Name: investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis at JoVE.com

نشكر الدكتور U. عاشري لهدية من NPY-mRFP [كدنا]. نشكر الدكاترة. MJ Kofron، L. ميتلمان، M. Shaharbani، وY. زلبرشتاين للحصول على مساعدة لا تقدر بثمن مع المجهري وصورة ويحلل. كما نشكر الدكتور جوزيف أورلي لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم إسرائيل، التي تأسست من قبل الأكاديمية الوطنية الإسرائيلية للعلوم (1139-1112 إلى RS-E).

1. إعداد RBL خلية الثقافة وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 500 مل من المتوسط ​​تعديل النسر انخفاض مستوى السكر في Dulbecco لفي (DMEM) مع 56 مل من مصل بقري جنيني (وهذا يجعل 10٪ FBS)، ثم قم بإضافة 5.5 مل من البنسلين ستربتومايسين (وهذا يجعل ~ 1٪ من الآفات...

<ol>
	<li>Abonia, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mast+cells+in+eosinophilic+esophagitis.">Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+in+allergy+and+infection:+versatile+effector+and+regulatory+cells+in+innate+and+adaptive+immunity.">Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity.</a> Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).</li><li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+controversial+role+of+mast+cells+in+tumor+growth.">The controversial role of mast cells in tumor growth.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).</li><li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells,+angiogenesis+and+cancer.">Mast cells, angiogenesis and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).</li><li>Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+immunoregulation/immunomodulation.">Mast cells and immunoregulation/immunomodulation.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).</li><li>Vries, V. C., Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+mediators+in+tolerance.">Mast cell mediators in tolerance.</a> Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).</li><li>Kirshenbaum, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+human+mast+cells+arise+from+a+progenitor+cell+population+that+is+CD34(+),+c-kit(+),+and+expresses+aminopeptidase+N+(CD13).">Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13).</a> Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).</li><li>Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells.">Mast cells.</a> Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).</li><li>Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+biology:+introduction+and+overview.">Mast cell biology: introduction and overview.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).</li><li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+mast+cell+activation.">Molecular regulation of mast cell activation.</a> J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).</li><li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+mast+cell+activation.">Molecular regulation of mast cell activation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).</li><li>Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agents+that+release+histamine+from+mast+cells.">Agents that release histamine from mast cells.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).</li><li>Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-dependent+down-regulation+of+antigen-specific+immune+responses+by+mosquito+bites.">Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites.</a> J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).</li><li>Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+evades+the+extracellular+antimicrobial+activity+of+mast+cells+by+promoting+its+own+uptake.">Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake.</a> J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).</li><li>Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+Toll-like+receptor+4+and+mast+cell-dependent+innate+immunity+responses.">Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses.</a> IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).</li><li>Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin+E-Toll-like+receptor+network.">The immunoglobulin E-Toll-like receptor network.</a> Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).</li><li>Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+adenosine+receptors+function:+a+focus+on+the+a3+adenosine+receptor+and+inflammation.">Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation.</a> Front Immunol. 3, 134 (2012).</li><li>Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+mast+cell+mediators+and+the+pathogenesis+of+inflammation.">Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation.</a> Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).</li><li>Caughey, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+proteases+as+protective+and+inflammatory+mediators.">Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).</li><li>Lundequist, A., Pejler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+preformed+mast+cell+mediators.">Biological implications of preformed mast cell mediators.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).</li><li>Metz, M., Maurer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells--key+effector+cells+in+immune+responses.">Mast cells--key effector cells in immune responses.</a> Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).</li><li>Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+as+a+source+of+multifunctional+cytokines.">Mast cells as a source of multifunctional cytokines.</a> Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).</li><li>Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+regulation+of+mast+cell+exocytosis+by+networks+of+Rab+GTPases.">Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases.</a> J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).</li><li>Stenmark, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+rab5+GTPase+activity+stimulates+membrane+fusion+in+endocytosis.">Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis.</a> EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).</li><li>Azouz, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab5+is+a+novel+regulator+of+mast+cell+secretory+granules:+impact+on+size,+cargo,+and+exocytosis.">Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis.</a> J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).</li></ol>

وصفنا استراتيجية مبتكرة تجمع بين الكمي لإم سي إس إيماس وأربعة (س، ص، ض، ر) quantifications البعد عن طريق ثلاثي الأبعاد التصوير ساقطا وقت جان الدراسات في الخلايا الحية باستخدام الجين مراسل إيماس. هذه التقنية تتيح فحص عائلات البروتينات من حيث أثرها على وظيفة MC مثل جان الدراسات...

الخلايا البدينة (MC) هي خلايا المناعة التي اشتهر مشاركتهم في الحساسية والتهابات مثل التهاب المفاصل والربو والتهاب المريء بالحمضيات، التهاب الجلد المزمن وصدمة الحساسية 1،2 فضلا عن الأمراض الأخرى بما في ذلك مرض الشريان التاجي 3،5 و السرطان 3،4. وبالإضافة إلى ذلك، إم سي إس تلعب أدوارا هامة في المناعة الفطرية والتكيفية، سواء في الدفاع المضيف ضد البكتيريا والطفيليات وقمع الاستجابات المناعية، على سبيل المثال حمل المزروع التسامح 5،6. المعلقون تنشأ من النخاع العظمي، وتطوير من CD34 + / CD117 + الخلايا الاصلية المحفزة 7. يتم الافراج نخاع العظام ملتزمة الأسلاف MC إلى مجرى الدم وتهاجر إلى الأنسجة الطرفية توطين في الغالب داخل الأنسجة الضامة والأسطح الظهارية 8. وحققت النضج والتمايز النهائي في نهاية المطاف تحت تأثير سو السيتوكينات داخل الوسط 8،9 المحيطة بها. المعلقون يمكن تفعيلها من خلال مثيرة للحساسية (مستضد، حج)، الذي أدى إلى جيل من الغلوبولين المناعي E (IgE و) لقاء اكتب الأجسام المضادة. ربط هذا إيج لمستقبلات FcεRI مولودية، تليها عبر ربط الخلايا ملزمة الجلوبيولين على إعادة التعرض لنفس حج، والنتائج في FcεRI تجميع والشروع في سلسلة مما يشير إلى أن يبلغ ذروته في تحبب خلية [استعراضها في 10،11] . يتم تنشيط إم سي إس أيضا، بشكل مستقل عن فريق الخبراء الحكومي الدولي، من خلال نيوروببتيد 5،12، والسموم 13، بكتيريا ومولدات المضادات الفيروسية 14،15، وعدد من الببتيدات موجبة الشحنة يشار إليها مجتمعة ب secretagogues الأساسية، الخلايا المناعية والسيتوكينات 5،13،12،16 ، 17. يتم تنشيط المعلقون أيضا من قبل العديد من وسطاء لهم صدر الخاصة، الأمر الذي يزيد من تضخيم الاستجابة الالتهابية. معبأة المعلقون مع حبيبات إفرازية (جان الدراسات) التي تحتوي على المناعةوسطاء التنظيمية، بما في ذلك الأمينات فعال في الأوعية، مثل الهستامين والسيروتونين (في القوارض)، البروتيوغليكان، البروتياز، مثل كيماز وتريبتاز، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية والعديد من السيتوكينات و chemokines 8،9. هذه هي وسطاء &quot;على استعداد للذهاب&quot; وحالما يتم تفعيل المعلقون من قبل التحفيز المناسب، وأصدرت هذه سطاء من الخلايا عن طريق إيماس تنظيم (تحبب) في بضع ثوان إلى دقائق 18،19. ويتبع هذا الحدث الأولي من التوليف دي نوفو وإطلاق مجموعة كبيرة من المواد الفعالة بيولوجيا، بما في ذلك الأيض حمض الأراكيدونيك، السيتوكينات متعددة وكيموكينات 20،21،22. الافراج عن المنتجات تصنيعه حديثا يحدث بشكل مستقل عن إطلاق SG. بشكل جماعي، وهذه سطاء الشروع الردود في وقت مبكر والمرحلة المتأخرة التهابات والحساسية. ولذلك، فهم آليات المحاسبة لتفعيل MC وتحبب كلاهما عفريت النظري والسريريortance. صعوبة التلاعب وراثيا إم سي إس الابتدائية ومثقف وأعاقت محاولات لتوضيح الآليات الكامنة MC تحبب، والتي ظلت حلها بشكل سيئ. للتغلب على هذه المشكلة وضعنا مقايسة على أساس مراسل بواسطة خط الخلية المخاطية الصاري transfecting المشترك، الفئران سرطان الدم مستقعد (RBL) -2H3 (المشار إليها هنا RBL) أو نخاع العظام المستمدة إم سي إس (BMMCs) 30 مع الجينات في المصالح و نيوروببتيد Y (NPY) تنصهر لRFP أحادى (mRFP)، كمراسلة SG. تم NPY توضح مسبقا تلخيص سلوك علامات SG المحلية في النظم الأخرى. وعلاوة على ذلك، لأن mRFP مضان هو الرقم الهيدروجيني حساسة والتعبير عن NPY-mRFP يسمح التصور من لجان الدراسات الحمضية وكذلك التقييم الكمي للإيماس باستخدام لوحات 96-جيدا وقارئ لوحة مضان. لقد أظهرنا أن يتم تسليم NPY-mRFP لجان الدراسات الحمضية خلايا RBL وBMMCs ويتم تحريرها من الخلايابطريقة المنظم إلى جانب البضائع SG الذاتية (أي، β-هيكسوزامينيداز والسيروتونين) 30، 32. يوفر هذا البروتوكول منهجية قائمة على التصوير عالية الدقة التي تسمح الجينات فحص الفائدة لالمظهرية وتأثيرها على خصائص وظيفية SG وتحبب في خلايا RBL 32. على وجه التحديد، وهذا البروتوكول يسمح في الوقت الحقيقي تتبع MC جان الدراسات والكمي لمنطقتهم أو حجم وحدة التخزين، عددهم، حركية التجمع والتنقل على طول الهيكل الخلوي الخلية والانصهار في نهاية المطاف مع غشاء البلازما تحت ظروف مختلفة. على سبيل المثال، توعية الخلايا مع DNP محددة إيج والتسبب في الخلايا مع حج متعددي (DNP مترافق ألبومين المصل) تحت الاضطرابات المختلفة (أي ضربة قاضية للجينات من الفائدة، على التعبير عن الجينات WT أو متحولة، أو التلاعب الدوائية) و مقارنة للسيطرة على الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

الخلايا البدينة (MC) هي الخلايا الإفرازية للجهاز المناعي التي تحقق وظائفها الفسيولوجية والمرضية عن طريق الإفراج عن وسطاء الحساسية، التهابات وimmunoregulatory قبل تشكيلها وتوليفها حديثا. وسطاء إم سي إس &quot;تؤثر على الأنسجة والأعضاء متعددة بلغت ذروتها في استجابات حساسية والمناعة. وينظم درجة عالية من التوليف والتخزين والإفراج عن وسطاء MC. معبأة الوسطاء شكلت قبل في حبيبات إفرازية حشوية (SG) أن تلتحم مع غشاء البلازما والافراج عن محتواها بواسطة إيماس المنظم. نقدم بروتوكول، على أساس المشاركة في التعبير عن الجينات في المصالح مع الجين المراسل أن يتم استهداف لجان الدراسات وإصدارها بطريقة المنظم جنبا إلى جنب مع وسطاء SG الذاتية. بروتوكول يتيح عالية الدقة أربعة متحد البؤر الأبعاد يحلل من MC جان الدراسات ومراقبة الجدول الزمني الخاصة بهم من نشوء حيوي لإيماس تشغيلها. وهكذا، وذلك باستخدام هذا البروتوكول لفحص الجينات من بينمؤسسة لالمظهرية والوظيفية تأثيرها يسمح فك رموز الآليات الجزيئية التي تتحكم في نشوء حيوي وإيماس من MC جان الدراسات وتحديد الجهات الرقابية المعنية. وبالتالي، ينبغي أن تقدم مزيدا من الإيضاحات عن الآليات الخلوية التي تمثل وظيفة إم سي إس في الصحة والمرض.

ونظرا لكفاءة ترنسفكأيشن منخفضة من إم سي إس، من غير المرجح أن يترك أثرا على قراءات من متوسط ​​إفراز قياس وسطاء جان الدراسات الذاتية التلاعب الجيني. ومع ذلك، من خلال إنشاء كامل شاركت في التعبير لمراسل الجين NPY-mRFP والبلازميد-transfected شارك في نفس الخلايا، رصد النتائج NPY-mRFP ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis at JoVE.com

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

وكان الهدف من هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة من شأنها أن تسمح التحليلات الجينومية الوظيفية لإفراز الخلايا البدينة. ويستند هذا البروتوكول على التقييم الكمي لإطلاق سراح من الجين مراسل الفلورسنت cotrasfected مع الجينات في المصالح في الوقت الحقيقي تحليلات التشكل حبيبة إفرازية ل.

التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

توسيع الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا من دم الحبل السري أن الفيروس المضخم للخلايا الهدف، فيروس ابشتاين بار، واتش

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

عزل مجموعات فرعية B-الخلية السلائف من دم الحبل السري

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

والفحص صفيحة ميكروسكوبية لتقييم تأثيرات المواد الكيماوية على RBL-2H3 الصاري تحبب الخلايا: آثار التريكلوسان بدون استخدام مذيب عضوي

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

تصور الإيماس غير التحللي من<em&gt; الأدعومية المستخفية</em&gt; من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

تحليل وظائف الخلايا الصاري في فيفو باستخدام 'الصاري خلية طرق في' الفئران

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

عزل خلايا ماست المستمدة من الغشاء البريتوني وعلى التوصيف الوظيفي مع Ca2 +-التصوير وفحوصات تحبب

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

التحقيق في تكلس الصمام الأبهري عن طريق العزلة وثقافة الخلايا الليمفاوية T باستخدام الخلايا المغذية من معطف بافي المشعع

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...