Name: the neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.

REMARQUE: Conception, réalisation et l&#39;enregistrement de l&#39;expérimentation animale devraient tenir compte des lignes directrices actuelles 24. Ce travail doit être approuvée à l&#39;avance par l&#39;autorité de protection des animaux locale (dans notre cas, le Comité d&#39;éthique animale de l&#39;Université de Sydney). 1. L&#39;euthanasie de l&#39;animal et Muscle Dissection <ol><li> Transférer la souris à partir de la salle d&#39;attente dans une salle séparée où il est eutha...

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	<li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin/ErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+&#945;-dystrobrevin.">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of &#945;-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li><li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability.">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li><li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions.">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663 (2012).</li><li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise.">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li><li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation).">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li><li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse.">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li><li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals.">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li><li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles.">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640 (2012).</li><li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice.">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li><li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice.">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li><li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles.">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li><li>Gerv&#225;sio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse.">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li><li>Gerv&#225;sio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability.">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li><li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gerv&#225;sio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse.">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li><li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gerv&#225;sio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction.">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li><li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors.">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li><li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice.">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li><li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia:+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects.">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li><li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyridostigmine+but+not+3,4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody.">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li><li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction.">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li><li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise.">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970 (2013).</li><li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412 (2010).</li><li>Shimizu, S., Hedrich, H. J., Bullock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+Administration.">Routes of Administration.</a> The Laboratory Mouse. , (2004).</li><li>Chiasson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory anatomy of the white rat. , (1988).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein,+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A.">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li><li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices.">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li><li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+&#945;-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+&#945;-bungarotoxin+revealed+by+NMR).">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by &#945;-neurotoxins and species-specific resistance to &#945;-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li><li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Specific+Kinase:+Organiser+of+synaptic+membrane+domains.">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li><li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+&#946;2-adrenoceptor+agonist,+albuterol,+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis.">Effects of the &#946;2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840 (2014).</li><li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types.">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li><li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction.">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li><li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy.">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li><li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li></ol>

Les protocoles décrits ici nous ont permis de mesurer de manière fiable et quantifier les changements dans les propriétés de la NMJ toute une gamme de conditions, notamment le vieillissement et les maladies états normaux. Les méthodes décrites pour en Face images NMJ permettront aux chercheurs de comparer le domaine des spécialisations pré- et post-synaptiques et la région synaptique de chevauchement / alignement. Pour comparer l&#39;intensité relative des protéines pré- et post-synaptiques le deuxième pro...

La jonction neuromusculaire (JNM) est la synapse de relais essentiel qui médie la communication entre le système nerveux et le muscle squelettique. Il est nécessaire pour tout mouvement volontaire. La microscopie à fluorescence a longtemps été utilisé pour étudier les effets des transgènes sur la souris NMJ 1-3 ou de comparer les effets de l&#39;âge, l&#39;alimentation, l&#39;exercice et la maladie sur NMJs de rongeurs 4-11. Ces études nous ont beaucoup appris sur la physiologie et la physiopathologie de la NMJ, mais les divers paramètres déclarés (par exemple, la zone AChR, zone flasque, longueur du périmètre, indices de fragmentation) font qu&#39;il est souvent difficile de comparer les résultats de ces études. Il ya une attente de plus en plus pour les chercheurs précliniques pour pouvoir démontrer la reproductibilité, en particulier dans les études avec des modèles de rongeurs de la maladie 12. Les protocoles décrits ici ont été affinées par une série d&#39;études qui a enquêté ch développement, physiologique et physiopathologiqueAnges à l&#39;NMJ. Ces études nécessitent la mesure de la zone de spécialisations synaptiques à la plaque motrice de la souris et de la densité relative de l&#39;emballage de protéines synaptiques dans les spécialisations post-synaptiques 13-15. L&#39;utilité de ces méthodes est illustrée par des études récentes dans un modèle de souris de l&#39;anti-MuSK myasthénie. Injections quotidiennes d&#39;IgG de myasthénie anti-MuSK positif gravis patients dans des souris adultes causés à devenir faible dans les deux semaines 16. Confocale images maximale de projection de sections musculaires qui ont été doublement marquée pour la synaptophysine (en nerveuses terminaux) et post-synaptiques AChR révélé un déclin progressif dans le domaine de AChR coloration que le principal changement. Surtout le taux de déclin était suffisante pour expliquer les baisses comparables dans l&#39;amplitude des potentiels synaptiques, l&#39;échec de la transmission synaptique et une faiblesse musculaire 17,18. Qualitativement résultats similaires ont été rapportés par d&#39;autres groupes de recherche10,19. Les mêmes méthodes de mesure NMJ ont depuis été utilisés pour évaluer l&#39;impact de trois médicaments pour le traitement anti-MuSK myasthénie grave dans ce modèle de souris 20,21. Vieillissement sédentaire peut conduire à la perte de connexions neuromusculaires. Les protocoles décrits ici ont révélé une baisse liée à l&#39;âge dans le domaine de terminaison nerveuse synaptophysine à plaques motrices que les souris progressent dans la vieillesse. Les mêmes méthodes ont révélé que l&#39;exercice volontaire pourrait largement éviter la réduction de nerf présynaptique zone de la borne 22, en accord avec les travaux antérieurs par d&#39;autres groupes 4. Perte de connexions neuromusculaires se produit également dans le modèle de la souris SOD1G93A de la sclérose latérale amyotrophique 9,23. Les études mentionnées ci-dessus démontrent que une variété de conditions de santé peut conduire à des réductions dans le domaine de spécialisation soit pré- ou post-synaptiques au NMJ. Cela peut entraîner dans l&#39;amusement synaptique altéréection ou peut annoncer une perte complète de la connexion neuromusculaire. Trois protocoles sont décrits qui permettent la quantification de la superficie et de la densité de spécialisations synaptiques. Le but du premier protocole est de fournir une mesure pratique et reproductible des zones de pré et post-synaptiques spécialisations et leur alignement au NMJs mammifères, en utilisant la microscopie de fluorescence. Images bidimensionnelles projection confocale maximales et analyse d&#39;image avec les NIH ImageJ est utilisé pour détecter des changements dans le domaine de la coloration (synaptophysine des vésicules synaptiques), AChR post-synaptiques et de la zone de chevauchement synaptique. Paramètres d&#39;imagerie confocale (gain et décalage de niveau) sont optimisés pour chaque NMJ de façon à maximiser l&#39;information visuelle utilisée pour discerner le domaine de spécialisation synaptique. Insuffisance neuromusculaire peut également résulter de changements dans la densité post-synaptique du CCRS et / ou d&#39;autres protéines synaptiques. Le deuxième protocole peut être appliqué à détecter les changements dans la densité relative de ces protéines postsynaptiquesque le musc, rapsyne, dystroglycane, phosphorylée kinase Src et phosphorylée AChR 18,21. Dans la myasthénie grave, une densité réduite de AChR dans la membrane post-synaptique est la cause immédiate de l&#39;insuffisance synaptique et une faiblesse musculaire. Le troisième protocole décrit une méthode Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour évaluer les changements dans la proximité de AChR adjacentes dans des membranes post-synaptiques 14,15. Cette méthode détecte transfert d&#39;énergie entre AChR voisins marqués par fluorescence-α-bungarotoxine (BGT). FRET se produit uniquement lorsque les sondes fluorescentes donneur et accepteur sont à moins de 10 nm de l&#39;autre. Cela peut révéler (microscopiques) des changements dans l&#39;étanchéité de AChR emballage qui peuvent être directement liés à l&#39;amplitude des potentiels synaptiques. Ces trois protocoles, raffinés au cours de la dernière décennie, fournissent des mesures complémentaires d&#39;intégrité NMJ d&#39;une manière cohérente et reproductible. Utilisation de protocoles normalisés unend paramètres devraient faciliter la comparaison des effets des gènes et des interventions environnementales sur le NMJ mammifères.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:341px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:91px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">DM IRE2 with&#160; TCS SP2 system</td>
			<td>Most scanning confocal microscopes should be suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:91px;">Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:91px;">Leica</td>
			<td>SPE-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT)</td>
			<td style="width:91px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">B35451</td>
			<td>Used for labelling AChRs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Alexa647-&#945;-bungarotoxin (far-red-BGT)</td>
			<td style="width:91px;">Life technologies</td>
			<td>B35450</td>
			<td>Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">rabbit anti-synaptophysin</td>
			<td style="width:91px;">Life technologies</td>
			<td>18-0130</td>
			<td>Different batches of primary antibody differ in effective working dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">FITC-anti-rapsyn mab1234</td>
			<td>Milipore</td>
			<td style="width:119px;">FCMAB134F</td>
			<td>Monoclonal antibody conjugated to FITC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">FITC-donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:91px;">Jackson</td>
			<td>711-095-152</td>
			<td>Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.)</td>
			<td style="width:91px;">ProSciTech</td>
			<td>IA018</td>
			<td>Cryostat embedding matrix for freezing&#160; muscles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">10981</td>
			<td>Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy

La jonction neuromusculaire (JNM) est le grand, le relais synapse cholinergique par lequel les neurones moteurs de mammifères contrôlent contraction des muscles volontaires. Les changements structurels au NMJ peuvent entraîner l&#39;échec de la neurotransmission, résultant dans la faiblesse, l&#39;atrophie et même la mort de la fibre musculaire. De nombreuses études ont étudié comment les modifications génétiques ou de maladies peuvent modifier la structure de la jonction neuromusculaire de la souris. Malheureusement, il peut être difficile de comparer directement les résultats de ces études parce qu&#39;ils travaillent souvent différents paramètres et les méthodes analytiques. Trois protocoles sont décrits ici. La première utilise la projection d&#39;intensité maximale images confocales pour mesurer la surface des récepteurs de l&#39;acétylcholine (RACh) riche domaines membranaires post-synaptiques à la plaque d&#39;extrémité et la surface de la vésicule synaptique coloration dans la terminaison nerveuse présynaptique sus-jacente. Le deuxième protocole compare les intensités relatives des immunocoloration des protéines synaptiques dans la membrane post-synaptique. La troisième protocole utilise Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour détecter les changements dans l&#39;emballage d&#39;AChR post-synaptiques à la plaque d&#39;extrémité. Les protocoles ont été développé et affiné au cours d&#39;une série d&#39;études. Les facteurs qui influencent la qualité et la cohérence des résultats sont discutés et données normatives sont fournis pour NMJs chez les jeunes souris adultes en bonne santé.

Mesure de Synaptic zone au NMJ Toute estimation de la zone repose sur le dessin d&#39;une frontière à définir l&#39;étendue de spécialisations synaptiques. Chez les jeunes adultes en bonne santé muscles images NMJ devraient afficher limites bien définies à la fois pour AChR et synaptophysine coloration (figure 2A et B). L&#39;intensité de fluorescence à la fois pour la synaptophysine AChR et augmente brusquement à la limite entre ...

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The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Etudier Piscines vésicules synaptiques utilisant des colorants styryle photoconversion

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Recherche

Neurosciences

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection et l&#39;imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Détection de<em&gt; In Situ</em&gt; complexes protéine-protéine à la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Chargement d&#39;un colorant de calcium dans les terminaisons nerveuses de la grenouille à travers le souche nerveuse: Inscription transitoire de calcium dans la jonction neuromusculaire de la grenouille

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Évaluation de la densité de la Synapse dans des tranches de cerveau de rongeurs hippocampe

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Indicateurs synapses uniques de la libération et de l’absorption des glutamates dans les tranches cérébrales aigues des souris normales et huntingtones