Name: utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer at JoVE.com

J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

OBS: Alla steg i detta protokoll har godkänts av UT MD Anderson Cancer Center. 1. Generering av mTERT-ER allel <ol><li> Introducera knock-in targeting vektor innehållande ERT2-LBD (ligandbindande domän) uppströms och i ram med mTERT-genomsekvensen (exon 1 genom intron 2) och en Lox - PGK - Neo - Lox-fragmentet (figur 1 A) in i mus-ES-celler med elektroporering. </li><li> Kultur ES-cellerna i neomycin för 6-10 dagar. Plocka neomycinresistenta kloner och expandera i 48-hålsplattor. Extrahera iskt DNA med ett kommersiellt kit och bekräfta knock-in-allelen genom Southern blot. </li><li> Injicera två ES linjer med över 95% normala karyotyper i C57BL / 6 blastocyster med mikromanipulation kit under ett inverterat mikroskop. Implantera blastocyster i livmodern av surrogatmödrar 23. Mate de manliga chimärer högvärdiga (70-90%) till C57BL / 6 fehanar. </li><li> Bekräfta genotypning av heterozygota mTERT-ERneo djur genom Southern blot. </li><li> Mate de heterozygota mTERT-ERneo djur och EIIa-Cre djur för att ta bort NeoR kassett. Mate de heterozygota djuren till C57BL / 6 djur under minst tre gånger, och ytterligare inter breed heterozygota mTERT-ER djur att generera homozygositet. </li></ol> 2. Generering av LSL-mTERT allel <ol><li> Introducera knock-in målsökningsvektom innehåller en LoxP - trippel Stopper - Neo - LoxP fragment och mTERT genomsekvensen (mellan exon 1 och intron 2, Figur 1B) i mus ES-celler med elektroporering 23. </li><li> Kultur ES-cellerna i neomycin för 6-10 dagar. Plocka neomycinresistenta kloner och expandera i 48-hålsplattor. Extrahera iskt DNA med ett kommersiellt kit och bekräfta knock-in-allelen genom Southern blot 23. </li><li> Inject två ES linjer med över 95% normala karyotyper till C57BL / 6 blastocyster med mikromanipulation kit under ett inverterat mikroskop. Implantera blastocyster i livmodern av surrogatmödrar 23. Mate de manliga chimärer högvärdiga (70-90%) till C57BL / 6 honor. </li><li> Bekräfta genotypning av heterozygota LSL-mTERT djur genom Southern blot. </li><li> Mate de heterozygota djuren till C57BL / 6 djur under minst tre gånger, och ytterligare inter breed heterozygota LSL-mTERT djur att generera homozygositet. </li></ol> 3. Reaktive av telomeras i mTERT-ER och LSL-mTERT Möss In Vivo För mTERT-ER <ol><li> Sterilisera alla kirurgiska verktyg före injektionen. </li><li> Bedöva möss med isofluran kammare (4% för induktion, 2% för upprätthållande) i 50% (volym / volym) syre / 50% (vol / vol) dikväve kolmonoxid gasblandning. Eller söva möss genom en ketamin-xylazin blandning (100 mg / kg kroppsvikt + 10 mg / kg kroppsvikt). </li><li> Efter djup anestesi nås, avlägsna den sövda djuret från induktionskammaren och hålla huvudet inuti röret anslutet till isofluran kammaren (2%). </li><li> Nyp fotkuddar för mössen att säkerställa att djuret är djupt nedsövd. Sätt salva på båda ögonen för att förhindra att ögonen blir uttorkade. Torka baksidan av möss med povidon-jodlösning. </li><li> Injicera långsam frisättning 4-OHT pellet med precisions trokar (10 G) under huden på ryggen och skjut pelleten hela vägen till mittlinjen mellan två axlar. </li><li> Täta snittet med såret klämfastsättare och övervaka mössen för återhämtning från anestesi. Ta bort clipsen 10 dagar senare. Extra värme behövs inte eftersom proceduren är klar inom kort. </li><li> Behandlingsperioden med 4-OHT pellets bör optimeras utifrån syftet med studien. </li></ol> För LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> Tamoxifen (10 mg / ml, löst i majsolja) injiceras intraperitonealt två på varandra följande dagar (200 ul / 25 g / dag). </li></ol> 4. Isolering av neurala stamceller och Reaktive av telomeras in vitro <ol><li> Mössen avlivades med koldioxid, och hjärnorna avlägsnas. Följ protokollet för kommersiellt tillgängliga nervvävnad dissociation kit enligt tillverkaren. </li><li> Resuspendera frystorkade pulvret i flaskan märkt Lösning 4 med 1 ml cellodlingsmedium för Solution 4. Gör inte vortex. Denna lösning bör sedan i alikvoter och lagrades vid -20 ° C för senare användning. </li><li> Pre-Heat blandningen vid 37 ° C i 15 minuter före användning. </li><li> Gör Enzyme Mix 1: Lösning 1 (50 ^) och Lösning 2 (1.900 l). Gör Enzyme Mix 2: Lösning 3 (20 ^) och Lösning 4 (10 il). </li><li> Förbered 1950 il enzymblandning 1 för upp till 400 mg vävnad och virvel. Förvärm blandningen vid 37 ° C under15 min före användning. </li><li> Ta ut 1-dagars mushjärnor, och hålla framhjärnorna genom att ta bort de lukt lökar och lillhjärnan. Håll framhjärnan vävnader i en ml kall odlingsmedium eftersom avlägsnandet och lagra i 4 ° C. Se till att bearbeta den neurala vävnaden inom en timme. </li><li> Bestäm vikten av vävnad för att se till att 400 mg gränsen per matsmältningen inte överskrids. Placera hjärnan på locket till en 35 mm diameter petriskål, och krossa hjärnan med användning av en skalpell. </li><li> Med användning av en 1 ml pipettspets, tillsätt 1 ml HBSS (w / o Ca / Mg) och pipettspetsar bitar tillbaka in i ett 15 ml rör. Skölj med HBSS (w / o Ca / Mg). Centrifugera vid 300 x g under 2 minuter vid rumstemperatur och aspirera supernatanten försiktigt. </li><li> Lägg 1950 pl förvärmd enzym mix 1 (Lösningar 1 och 2) per upp till 400 mg vävnad. Inkubera i 15 ml rör i 15 min vid 37 ° C, och blanda genom att skaka eller vända röret varje 5 min. </li><li> Förbered 30 pl enzymblandning 2 per vävnadsprov genom att tillsätta 20 &amp; #956; l Lösning 3-10 pl lösning 4. Tillsätt sedan till provet. Vänd försiktigt för att blanda. Inte virvel. </li><li> Dissociera vävnaden mekaniskt med en bred spets, brand-polerat pasteurpipett genom att pipettera upp och ner 10 gånger långsamt. Undvik bildar luftbubblor. </li><li> Inkubera vid 37 ° C under 10 min, att vända röret var 3 min. </li><li> Upprepa steg 4.11 och steg 4.12 om vävnaderna är större än 200 mg. </li><li> Applicera cellsuspension till en 70 | im cellfilter, placerades på en 50 ml tub. Applicera 10 ml PBS genom cell sil. Kassera cellfilter och centrifugera cellsuspensionen vid 300 g under 20 minuter vid rumstemperatur. Sug ut supernatant helt. </li><li> Resuspendera celler med stamcellmedium till den erforderliga volymen för ytterligare tillämpningar. </li><li> För att aktivera telomeras i LSL-mTERT NSCs, behandla cellerna med 100 iM 4-OHT i två dagar. För att aktivera telomeras i mTERT-ER NSCs, hålla cellerna i odlingsmedium med 100 iM 4-OHT. </li></ol> 5. Telomer FISK <ol><li> Förbered metafaskromosomer från odlade celler. </li><li> För FFPE (formalinfixerade och paraffininbäddade) vävnadssnitt, Avparaffinera i xylen och rehydrera i etanol-serie för 5 minuter vardera (100%, 90%, 70%, 50% etanol) och PBS under 5 min. </li><li> Post-fix i metanol: ättiksyra (3: 1) under 1-2 timmar. Dehydrera i kall etanol serie för 5 min vardera (70%, 90%, 100% etanol) och lufttorka. Tvätta i 1 x PBS vid 37 ° C under 5 min. </li><li> Denaturera kromosomer i 4% formaldehyd vid 37 ° C under 2 min. Torka i kall etanol serie 5 minuter vardera (70%, 90%, 100% etanol) och lufttorka. </li><li> Applicera 12-25 pl av PNA hybridisering blandningen till varje bild. (Hybridisering mix: 70% formamid, 0.06x SSC, 0,2% BSA, 0,5 ng / l tRNA, 0,5 ng / l telomeren eller centromer sonder) </li><li> Täta täckglas med gummicement. Efter denaturera kromosomala preps och vävnadssnitt vid 80 ° C för 4 mi. Hybridisera i rumstemperatur eller 37 ° C i 2-4 timmar i fuktig kammare. </li><li> Tvätta vid rumstemperatur med tvättbuffert 2 x 15 min. (Tvättbuffert: 70% formamid, 0.06x SSC, pH 7,2). Tvätta i rumstemperatur 3 x 5 min med PBST. Counter-fläck glider med DAPI eller vitt röd fluorescens för mikroskopisk undersökning. </li></ol>

<ol>
	<li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion.">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA.">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs.">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li><li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age.">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing.">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li><li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity,+stress+response,+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice.">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li><li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells.">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li><li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyskeratosis+congenita.">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li><li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndromes+of+telomere+shortening.">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li><li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita.">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li><li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase,+checkpoints+and+cancer.">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li><li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-+and+ATM-dependent+apoptosis+induced+by+telomeres+lacking+TRF2.">p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2.</a> Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).</li><li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions.">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li><li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis.">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li><li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice.">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li><li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans.">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li><li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a(delta2/3)+cancer-prone+mouse.">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li><li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice.">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer.">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li><li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases.">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Här rapporterar vi generering av två inducerbara murina telomeras alleler och hur man återaktiverar telomeras in vivo och in vitro. Det kritiska steget för reaktive mTERT-ER-aktivitet är att hålla en kontinuerlig koncentration av tamoxifen, så vi väljer att använda 4-OHT tid frisättning pellets som tillverkas av Innovative Research of America. Pelletsen håller frigör 4OHT vid ett steady state blodnivå av en ng / ml i upp till 60 dagar. I en tidigare studie visade vi att reaktivera telomerasaktivitet med denna strategi kunde lindra degenerativa fenotyper såsom stamcells utmattning, nedsatt vävnadsskada svar och organsvikt i flera organ som induceras av telomer dysfunktion i G4 mTERT ER / ER möss 20. Annat än att studera funktionen av telomeras i åldrandet, kan dessa två inducerbara telomeras alleler också användas för att studera cancer. Tidigare studier tognytta av dessa alleler att utforska roll telomer avgång och telomeras reaktive i utformningen genomen och påverkar biologi T-cellslymfom tymisk 21 och prostatacancer 22. Dessa två studier visade att telomer dysfunktion i slutet generation G4 Atm - / - mTERT ER / ER och G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L-möss ger en mekanism bränslepåfyllning förvärvet av tidiga mutagena händelser för tumör initiering, men förhindrar progression av fullt maligna tumörer. När telomeras reaktiverades i samband med telomer dysfunktion inducerad genomisk instabilitet, DNA-skadecheckpoints och skenande kromosomal instabilitet undertrycktes, vilket tillät den fullständiga utvecklingen av maligna tumörer med nya biologiska egenskaper såsom benmetastas av prostatacancer 21 och hjärna infiltration av Thymic lymfom 21. Liknande fenomen observerades också i andra typer av cancer, inklusive koloncancer och pankreascancer (personlig kommunikation med Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin och Ronald DePinho). Eftersom TERT-ER protein kan lätt växlas mellan på och stater utanför beroende på om djuren behandlas med tamoxifen eller fordon, kan tumörmodeller som genereras av mTERT-ER-allelen användas för att testa anti telomeras terapi. I tidigare studie, tumörer som genereras i G4 Atm - / - mTERT ER / ER djuren släpptes från 4-OHT; på telomeras utarmning, krympte tumörer så småningom på grund av återinförande av telomeren dysfunktion-inducerade kontrollpunkter 21. Men för att en del av tumörerna förvärvat resistens som svar telomeras utplåning genom att aktivera en alternativ Förlängning av Telomerer (ALT) mekanism. Ytterligare karakterisering av dessa ALT + resistenta tumörer visade att thej har avvikande transkription av gener involverade i mitokondriell biologi och oxidativ försvar inklusive en mästare regulator av mitokondriell syntes och oxidativ försvar PGC-1β. Knockdown av PGC-1β eller SOD2 (en annan regulator av oxidativ försvar) eliminerar signifikant ALT + tumörceller medan hålla telomeras + tumörceller förblir relativt intakt 21. En begränsning av dessa två knock-in alleler är att de bara har råd reaktivering av telomeras på endogen nivå eftersom de är i det nativa locuset av telomerasgenen. I de flesta mänskliga cancer är telomeras faktiskt överuttryckt på en mycket högre nivå. För att öka graden av telomeras, ett modifikation vi kan tänka på är att infoga mTERT-ER-konstruktion med en starkare promotor såsom PGK (fosfoglyceratkinas) promotor i ROSA26 locus. Sammanfattningsvis dessa två nya inducerbara murina telomeras alleler ger oöverträffad genetic verktyg för att studera funktionen hos telomeras i åldrande och vävnads homeostas samt tumörprogression, särskilt under bakgrunden av pre-förvärvad telomer dysfunktion-inducerad genomisk instabilitet. Den mTERT-ER-allelen kan också användas för att studera anti telomeras terapi genom att korsa in andra tumörbenägna musmodeller.

Telomeras är ett enzym som ansvarar för att upprätthålla telomerer. Dessa är repetitiva sekvenser vid ändarna av kromosomer som skyddar deras integritet. De centrala delarna av telomeras holoenzym är ett omvänt transkriptas katalytisk subenhet (TERT) och en RNA subenhet (TERC) som fungerar som mall för att lägga till telomera upprepar 1,2. Medan generellt undertryckt i differentierade somatiska celler, uppvisar telomeras robust aktivitet och spelar viktiga roller i könsceller, cancerceller och stamceller. mTERC och mTERT knockoutmöss ge stor in vivo modellsystem för att studera funktioner telomeras i både stamceller och cancer. Den mTERC och mTERT knockout möss (G1) visade inga uppenbara fenotyper grund av den långa reserv av telomererna hos möss 3. Men seriellt intercrossing mTERC och mTERT knockoutmöss till sen generationen (G5-G6) resulterade iprogressiv erosion av telomerer och så småningom provocerade allvarlig degeneration av mycket proliferativa vävnader fyra. Sen generationen (G5-G6) mTERC - / - möss är infertila på grund av de höga apoptos i testikel och könscell utarmning. G5-G6 mTERC - / - möss uppvisar också degenerativa fenotyper i mycket proliferativa vävnader inklusive benmärg, tarm och hud på grund av höga apoptos och defekt självförnyelse kapacitet i vävnads stam / progenitorceller fack 4. Hematopoetiska stamceller i benmärgen sen generationen mTERC - / - möss uppvisar förlust av proliferativ potential, äventyras självförnyelse kapacitet, förbättrad apoptos och slutligen funktionell utmattning 5,6. Likaså var progressivt ökade apoptotiska kroppar i tarm kryptor observerats i varje generation av G1-G6 mTERC - / - möss 7,8. THan skadlig effekt av dysfunktionella telomerer verkar inte vara begränsad till höga omsättnings vävnader eftersom både spridningen av vuxna neurala stamceller in vitro och neurogenes in vivo var allvarligt nedsatt sent generationen (G4-G5) mTERC - / - möss 9 . Roll telomeras i stamceller stöds också av resultaten i en sällsynt mänsklig genetisk sjukdom dyskeratosis congenita (DKC), som på vissa sätt liknar tidigt åldrande 10,11. DKC orsakas av mutationer i TERC, TERT, och gener som kodar dyskerin, en kärna telomeras subenhet, och övriga dyskerin associerade proteiner 12. I genomsnitt telomerer i DKC patienter är kortare än 99% av åldersmatchade kontroller. Den viktigaste morbiditet av sjukdomen beror på aplastisk anemi, som orsakas av felaktigt underhåll av hematopoietiska stamceller. Andra aspekter av sjukdomen såsom oral leukoplaki, spik dystrofi, mentala retardatipå, testiklar atrofi och lungkomplikationer alla föreslår nedsatt funktioner vävnads stamceller och progenitorceller 10, fynd i nära överensstämmelse med de i slutet generation telomeras knockoutmöss. DKC patienter är benägna att myelodysplastiskt syndrom och har en ökad förekomst av maligna tumörer slemhinnor. Således brist på telomeras i mänskliga patienter rekapitulerar de brister i stamcells funktioner och tumör anlag som observeras i slutet generationens telomeras knockoutmöss. Korta telomerer och hög telomerasaktivitet är kännetecken för cancer. Som normala eller premaligna celler delar, de låga eller frånvarande telomeras-aktivitet leder till en eventuell urholkning av telomerer och aktivering av cellulära vägspärrar som liknar dem som framkallats av DNA dubbelsträngat-raster (DSB) 13. Liksom klassiska-DSB har telomer dysfunktion visats inducera p53 och associerade cellulära svar, såsom senescens och / eller apoptosis 14,15. Vid mutationsinaktivering av p53, är cell cykling och cellöverlevnad förbättras i celler med telomer dysfunktion, vilket ger en pro-cancerogena mutator mekanism som kännetecknas av translokationer och regionala förstärkningar och strykningar 16,17. Samtidigt fortsatte telomer dysfunktion och tillhörande skenande kromosomal instabilitet (även i p53 null-celler) förefaller begränsa fullt malign progression av sådana cancrar. Exempelvis sen generation G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - möss visade signifikant reducerad lymfom incidens jämfört med Ink4a / Arf null möss på grund av telomer attrition. I en annan studie, mer avancerade adenomatösa lesioner i G4 mTERT - / - APC min möss kraftigt undertryckt i jämförelse med APC min möss på grund av betydande tillväxt gripande och apoptos 18,19. Denobservationen att telomererna dysfunktion-inducerad genomisk instabilitet hämmar tumörprogression uppmanar spekulationer om att aktiveringen av telomeras kan möjliggöra malignt progression delvis av quelling genomisk instabilitet till en nivå som är förenlig med cancer cellviabilitet och / eller neutraliserande p53-beroende eller -oberoende checkpoint mekanismer. För att studera om telomeras reaktive kan stoppa eller ens vända åldrande av stamceller, och om telomeras reaktive kan främja tumörbildning mot bakgrund av genomisk instabilitet, genererade vi två inducerbara murina telomeras alleler. Den första är 4-hydroxitamoxifen (4-OHT) -inducerbara TERT-östrogenreceptor (mTERT-ER) fusion knock-in allel. I avsaknad av 4-OHT, möss homozygota för mTERT-ER (betecknad mTERT ER / ER) är telomerasaktiviteten bristfällig och upprätthålla samma cytogenetiska och cellulära fenotyper som konventionell mTERT eller mTERC knockout modell. Vid 4-OHT behandling, kan TERT-ER proteinaktivitet återställas till nivåer som är jämförbara med de infödda TERT protein 20, 21. Den andra allelen är en roman inducerbart TERT knock-in allel innehåller en intronisk LoxP-Stopper-LoxP kassett (LSL- mTERT); upon Cre-medierad excision av LSL, mTERT åter uttrycks under endogena uttrycks kontrollmekanismer 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

Telomer dysfunktion-inducerad förlust av genomet integritet och dess tillhörande DNA-skador signalering och checkpoint svar är väletablerade förare som orsakar vävnadsdegeneration under åldrandet. Cancer, med incidens kraftigt öka med åldern, kännetecknas av korta telomerlängden och hög telomerasaktivitet. Att studera roller telomer dysfunktion och telomeras reaktive i åldrande och cancer, visar protokollet hur man skapar två murina inducerbart telomeras knock-in alleler 4-hydroxitamoxifen (4-OHT) -inducerbara TERT-östrogenreceptor (mTERT-ER) och Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Protokollet beskriver förfaranden för att inducera telomer dysfunktion och återaktivera telomerasaktivitet i mTERT-ER och LSL-mTERT möss in vivo. De representativa data visar att reaktivering av telomeras-aktivitet kan lindra vävnads degenerativa fenotyper inducerade av telomer dysfunktion. I Order för att bedöma effekten av telomeras reaktive på tumorigenes genererade vi prostatatumörmodell G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L och tymisk T-cellslymfom modell G4 Atm - / - mTERT ER / ER . De representativa data visar att telomeras reaktive i bakgrunden av genomisk instabilitet induceras av telomer dysfunktion kan avsevärt förbättra tumörbildning. Protokollet beskriver också de förfaranden som används för att isolera neurala stamceller (NSCs) från mTERT-ER och LSL-mTERT möss och återaktivera telomerasaktivitet i NSCs in vitro. De representativa data visar att reaktivering av telomeras kan öka självförnyelse kapacitet och neurogenes in vitro. Slutligen beskriver protokollet förfarandena för att utföra telomer FISH (fluorescens in situ hybridisering) på både mus FFPE (Formalin Fasta och Paraffena Embedded) hjärnvävnader och metafaskromosomer av odlade celler.

Strategierna för att generera murina mTERT-ER och LSL-mTERT knock-in alleler beskrevs i figur 1A och 1B. Specifikt en LoxP - trippel Stopper - Neo - LoxP fragment infördes mellan exon 1 och exon 2 i mTERT lokus för att generera LSL-mTERT allelen. För att generera mTERT-ER-allelen, var ERT2-LBD-domänen i ramen med mTERT genen insatt i N-änden av exon 1. Vi visade att när telomeras transient aktiveras i telomer dysfunktion möss genom att behandla dem med 4-OHT pelletar för fyra veckor, kunde den degenerativa fenotypen lindras i flera organ såsom hjärna (figur 2A) och testiklar (Figur 2B). För att bedöma effekten av telomeras reaktive på celler odlas in vitro, vi isolerade neurala stamceller (NSCs) från sent generationens G4 LSL-mTERT och G4 mTERT-er Möss. Vi visade att när telomeras aktiverades i telomeren dysfunktionella NSCs var självförnyelse förmåga NSCs ökat kraftigt (Figur 3A), och in vitro neurogenes var också betydligt bättre (Figur 3B). För att bedöma effekten av telomeras reaktive på tumorigenes i samband med telomer dysfunktion, vi genererade PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L (prostatatumörmodell) och Atm - / - mTERT ER / ER (tymisk T-cellslymfom modell) sen generationens kohorter. När telomeras reaktiverades av tamoxifen behandling i dessa möss med injektion (Figur 4A) eller 4-OHT pellets i 8 veckor (Figur 4B), var tumorigenes förbättrats avsevärt i både prostatatumörmodell (Figur 4A) och tymisk T-cellslymfom modell ( <strong&gt; Figur 4B). Slutligen rapporterade vi protokollen för att utföra telomer FISH på FFPE mus hjärnvävnader (Figur 5) och metafaskromosomer (Figur 5, infällda). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Figur 1: (A) mTERT-ER knock-in strategi. TV, målsökningsvektom; WT, vildtyp allelen; KI, knock-in allel; LA, vänster arm; RA, höger arm; E1, exon 1; E2, exon 2; neo, PGK-promotorn driven neomycin resistent gen; ER, modifierad östrogenreceptor (ERT2) ligandbindande domänen; DT, dyphteria toxingenen. (B) LSL-mTERT knock-in strategi. TV, målsökningsvektom; WT, vildtyp allelen; KI, knock-in allel; LA, vänster arm; RA, höger arm; E1, exon 1; E2, exon 2; neo, PGK-promotorn driven neomycin resistent gen; STOPPER, tre repetitiva transkriptionsstoppsekvenser; DT, dyphteria toxingenen. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Figur 2: Representativa data att visa telomeras reaktive lindrar degenerativa fenotyper av organ Representativa bilder av hjärnor (vänster). och testiklar (höger) i G0 och G4 mTERT-ER-möss som behandlats med placebo eller 4-OHT i 4 veckor. Skala staplar indikerar 50 pm. Re-print med tillstånd från 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Figur 3:. Representativa data för att visa telomeras reaktive förbättrar självförnyelse och neurogenes av neurala stamceller in vitro (A) Representativa bilder av neurala stamcellers isolerad från G4 LSL-mTERT (övre panelen) och G4 mTERT-ER (undre panelen) växer i stamcellsmediet behandlas med fordon eller 4-OHT. (B) Representativa bilder av in vitro-neurogenes (Tuj1 +) av neurala stamceller som isolerats från G4 mTERT-ER odlades i differentieringsmedium (med 1% FBS) behandlade med vehikel eller 4-OHT. Skalstrecken anger 100 um. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Figur 4:. Representativa data att visa telomeras reaktive förbättrar tumorigenes mot bakgrund av genomisk instabilitet (A) Representativa bilder av prostatatumörer dissekerade från G0 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB- Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT- / -, Och G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L behandlades med tamoxifen. Åter ut med tillstånd från 22. (B) Representativa bilder av tymiska T-cellslymfom dissekerade från G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER behandlade med fordon, och G4 Atm - / - mTERT ER / ER behandlas med 4- OHT för åtta veckor. Skala staplar indikerar 1 cm. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Figur 5: representativa bilder av telomeriska och centromerkohesion FISH på FFPE musen hjärnvävnad och metafas (infälld). Rött indikerar DNA, grönt indikerar telomer färgning, och cyan indikerar centromere färgning. Skala staplar indikerar 1 mm.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer at JoVE.com

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Använda Murina inducerbara Telomeras alleler i Studier av Tissue Degeneration / Regeneration och cancer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

En metod för Murine Islet Isolering och subkapsulär Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

En Orthotopic Modell av murina blåscancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Använda transkraniell magnetisk stimulering för att studera mänskliga neuromuskulära systemet

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

Immunhistokemisk färgning av B7-H1 (PD-L1) på Paraffininbäddade Bilder av Pancreatic Adenocarcinom Tissue

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

En Prekliniska mus modell av levermetastaser

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsådern Tinkturer för farmakokinetiska och farmakodynamiska Analys av taxaner i möss

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Dvala Modell av östrogen-känsliga bröstcancer i benmärgen: ett verktyg för molekylär mekanism Studier och Hypotes Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

Den bm12 inducerbara Modell av systemisk lupus erythematosus (SLE) i C57BL / 6 möss

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals

Med hjälp av ett oralt Upplösning Strip för farmakologiska och toxikologiska studier: En enkel och Humane alternativ till oral sondmatning för djur

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analysera gynnsamma effekterna av Kosttillskott på intestinala epiteliala barriärfunktioner Under experimentell kolit

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...