Name: derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into expandable neural progenitor cells
Uploaded: 2015-07-29T13:00:00
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我们愿干细胞和维尔茨堡大学的再生医学集团有益的建议和Martina Gebhardt的以及海克Arthen的所有成员感谢优秀的技术支持。这项工作是由德意志研究联合会DFG（ED79 / 1-2），教育的德国与研究部BMBF（01 GN 0813），巴伐利亚研究网络诱导多能干细胞“forIPS”和“基金会西比勒Assmus资金支持“ 图1是使用施维雅医疗艺术，从www.servier.com生产。

在这项研究中所用的人成纤维细胞是从皮肤穿刺活检获得由维尔茨堡，德国的大学伦理委员会得到知情同意和伦理过关后（道德报告编号：日期为2011年6月10日一十一分之九十六）。 1.冲床活检<ol><li>消毒患者的皮肤。麻醉用0.5至1ml盐酸甲哌卡因皮肤皮内其中一部分活检将取自（优先不太阳光曝晒区），并用无菌3毫米活检打孔准备皮肤活检，活检冲洗用DPBS + 1微升/1毫升庆大?...

这里，我们显示了隔离和直接转换人成纤维细胞的成膨胀转基因的无神经祖细胞和它们的分化后代作为细胞替代疗法或药物筛选分析应用的推定依据。直接谱系体细胞转化成的NPC已经由谱系特异性转录的强制表达因子26,33,34来实现的。然而，在许多情况下，胎儿成纤维细胞用于转实验33,34。用于生物医学应用中，这些细胞的用法是不适宜的，因为这单元源排除了临床使用自体细胞?...

在2006年山和同事可以显示首次体细胞的重编程的可能性成多能状态1。此去分化是由四个转录表达在小鼠成纤维细胞获得因子的Oct4，Sox2的，Klf4和c-Myc的。所产生的所谓的诱导多能干细胞（iPS细胞）显示功能等同于胚胎干细胞（ESCs），并因此可以分化成成年生物体的所有细胞类型。一年后重新编程为iPS细胞也可以实现对人成纤维细胞2。在动物模型中的实验表明，源自iPSC的细胞中通常可以用于细胞替代疗法，例如 ，在帕金森氏病（PD）3-5。然而，与使用iPS细胞相关的一些限制表示路障，为全面实现其治疗的潜力。首先，细胞重编程为多能状态和随后的质量控制通常是一个耗时和低效的过程，得到了广泛的，因而昂贵的细胞培养过程。第二，iPSCs的需要被重新分化成感兴趣的生物医学应用之前所需的细胞类型和残留多能干细胞在分化的人口的概率藏着显著瘤潜力，从而显示细胞移植6后的高风险。第三，重编程过程通常是由通过lenti-或逆转录病毒感染诱导的重编程因子来实现的。这些病毒进入宿主基因组的整合可能导致插入突变和/或所述转基因7,8-不受控制活化。非整合系统已被开发以提供重编程因子的靶细胞，其最小化插入诱变和转基因激活的风险。这些转基因无方法的实例是细胞使用非整合的重新编程腺或仙台病毒9,10，基于DNA的载体11或不含DNA的方法的应用，如合成的mRNA的重组蛋白13,14的12或转导的转染。另一种很有前途的方法对转基因自由的iPSC的推导是利用loxP的修饰慢病毒重新编程结构和随后删除使用的Cre-loxP的DNA重组系统15,16转基因的。 一个更简单的方法来生成神经细胞的细胞替代疗法代表直接转换成纤维细胞进入有丝分裂后神经元17-20。 Vierbuchen 等人报告说，转录的表达因子ASCL1，Brn2和Myt1l结果在20％的神经元的产生来自鼠成纤维细胞17。在2011年它被示出，即在相同的三个转录因子与NEUROD1的过表达的组合使人成纤维细胞成神经的转罗恩的19。人类诱导的神经元也可以通过ASCL1和Ngn2下双SMAD-和GSK3β-抑制过度20产生。值得注意的是，直接转换成纤维细胞的成神经细胞的产生非增殖，有丝分裂后的细胞群，不允许进一步扩张和生物库。 最近，直接转换成纤维细胞的成增殖神经干/祖细胞群报道21-26。为了清楚起见，所有这些类型的细胞将被命名为这份报告中诱导神经祖细胞（iNPCs）。 Han 等过度Brn4，Sox2的，c-Myc的和Klf4来生成iNPCs。像他们无论从小学组织或多能干细胞源性神经干细胞，这些同行都是iNPCs和三电位可以分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞21。我们的团队报道涉及SOX2，Klf4的过表达略有不同的转换协议，和c-Myc诱导的Oct4表达为仅5天。通过这种方法，我们可以生成表现出完全沉默的重编程因子的小鼠22胚胎和成年成纤维细胞增殖稳定iNPCs。在对比的iPSC，iNPCs不移植27后表现出致瘤的潜力。我们使用在脱髓鞘的动物模型，髓鞘缺陷大鼠成功转化的细胞，这表明iNPCs在临床上是有用的22。在此之前，筹备可能只能从多能干细胞或原代神经组织28-32生成的。 iNPCs是稳定地膨胀的室，可以冷冻保存，并且能够分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。很大的努力已取得能适应从小鼠的直接转换协议到人类细胞23,26,33,34。在2012年它被出版，在成纤维细胞的单因子Sox2的过度表达足以产生小鼠和人iNPCs <s达&gt; 33。作者报告生成胎儿包皮成纤维细胞的人类iNPCs的特点和他们通过对染色和Sox2的巢。然而，用于重编程靶细胞表示，将不会在临床实践中可用的并有转化细胞中进行的动物模型中没有功能表征通过移植一个非常特定的细胞类型。更近的出版物Sox2的，c-Myc的，要么Brn2或Brn4 34的过量表达描述了从人胎儿成纤维细胞的神经元限制性祖细胞的产生。所产生的细胞系表现出的自我更新能力并且可以分化成不同类型的终端的神经元。然而，胎儿成纤维细胞的使用是不利的，因为这些细胞是异质的原点和一个不能排除残余例如，神经嵴干细胞的制剂的存在。在2014年，朱等人报道了直接成人和新的转换产后的成纤维细胞进入三电位神经祖细胞通过过表达Sox2的连同的Oct4或Oct4的单独和除了小分子的细胞培养介质。值得注意的是，根据他们的研究，Sox2的独显不足以诱导直接转化26。最近，Lu 等人报告说，在山中的过表达因子Oct4-，Sox2-，Klf4-，c-Myc的仙台病毒24小时的病毒和随后的失活温度导致膨胀三电位神经的产生增加前体细胞23。总之，虽然公布了人类细胞的转化的协议迄今具有在至少一个所述山因素的一个或多个，通常是一个及时限制的方式的共同过表达，有需要用来驱动直接最小分子因素没有明确指示转换成iNPCs。 Oct4的的及时过度限制或者通过遗传手段，转染的mRNA合成，或cELL-透膜蛋白与SOX2，KLF-4，和c-Myc的组成型表达没有造成稳定的人力INPC行呢。因此，仙台病毒的应用以过表达所有山因素和及时由病毒23的热灭活限制其活动一起优化神经介质诱导条件22,31表示的优选策略迄今。 一些研究表明神经干细胞或在不同的动物疾病模型的区别同行的细胞功能。从人多能干细胞的神经祖细胞已移植在神经炎性病症多发性硬化35,36的小鼠模型。人类胚胎干细胞衍生的神经祖细胞中的EAE的适用性（实验性自身免疫性脑脊髓炎）-mice最早于2008年35所示。多能神经前体细胞注射到小鼠脑的脑室和移植结果编在EAE的临床症状的减少。 Kim 等生成由hESCs少突胶质细胞前体和脑室内移植那些成EAE-小鼠。虽然移植了10多天没有生存，小鼠表现出显著改善神经功能和白质减少36促炎免疫细胞的。干细胞疗法也已应用于临床前靶向帕金森氏病的作为的NPC可以被成功地用于在相应的动物模型。对于这一点，祖细胞无论是来源于胎儿脑组织37从多能干细胞38-40或间质干细胞41被用于鉴别。在2012年，我们表明，小鼠iNPCs能够产生蛋白脂质蛋白，主要的髓鞘蛋白成分，移植后成髓鞘缺陷（MD）大鼠22的大脑。通过验证-的原则，实验治疗applicabiliNPCs的性被首次证明和另一项研究32很快证实。然而，治疗用途的人类iNPCs的全部潜力还有待探索。 这里，我们显示了从通过皮肤活检的成年患者的人原代细胞（ⅰ）推导一个坚固的一体化方法，（ⅱ）直接转换人成纤维细胞的成神经祖状态和iNPCs的（ⅲ）的能力也可以分化成神经元和神经胶质细胞系。这个协议的使用，将有助于加快新一代自体的人类细胞用于治疗应用。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Astrocyte media</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td align="right">1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>pfm medical</td>
			<td align="right">48301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon medchem</td>
			<td align="right">1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type2</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>PAN&#160;</td>
			<td>P10-032100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Roth</td>
			<td align="right">4720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td align="right">50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP-antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hLIF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>GEM-700-112-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67-antibody</td>
			<td>NeoMarkers</td>
			<td>RM-9106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSC freezing media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct4-antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>inh-sb43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>&#160;LifeTechnologies</td>
			<td>A1378001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumpyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox1-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-205725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 146986-50-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into expandable neural progenitor cells

代从成人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞（iPS细胞）和随后的分化成体细胞为规避组织相容性障碍的自体移植的推导引人入胜的前景。然而，通过多能状态和随后的全面分化成所需的谱系进展仍然是一个障碍为IPSC的技术，因为相关的肿瘤潜力和基因组不稳定性的临床翻译。近来，我们和其他人发现，体细胞不仅可以通过使用确定的因子，从而通过多能状态绕过级数变换为iPS细胞，但也为不同类型的多能成体干细胞。特别是，直接由人类成纤维细胞进入诱导神经祖细胞（iNPCs）的转化预示着一个新的自体细胞来源的各种应用，如细胞替代，疾病建模的可能性和药物筛选。这里，我们描述成人原发性成纤维细胞通过皮肤活检及其有效的直接转换的隔离成iNPCs通过的Oct4，Sox2的，Klf4的及时限制性表达，以及c-Myc的。 17天后诱导SOX2阳性神经上皮菌落出现，INPC线可以有效地单克隆分离和扩增成立。感染和补充的白血病抑制因子的病毒多样性的在诱导期精确调整代表实现高达0.2％的转换效率的关键因素。迄今为止，针对具体患者INPC线可以扩大超过12的通道和均匀地显示神经干/祖细胞的形态学和分子的特性，如Nestin和Sox2的表达。该INPC线可以分化成神经元和星形胶质细胞作为判断染色针对T​​UJ1和GFAP分别。总之，我们提出一个强大的协议推导和可怕人成纤维细胞的克拉转换成可以提供用于生物医学应用的蜂窝源诸如自体神经细胞替代和疾病建模稳定地膨胀神经祖细胞。

这里，我们提出一个综合过程，允许一代从人成纤维细胞已经由从皮肤钻取活组织检查内小于8周（ 图1）中获得诱导的神经祖细胞（iNPCs）的描述。病人specifc iNPCs可以进一步分化为神经元和神经胶质细胞系和海港的巨大潜力细胞替代治疗和疾病建模。 与Oct4-，Klf4-，Sox2-和c-myc-仙台的成纤维细胞感染病毒的neuroinductive介质条件下22,31导致成纤维细胞和殖民地...

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Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

诱导多能干细胞的产生提供了用于自体移植的推导引人入胜的前景。然而，通过多能状态和艰苦的再分化仍然进展阻碍临床翻译。在这里，我们描述了成年人成纤维细胞的衍生和其直接转化为诱导神经祖细胞和随后的分化成神经谱系。

成人人成纤维细胞的推导和他们直接转换成可扩展的神经祖细胞

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

在发展中国家斑马鱼的前脑的神经祖细胞克隆相关的定时实时成像

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

科研

神经科学

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

神经细胞集落形成细胞分析检测，以区分善意的神经祖细胞的神经干细胞

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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在完整的感觉器官前体细胞的活细胞成像果蝇蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

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Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

从人多能神经嵴前体细胞的无饲养推导干细胞

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神经干细胞和祖细胞来自成年小鼠脑室下区细胞分选和实时成像的细胞周期动力学

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Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

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Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

通过Sialoglycan的代谢标记识别主要神经干细胞和祖细胞的细胞表面标记

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

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利用 PiggyBac 载体将人诱导的多能干细胞 (Ipsc) 转化为功能性脊柱和颅内运动神经元

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...