조립체, 제한 효소를 필요로하지 않는 결찰 독립적 클로닝 방법을 사용하여 클로닝 하였다. 얻어진 플라스미드는 변형 된 유전자 총 프로토콜 benthamiana 표피 된 담배 잎 세포에 도입 하였다. 마지막으로, 형질 전환 된 잎은 공 초점 현미경으로 관찰 하였다.

디자인 노력은 중요한 계획의 결과였다. 이 프로젝트에 대한 소설은 발현 된 단백질로 번역되는 사전의 mRNA를 만들 수있는 스 플라이 싱의 사용이다. 이들 단백질은,이 경우, 다른 세포 기관에서 발현되는 엽록체, 페 록시 및 / 또는 시토 졸. 우리는 선택적으로 6 접합되어 자연 애기 장대의 유전자를 적응하고, (TriTag-1과 TriTag-2) 대체 엑손의 시퀀스를 대상으로 엽록체 6 페 록...

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

연구

환경과학

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

바이오 기반 산업을위한 원료로 담배 나무와 포플러의 평가에 대한 성적 증명서 및 대사 산물 프로파일

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

형광 파우더를 사용하여 소매 환경에서의 미생물 오염을 추적 - 소매 델리 카트슨 환경 예

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

클래스 1 Integrons 유전자 카세트 식품을 선별

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

땅콩에서 아플라톡신의 RNAi를 매개 제어 : 방법은 땅콩에 곰팡이 독소 생산 및 형질 전환 유전자 발현을 분석 /<em&gt; 아스 페르 길 루스</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

해양 모델-따개 비 Balanus improvisus 경작 및 유전자 발현

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

분리 된 잎 어설아는 곤충 만두카 sexta를 츄잉에 의해 감염 하는 동안 감자에 유전자 발현 연구를 단순화 하기 위해

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

순수 낙엽 스탠드에서 세 가지 뚜렷한 방법을 사용한 잎 영역 지수 추정

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...