Name: the neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.

NOTA: El diseño, la realización y presentación de informes de los experimentos con animales deben tener en cuenta las directrices actuales 24. Este tipo de trabajo debe ser aprobado previamente por la autoridad local de protección de los animales (en nuestro caso, el Comité de Ética Animal de la Universidad de Sydney). 1. La eutanasia del animal y la disección muscular <ol><li> Transferir el ratón desde la sala de espera a una habitación separada donde se practicó la eutanasia con una inye...

<ol>
	<li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin/ErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+&#945;-dystrobrevin.">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of &#945;-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li><li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability.">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li><li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions.">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663 (2012).</li><li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise.">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li><li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation).">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li><li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse.">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li><li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals.">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li><li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles.">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640 (2012).</li><li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice.">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li><li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice.">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li><li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles.">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li><li>Gerv&#225;sio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse.">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li><li>Gerv&#225;sio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability.">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li><li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gerv&#225;sio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse.">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li><li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gerv&#225;sio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction.">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li><li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors.">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li><li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice.">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li><li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia:+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects.">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li><li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyridostigmine+but+not+3,4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody.">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li><li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction.">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li><li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise.">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970 (2013).</li><li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412 (2010).</li><li>Shimizu, S., Hedrich, H. J., Bullock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+Administration.">Routes of Administration.</a> The Laboratory Mouse. , (2004).</li><li>Chiasson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory anatomy of the white rat. , (1988).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein,+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A.">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li><li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices.">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li><li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+&#945;-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+&#945;-bungarotoxin+revealed+by+NMR).">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by &#945;-neurotoxins and species-specific resistance to &#945;-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li><li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Specific+Kinase:+Organiser+of+synaptic+membrane+domains.">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li><li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+&#946;2-adrenoceptor+agonist,+albuterol,+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis.">Effects of the &#946;2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840 (2014).</li><li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types.">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li><li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction.">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li><li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy.">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li><li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li></ol>

Los protocolos descritos aquí nos han permitido medir y cuantificar los cambios en las propiedades de la UNM en toda una serie de condiciones, incluyendo los estados normales de envejecimiento y la enfermedad. Los métodos descritos para en face imágenes NMJ permitirán a los investigadores comparan el área de especialidades pre y postsinápticos y el área de superposición sináptica / alineación. Para comparar la intensidad relativa de las proteínas pre y postsinápticos el segundo protocolo, que utiliza seccion...

La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis relé crítico que media la comunicación entre el sistema nervioso y músculo esquelético. Se requiere para todo el movimiento voluntario. La microscopía de fluorescencia se ha utilizado para estudiar los efectos de los transgenes en el ratón NMJ 1-3 o para comparar los efectos de la edad, la dieta, el ejercicio y la enfermedad en roedores NMJs 4-11. Tales estudios han enseñado mucho acerca de la fisiología y la fisiopatología de la UNM, pero los diversos parámetros informado (por ejemplo, área AChR, área de placa terminal, longitud del perímetro, los índices de fragmentación) a menudo hacen que sea difícil comparar los resultados de estos estudios. Hay una expectativa creciente de investigadores pre-clínicos para ser capaces de demostrar la reproducibilidad, en particular en estudios con modelos de roedores de enfermedad 12. Los protocolos descritos aquí fueron refinados a través de una serie de estudios que investigaron ch desarrollo, fisiológico y fisiopatológicoanges de la UNM. Tales estudios requieren la medición de la zona de especializaciones sinápticas en la placa motora terminal del ratón y la densidad relativa de embalaje de las proteínas sinápticas dentro de especializaciones postsinápticos 13-15. La utilidad de estos métodos se ilustra por estudios recientes en un modelo de ratón de anti-MuSK miastenia gravis. Las inyecciones diarias de IgG de miastenia anti-MuSK positivos gravis pacientes en ratones adultos causó que se vuelven débiles dentro de 2 semanas 16. Imágenes de máxima proyección confocal de secciones musculares que fueron etiquetados doble para sinaptofisina (en terminales nerviosas) y AChR postsinápticos revelaron una disminución progresiva en el área de tinción AChR como el principal cambio. Es importante destacar que la tasa de disminución fue suficiente para explicar la disminución comparables en la amplitud de los potenciales sinápticos, fracaso de la transmisión sináptica y debilidad muscular 17,18. Cualitativamente hallazgos similares fueron reportados por otros grupos de investigación10,19. Los mismos métodos de medición NMJ ya se han utilizado para evaluar el impacto de tres fármacos para el tratamiento de la miastenia gravis anti-MuSK en este modelo de ratón 20,21. Envejecimiento sedentario puede llevar a la pérdida de las conexiones neuromusculares. Los protocolos descritos aquí han revelado una disminución asociada a la edad en la zona de sinaptofisina terminación nerviosa en placas motoras como ratones progresan en la vejez. Los mismos métodos revelaron que el ejercicio voluntario podría evitar en gran medida la reducción de la zona de la terminal nerviosa presináptica 22, en consonancia con el trabajo previo de otros grupos 4. La pérdida de las conexiones neuromusculares también se produce en el modelo de ratón SOD1G93A de la esclerosis lateral amiotrófica 9,23. Los estudios mencionados anteriormente demuestran que una variedad de condiciones de salud puede conducir a la reducción de la superficie de cualquiera de las especialidades pre o post-sináptica en la UNM. Esto puede producir problemas para la diversión sinápticacción o puede anunciar la pérdida completa de la conexión neuromuscular. Tres protocolos se describen que permiten la cuantificación de la zona y la densidad de especializaciones sinápticas. El propósito de la primera protocolo es proporcionar una medida práctica y reproducible de las áreas de pre y post-sinápticas especializaciones y su alineación en NMJs de mamíferos, usando microscopía de fluorescencia. Confocal de imágenes de proyección máximo de dos dimensiones y análisis de imagen con NIH ImageJ se utiliza para detectar cambios en el área de tinción sinaptofisina (vesículas sinápticas), AChR postsinápticos y área de superposición sináptica. Parámetros confocal de imágenes (ganancia y nivel de compensación) se han optimizado para cada NMJ a fin de maximizar la información visual utilizado para discernir el área de especialización sináptica. Insuficiencia neuromuscular también puede resultar de los cambios en la densidad de AChR postsináptica y / o otras proteínas sinápticas. El segundo protocolo se puede aplicar para detectar cambios en la densidad relativa de las proteínas postsinápticos talescomo el almizcle, RapSyn, distroglicano, fosforilada quinasa Src y fosforilada AChR 18,21. En la miastenia gravis, una densidad reducida de AChR dentro de la membrana postsináptica es la causa inmediata del fracaso sináptica y la debilidad muscular. El tercer protocolo describe un método de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para evaluar los cambios en la proximidad de AChR adyacentes dentro de las membranas postsinápticas 14,15. Este método detecta la transferencia de energía entre AChR vecinos marcados con fluorescente-α-bungarotoxina (BGT). FRET se produce sólo cuando el donante y aceptor de sondas fluorescentes son de menos de 10 nm de distancia. Esto puede revelar cambios (submicroscópicas) en la estanqueidad de embalaje AChR que pueden relacionarse directamente a la amplitud de los potenciales sinápticos. Estos tres protocolos, refinados durante la última década, proporcionan medidas complementarias de integridad NMJ de una manera consistente y reproducible. El uso de protocolos estandarizados unaparámetros nd deben facilitar la comparación de los efectos de los genes y las intervenciones ambientales sobre los mamíferos NMJ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:341px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:91px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">DM IRE2 with&#160; TCS SP2 system</td>
			<td>Most scanning confocal microscopes should be suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:91px;">Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:91px;">Leica</td>
			<td>SPE-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT)</td>
			<td style="width:91px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">B35451</td>
			<td>Used for labelling AChRs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Alexa647-&#945;-bungarotoxin (far-red-BGT)</td>
			<td style="width:91px;">Life technologies</td>
			<td>B35450</td>
			<td>Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">rabbit anti-synaptophysin</td>
			<td style="width:91px;">Life technologies</td>
			<td>18-0130</td>
			<td>Different batches of primary antibody differ in effective working dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">FITC-anti-rapsyn mab1234</td>
			<td>Milipore</td>
			<td style="width:119px;">FCMAB134F</td>
			<td>Monoclonal antibody conjugated to FITC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">FITC-donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:91px;">Jackson</td>
			<td>711-095-152</td>
			<td>Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.)</td>
			<td style="width:91px;">ProSciTech</td>
			<td>IA018</td>
			<td>Cryostat embedding matrix for freezing&#160; muscles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">10981</td>
			<td>Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy

La unión neuromuscular (UNM) es la sinapsis relé grande, colinérgica a través del cual las neuronas motoras de mamíferos controlan la contracción muscular voluntaria. Los cambios estructurales en la UNM pueden resultar en el fracaso de la neurotransmisión, resultando en debilidad, atrofia e incluso la muerte de la fibra muscular. Muchos estudios han investigado cómo las modificaciones genéticas o enfermedades pueden alterar la estructura de la UNM ratón. Desafortunadamente, puede ser difícil comparar directamente los resultados de estos estudios ya que a menudo emplean diferentes parámetros y métodos analíticos. Tres protocolos se describen aquí. El primero utiliza la proyección de intensidad máxima imágenes confocal para medir el área de receptor de acetilcolina (AChR) ricos en dominios de la membrana postsináptica en la placa terminal y el área de tinción de las vesículas sinápticas en la terminal nerviosa presináptica suprayacente. El segundo protocolo se comparan las intensidades relativas de inmunotinción para proteínas sinápticas en la membrana postsináptica. La tercera protocol utiliza la transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (FRET) para detectar cambios en el embalaje de AChR postsinápticos en la placa terminal. Los protocolos se han desarrollado y perfeccionado a lo largo de una serie de estudios. Los factores que influyen en la calidad y la consistencia de los resultados se discuten y datos normativos se proporcionan para NMJs en ratones adultos jóvenes sanos.

Medición de Synaptic Área en la UNM Cualquier estimación del área se basa en el dibujo de un límite para definir la extensión de especializaciones sinápticas. En los músculos adultos jóvenes sanos imágenes NMJ deben mostrar los límites bien definidos, tanto para AChR y tinción sinaptofisina (Figura 2 A y B). La intensidad de fluorescencia para ambos AChR y sinaptofisina aumenta de forma pronunciada en el límite entre la porción...

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The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

El estudio de Piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Investigación

Neurociencias

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detección de<em&gt; In Situ</em&gt; Complejos proteína-proteína en la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Carga de un tinte de calcio en las terminaciones nerviosas de las ranas a través del tocón nervioso: Registro de transitorios de calcio en la unión neuromuscular de la rana

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...