Name: a high content imaging assay for identification of botulinum neurotoxin inhibitors
Uploaded: 2014-11-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors at JoVE.com

Funding was provided by the Joint Science and Technology Office &#8211; Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).

תאי הגזע העובריים של עכבר צלחת 20,000 הבדיל (MES) / גם ב96 צלחות ליזין מצופה פולי-D היטב ולשמור בתקשורת בידול מסוף הנוירון מוטורי 5-7 ימים. מנהל 1. מתחם ושיכרון בונט / לבצע את כל העבודה הבאה במתחם BSL2 על מנ?...

<ol>
	<li>Lamanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+most+poisonous+poison.">The most poisonous poison.</a> Science. 130, 763-772 (1959).</li><li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene.">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> J. Infect. Dis. , (2013).</li><li>Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+ground:+assays+for+therapeutics+against+botulinum+neurotoxin.">Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin.</a> Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).</li><li>Yersin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+synaptic+vesicle+fusion+proteins+explored+by+atomic+force+microscopy.">Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).</li><li>Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+sensors+to+detect+botulinum+neurotoxin+activity+in+vitro+and+in+living+cells.">Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).</li><li>Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+botulism+therapeutic+product+development+in+the+Department+of+Defense.">Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense.</a> Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).</li><li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+to+measure+botulinum+neurotoxin+serotype+A+activity+using+cleavage-sensitive+antibodies.">Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies.</a> Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).</li><li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemotype+that+inhibits+three+unrelated+pathogenic+targets:+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+light+chain,+P.+falciparum+malaria,+and+the+Ebola+filovirus.">A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus.</a> Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).</li><li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene+derivatives+providing+submicromolar-range+inhibition+of+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+metalloprotease.">The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease.</a> European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).</li><li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacophore+Refinement+Guides+the+Rational+Design+of+Nanomolar-Range+Inhibitors+of+the+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Metalloprotease.">Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease.</a> ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).</li><li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem cell research. 6, 195-205 (2011).</li><li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+targeting,+internalization,+and+biological+activity+of+a+recombinant+atoxic+derivative+of+botulinum+neurotoxin+A.">Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).</li><li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel,+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research.">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+modulation+of+the+botulinum+neurotoxin+protein-conducting+channel.">Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).</li></ol>

העוצמה הגבוהה של עצבי טוקסין והקלות היחסית של חימושם הביאה סיווגם כקטגוריה (העדיפות הגבוהה ביותר) סוכני biothreat על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן. למרבה הצער, אין FDA אישר תרופה נגד שכרות בונט לאחר רעלן הופנם על ידי תאי העצב המוטוריים. כל מנגנון druggable שמקדם את ההח?...

טוקסין החיידק Clostridium מייצר רעל עצב טוקסין, אחד מהרעלים הביולוגיים החזקים ביותר הידוע לאדם 1. ישנם 7 קפסיד bont מובהקים (בונט / AG). בונט / A-גאל לגרום שיתוק בצומת העצבית-שהרירית בשל proteolysis המורכבת מלכודת 2,3. proteolysis המלכודת מונעת איחוי שלפוחית-קרום מוליך עצבי, ולכן לוקים הנוירוטרנסמיטר exocytosis 4. יעד המלכודת הספציפי תלוי בסרוטיפ bont המסוים המעורב בתהליך שכרות. בונט / וונט / E תדבק SNAP-25 ואילו דבק בונט / C שני SNAP-25 וsyntaxin 5. Synaptobrevin ידבק קפסיד הנותרים (המכונה גם חלבון הקרום קשור-שלפוחיות (נצלנית). בונט / נבחר לפיתוח assay כפי שהוא אחראי לשיעור גבוה של בוטוליזם באופן טבעי ויש לו משך הזמן הארוך ביותר של פעולה 6. פיתוח של מולקולה קטנה תרופות נגד ונט / היא מטרה עיקרית לתכנית גילוי תרופות ו נצלה שיטות המבוסס על יעד מסורתיים לזהות מעכבי proteolytic האתר פעילים 7, 8-10. עם זאת, היצירה של מעכבי אתר פעילים עם פעילות קשת רחבה נגד קפסיד מרובה ויעילות לאחר החשיפה צפויה להיות מאתגרת. לכן יש לנו יישמתי גישה חדשנית, פנוטיפי תרופת גילוי שמשתמשת במחשוף בונט SNAP-25 כנקודת סיום פונקציונלית לזהות מולקולות קטנות שיכול לחסום שיכרון הנוירון מוטורי בתיווך בונט. SNAP-25 נדרש לשחרור הנוירוטרנסמיטר, כהשפלה של SNAP-25 הוא חיזוי של שיתוק וקטלני in vivo. לדוגמא, הקרנה מבוססת תאים עלולה להוביל לגילוי של מאפננים חדשים של גורמים הסלולר אחראים לאיון רעלן או עיכוב של מסלולי רעלן בתוך תאים ממוקדים. גורם חשוב בהתפתחות assay פנוטיפי הוא הבחירה של מודלים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. Wדואר ואחרים תארו את הנוירונים עכבר גזע עוברי (ES) שמקורן בתאים מנוע כי לשחזר את האופי החיסוני של תאי עצב מוטוריים ראשוניים, ובכלל זה הביטוי של SNAP-25 11- 13. חשוב לציין, המערכות הסלולריות אלה רגישות מאוד לונט / שיכרון ולהפגין מחשוף תלוי-מינון של SNAP-25 בתגובה לגידול בריכוזי של רעלן 11,12. הנוירונים המוטוריים המובחן גם הם מיוצרים בכמויות שמספיקות לניתוח מבוסס צלחת תפוקה גבוהה ואפשרו את העיצוב של מערך של מבחני סלולריים. Assay פנוטיפי הוא שיטת immunofluorescence ניצול שני נוגדנים שונים לכמת מחשוף של באורך מלא בא לידי ביטוי באופן אנדוגני SNAP-25 במהלך ונט / שיכרון של תרבות הנוירון מוטורי עכבר. מסוף carboxyl ונט / נוגדן מחשוף רגיש (BACS) שמכיר באורך מלא רק SNAP-25 מאפשר ההערכה של bont proteolysis תיווך / של SNAP-25ביטוי במנוע עכבר נוירונים 10. תרשים סכמטי של assay HCI מתואר באיור 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:280px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Botulinum neurotoxin A&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;">No catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microtitre plates</td>
			<td style="width:180px;">Greiner&#160;</td>
			<td style="width:119px;">655946</td>
			<td style="width:280px;">Poly-D-Lysine 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BACs antibody</td>
			<td style="width:180px;">Lampire Biological</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microchem</td>
			<td style="width:180px;">National&#160;</td>
			<td style="width:119px;">0255</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Methanol</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A412-20</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28908</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Horse serum</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16050</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PE JANUS MDT Mini Automated Workstation</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">AJMDT01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opera</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td>OP-QEHS-01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BIII tubulin antibody</td>
			<td style="width:180px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">BAM1195</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween 20</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342dye&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">3570</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antimouse IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21236</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Anti rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10042</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Columbus Image analysis software</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 2.4</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Spotfire</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 5.5</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Clorox bleach</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18-861-284</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PlateStack</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high content imaging assay for identification of botulinum neurotoxin inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

נתונים מפקדים גבוהים ונמוכים יצרו שתי אוכלוסיות נפרדות עם ההבדל של שני חציונים עולה על 3 סטיות תקן (איור 7 א). המטרה של תהליך המיון היא למצוא תרכובות באוכלוסיית המדגם עם ערכים קרובים יותר לאוכלוסיית ביקורת חיובית, בהנחה של התפלגות נורמלית באוכלוסיית המדגם <stro...

Watch this Scientific Journal Video about A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors at JoVE.com

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

הדמיה תפקודית של השמיעתי Cortex בחתולים בוגרים באמצעות גבוהה שדה fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

ברזולוציה גבוהה<em&gt; In vivo</em&gt; פרוטוקול פילוח ידני לאדם בהיפוקמפוס תת תחומים באמצעות הדמיה בתהודה מגנטית 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

רקמת ריאה, כלי דם וחילוף חומרים בתדר גבוהים לא פולשני אולטראסאונד וphotoacoustic עכברוש Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

הדמיית תהודה מגנטית מבנית ברזולוציה גבוהה של תת-הקליפה&quot; האדם<I&gt; In vivo</I&gt; ולאחר המוות

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...