Name: combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2014-10-16T14:00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.c

Эта работа была частично поддержана грантом R00AG031911 из Национального института по проблемам старения из Национального института здоровья в УМХ содержание этой статьи не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здравоохранения.

<ol>
	<li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability,+cancer+and+aging.">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).</li><li>Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+DNA+replication+and+recombination+activities+in+the+maintenance+of+genome+stability.">Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability.</a> J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).</li><li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metab. 16, 18-31 (2012).</li><li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer.">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li><li>Madia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1/Polzeta-dependent+mechanism.">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11, 599-606 (2012).</li><li>McMurray, M. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-induced+switch+to+a+hyper-recombinational+state.">An age-induced switch to a hyper-recombinational state.</a> Science. 301, 1908-1911 (2003).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5&amp;#34;-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5&amp;#34;-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).</li><li>Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAN1+locus+of+Saccharomyces+cerevisiae:+fine-structure+analysis+and+forward+mutation+rates.">The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates.</a> Genetics. 91, 35-51 (1979).</li><li>Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother+enrichment+program:+a+genetic+system+for+facile+replicative+life+span+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 183, 413-422 (2009).</li><li>Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+age+induces+mitotic+recombination+in+the+ribosomal+RNA+gene+cluster+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).</li><li>Feser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+histone+expression+promotes+life+span+extension.">Elevated histone expression promotes life span extension.</a> Mol Cell. 39, 724-735 (2010).</li><li>Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+circuit+for+selectively+arresting+daughter+cells+to+create+aging+populations.">A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations.</a> Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).</li><li>Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+transcriptional+silencing+causes+sterility+in+old+mother+cells+of+S.+cerevisiae.">Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae.</a> Cell. 84, 633-642 (1996).</li><li>Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+reactive+oxygen+species+begin+early+during+replicative+aging+of+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).</li><li>Dang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+lysine+16+acetylation+regulates+cellular+lifespan.">Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan.</a> Nature. 459, 802-807 (2009).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14, 115-132 (1998).</li><li>Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposition+is+associated+with+genome+instability+during+chronological+aging.">Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).</li><li>Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+analysis+CalculatOR:+a+web+tool+for+the+determination+of+mutation+rate+using+Luria-Delbruck+fluctuation+analysis.">Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis.</a> Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+estimator+of+mutation+rates.">A robust estimator of mutation rates.</a> Mutat Res. 661, 101-109 (2009).</li><li>Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+inheritance+of+oxidatively+damaged+proteins+during+cytokinesis.">Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis.</a> Science. 299, 1751-1753 (2003).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Микроорганизмы, такие как дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE, являются отличным примером для исследования частота мутаций, но эти модели не были полностью использованы для расследования накопление мутаций во время митотического старения клеток. Накопление мутаций в ядерном геноме была выдвинута гипотеза, внести свой ​​вклад в старение по в результате прогрессирующей потерей (или изменения) генов функций 1. Возможность использования микробной системы для изучения механизмов и последствий накопления мутаций в процессе старения может значительно ускорить идентификацию генетических и экологических факторов, влияющих на этот процесс, потому что в легковесных генетических систем и легкость количественного редкие фенотипические изменения в микроорганизмов. Факторы репарации ДНК и белки реакции на повреждения ДНК хорошо сохраняется по разнообразным видам 2, и фундаментальные сходства в организменном старения были определены для организмов, как разнообразны, как S. CEREVISIAEд млекопитающие 3, что делает его, вероятно, что результаты, полученные при изучении в дрожжах будут иметь отношение к старению во многих организмов. Исследования старения в S. CEREVISIAE использование двух стареющих моделей, которые измеряют хронологического старения или репликативной старение клеток. Хронологического старения характеризуется прогрессирующей потерей жизнеспособности популяций дрожжевых клеток, которые в не-деления государственной (неподвижной фазы) в связи с питательной истощения 3. Хронологическое старение модель была использована, чтобы продемонстрировать, что мутации накапливаются с возрастом 4, так как крупные клеточные популяции легко получить в этой модели для выполнения выбора фенотипических для мутантных клеток. В этом случае, появляется накопление мутаций под влиянием роста-сигнальных путей и окислительного стресса 5, и каждый из этих факторов имеет отношение к пониманию старения в многоклеточных эукариот 3. Репликативная модель старения использует асимметричную DIVISIна между S. CEREVISIAE мать и дочь клетки для исследования старения, которое происходит с последовательными клеточных поколений 3. Дрожжи репликативная старение часто измеряется через микроманипуляций малых популяций матери и дочерних клеток, или совсем недавно, через видеомикроскопии малых популяций дрожжевых клеток в микрофлюидных устройств 6,7. Ограниченные размеры населения делают эти подходы плохо подходит для исследования накопления мутаций во время митотического старения, если информация целого генома, полученного от отдельных клеток или генетические изменения очень высокой частоты измеряются 8. Всего-секвенирование генома отдельных клеток обеспечивает существенные наборы данных для исследования накопления мутации, но фенотипические системы селекции имеют важное преимущество, обеспечивая средства измерения частота мутаций изучать механизмы, лежащие накопления мутаций. Исследования изучить мутации частоты и цены через фенотипических выборов в haploiд штаммы дрожжей во время репликативного старения еще не поступало. Частота мутаций обычно измеряется с помощью флуктуационных испытания 9. Значения частоты мутаций отражают общее число клеток, несущих мутацию в последовательности гена в популяции. Это включает в себя клетки, в которых происходят независимые мутации и любое потомство этих клеток, что просто наследуют уже существующие мутации. В отличие от этого, уровень мутаций, измеренные с помощью флуктуационных испытаний представляют число независимых мутаций, которые вновь возникают при каждом поколении клеток. Эти тесты обычно включают прививки много культур репликации при низких плотностях клеток, чтобы уменьшить вероятность добавления клетки с уже существующими мутаций в последовательности-мишени, выращивание культур почти до насыщения, и идентификации мутантных клеток ростом на селективной среде. Цифры из мутантных клеток, выявленных в повторных населения используются затем в одном из нескольких математических моделей для оценки количества Independent мутации, возникшие в процессе роста 9. Сравнение число независимых мутаций, чтобы средний размер популяции обеспечивает измерение частоты мутаций. В S. CEREVISIAE, мутация частоты и цены часто измеряется с помощью URA3 и CAN1 гены, так как с потерей функции мутации в этих генах производят выбираемые фенотипы. Потеря функции URA3 оказывает клеток, устойчивых к 5-fluoroorotic кислоты (5-FOA), так как белок, кодируемый URA3 преобразует к 5-FOA в молекуле токсичного 10. Потеря функции CAN1 позволяет клеткам, чтобы стать устойчивым к канаванин, токсичного аналога аргинин, так как белок, кодируемый CAN1 транспортирует аргинина и канаванин в клетки 11. Оба генетические и физические стратегии сортировки были успешно использованы для получения более крупных популяций S. CEREVISIAE материнские клетки для облегчения расследования репликативного старения. Генетические стратегии включают умные подходы, которые выбирают против выживания дочь клеток в популяции. Программа мать обогащение (МООС) включает бета-эстрадиол индукцию экспрессии рекомбиназы Cre только в дочерних клеток, что приводит к дочери конкретных нарушению двух важных генов, которые были спроектированы, чтобы содержать LoxP сайтов 12. Штаммы MEP можно выращивать как правило, в отсутствие индуктора, но только мать клетки будут продолжать разделить после индукции, в то время как дочерние клетки будут задержать в М-фазе, как правило, в течение первого прохождения по клеточного цикла 12. Хотя эта система не использовалась в широко изучать накопление мутаций во время старения, он был использован для изучения потерю гетерозиготности, относительно частой формой нестабильности генома в диплоидных дрожжевых штаммов, а также биохимические изменения в старение материнских клеток 13,14. Аналогично, система дочь-разрядник включает дочь конкретных экспрессии S. cereviГен SIAE URA3 15. Штаммы дочери-разрядника нормально расти до тех пор, 5-FOA не будет добавлен к среде, после чего дочерние клетки, экспрессирующие URA3 умрет, в то время как материнские клетки продолжают расти 15. Эти полезные системы для обогащения материнских клеток, но они зависят от поддержания функций генов, которые составляют систему отбора. Случайные мутации в одном или нескольких компонентов системы отбора может привести к дочерним клеткам, которые ускользают от выбора и пролиферируют в геометрической прогрессии. Во время развития штаммов MEP, соответствующие размеры населения были полны решимости избежать появления мутантных дочерних клеток, которые могли бы спастись выбор 12. Однако этот предел численности населения ставит под угрозу обнаружение редких форм нестабильности генома в ходе репликативного старения. Это ограничение на численность населения может быть частично преодолена за счет использования диплоидных штаммов дрожжей с две копии каждого гена вклад в систему отбора, так как большинствомутации, вероятно, будет рецессивным 12. Тем не менее, использование диплоидных штаммов ограничивает типы мутационных событий, которые могут быть легко обнаружены по сравнению с теми, которые могут быть легко обнаружены в гаплоидных дрожжевых клеток. Физические стратегии сортировки включают выделение материнских клеток с меченым поверхности клетки от немеченых дочерних клеток для обогащения крупных популяций материнских клеток. Тот факт, что на поверхности клеток белков (протеины клеточной оболочки) из S. CEREVISIAE дочь клетки вновь синтезированный во время бутонизации эксплуатируется маркировать материнские клетки без маркировки дочерние клетки, которые они производят 16. Например, начальная популяция дрожжевых клеток, меченных на их поверхности с биотином могут быть выращены и затем выделены из их дочерних клеток с использованием анти-биотин микрошарики и магнитной сортировки 16, потому что дочерние клетки, полученные от начальной популяции не будет содержать биотин на их поверхности . Серийный рост исортировка позволяет постепенно старшего популяции материнских клеток, которые будут получены и проанализированы. Эта процедура успешно используется для изучения изменений в физиологии клетки и экспрессии генов в ходе репликативного старения дрожжей 13,14,17,18. Текущий метод адаптируется этот биотин маркировку и методом магнитной сортировки для обогащения материнских клеток с целью измерения накопления потенциально редких мутаций или других форм нестабильности генома анализировали через фенотипических выборов. Серийный рост и физическое сортировка позволяют анализ накопления мутаций в постепенно старых материнских клеток, а также в их популяции дочерних клеток. Определение мутаций ставок на поколение позволяет предсказать частота мутаций рассчитываться для материнских клеток, которые подверглись определенное количество клеточных делений. Поскольку прогнозируемые значения частоты основаны на ожидаемом росте за счет дополнительных раундов деления клеток, существенных отклонений в наблюдаемых mutatiна частотах по сравнению с прогнозируемыми значениями предоставить доказательства для возрастных изменений в размере накапливающихся мутаций. Используя этот протокол, люминесцентные окрашивание почек шрамов, которые соответствуют сайтах клеточных делений на материнских клетках в сочетании с анализом методом проточной цитометрии могут быть использованы, чтобы быстро определить возрастное распределение отсортированных и неотсортированных населения. Дополнительные реактивы флуоресцентные, такие как те, которые используются для обнаружения активных форм кислорода, также могут быть использованы в течение этого протокола. В целом, этот протокол позволяет эффективно анализ возрастных изменений в нестабильности генома с потенциалом для корреляции с возрастными клеточных физиологических изменений в качестве модельного организма хорошо подходит для изучения генетических и экологических факторов, которые влияют, связанные со старением нестабильность генома.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:359px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21335</td>
			<td style="width:359px;">100mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Biotin Microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-485</td>
			<td style="width:359px;">2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS LS columns</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:359px;">25 columns suitable for QuadroMACS separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuadroMACS separator</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td style="width:359px;">Separator Only</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">QuadroMACS Starting Kit</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-051</td>
			<td style="width:359px;">Includes:&#160; QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD Falcon Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:359px;">40 &#181;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes.&#160; 50 per pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td style="width:359px;">Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">W11261</td>
			<td style="width:359px;">Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces CEREVISIAE был превосходным модельной системой для изучения механизмов и последствий нестабильности генома. Информация, полученная из этого дрожжевого модели уместна для многих организмов, включая человека, так как репарации ДНК и реагирования повреждение ДНК факторы хорошо сохраняется в самых разнообразных видов. Тем не менее, С. CEREVISIAE еще не используется в полной мере решать, является ли скорость накопления мутаций изменения с увеличением репликативной (митотических) возраста в связи с техническими ограничениями. Например, измерения дрожжей репликативной продолжительности жизни через микроманипуляций привлечь очень маленькие популяции клеток, которые запрещают обнаружение редких мутаций. Генетические методы для обогащения материнских клеток в популяциях, вызывая гибель дочерних клеток были разработаны, но размеры населения по-прежнему ограничен частотой, с которой случайные мутации что подвергает риску системы отбора произойти. Текущий протокол использует преимущества магнитного Sortiнг поверхностных меченных дрожжи материнских клетках, чтобы получить достаточно большие популяции пожилая мать клетки количественно редкие мутации через фенотипических выборов. Мутация ставки, измеренные через флуктуации испытаний, и частоты мутаций устанавливаются сначала для молодых клеток и используется для прогнозирования частоты мутаций в материнских клетках различных репликативных возрастов. Частоты мутаций затем определяются для отсортированных материнских клеток, и возраст материнских клеток определяется с помощью проточной цитометрии при окрашивании флуоресцентным реагентом, который обнаруживает бутон шрамы, сформированные на их поверхности клеток во время деления клетки. Сравнение прогнозных частот мутаций в зависимости от количества клеточных делений в частотах экспериментально наблюдаемых для материнских клетках данного репликативного возрасте может определить, есть ли возрастные изменения в скорости накапливающихся мутаций. Вариации этого базового протокола предоставляют средства для изучения влияния изменений в конкретных генных функций иликонкретные экологические условия на накопления мутаций обратиться механизмы, лежащие нестабильность генома в ходе репликативного старения.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.c

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Сочетание Magnetic сортировка материнские клетки и колебания испытаний для анализа геномной нестабильности Во время митотического клеточного старения в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Мутация ставки в молодые Saccharomyces CEREVISIAE клеток измеренных через флуктуации испытаний используются для прогнозирования частоты мутаций для материнских клетках различных репликативных возрастов. Магнитная сортировка и проточной цитометрии затем используются для измерения фактических частот мутаций и возраст материнских клеток для выявления любых отклонений от прогнозируемых частот мутаций.

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Липидов везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных Активированный сортировки клеток (LIMACS): новый метод для анализа Белково-липидные взаимодействия

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Изучение, зависящими от возраста геномной нестабильности использованием С. CEREVISIAE Хронологические Модель продолжительность жизни

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Изоляция Кишечныеинфекции стволовых клеток из взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Midguts по FACS для изучения стволовых клеток Поведение в процессе старения

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Быстрая идентификация химических генетических взаимодействий в<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Направленный метод Эволюция<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em&gt;: Mutant Создание и скрининг библиотеки

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...