Name: engineered 3d silk-collagen-based model of polarized neural tissue
Uploaded: 2015-10-23T14:00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue at JoVE.com

We thank the laboratory of Dr. Stephen Moss for providing embryonic rat brain tissues. M.D.T. designed the original protocol. This work was funded by National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. was supported with Postdoctoral Fellowship from German Research Foundation (DFG) (CH 1400/2-1).

Протокол изоляции ткани мозга была одобрена Institutional Комитета по уходу и использованию животных Университета Тафтса по и соответствует Национальных Институтов Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (Institutional Animal Care и использования комитета B2011-45). 1. Подготовка Шелковый леса <ol><li> Подготовка раствора из шелка тутовый шелкопряд коконов, как описано ранее 19,20. <ol><li> Разрежьте каждый кокон на 8 равных частей с помощью ножниц. Используйте около 11 коконов в течение 5 г фрагментированных коконов. (15 мин) </li><li> Подготовьте 2 л 0,02 М Na 2 CO 3 раствором и довести его до кипения, используя горячую плиту. (15 мин) </li><li> Взвесьте 5 г фрагментированных коконов и варить их в Na 2 CO 3 раствором в течение 30 мин. Движение кипящей шелковые каждую пару минут с помощью шпателя. Этот шаг, называемый также де-гуммирование, очищает фиброин шелка из гидрофильных белков, sericins. (30 мин) </li><lя&gt; Отожмите фиброин от руки и промойте его в дистиллированной воде, по крайней мере три раза, чтобы промыть все оставшиеся серицин и химических веществ. (5 мин) </li><li> Поместите влажный фиброин на чашку Петри и высушить экстракт фиброина в капот потока O / N. </li><li> На следующий день взвешивают сухой массы фиброина и поместите фиброин в стеклянном стакане. (15 мин) </li><li> Для того, чтобы растворить фиброин в 9,3 М растворе LiBr, рассчитать необходимый объем (в мл) LiBr путем умножения массы сухого фиброина на 4. Медленно залить LiBr раствора над шелковой фиброина и погружают все фиброина волокон с помощью шпателя. Накройте стакан для предотвращения испарения и поместить его при 60 ° С в течение 4 ч, чтобы позволить волокна, чтобы растворить. (15 мин) </li><li> Использование шприца, собирать фиброина решение от стакана и загрузить его в MWCO 3500 диализных кассетах. Выполнение диализ против дистиллированной воды в течение 48 ч. Меняйте воду каждые два часа. </li><li> Использование шприца, собирать фиброина решение откассеты в 50 мл конические пробирки и центрифугируют дважды при 9000 оборотах в минуту (~ 12700 х г) при 4 ° С в течение 20 мин. Налейте надосадочную жидкость в новую пробирку после каждого шага центрифугирования и отбросить гранул. (40 мин) </li><li> Измерение концентрации фиброина путем оценки сухого веса. Залить 1 мл раствора шелка в весовой лодке. Сушат образца в печи при 60 ° С в течение 2 ч. Взвесить сухой фиброин шелка и расчета концентрации шелка фиброина раствора путем умножения полученного вес 100. ожидаемую концентрационную шелка раствора 6-9% (вес / объем). </li><li> Регулировка концентрации шелка до 6% (вес / объем) разбавлением дистиллированной водой. Остановка точка: жидкость шелк фиброина можно хранить при 4 ° С в течение одного месяца в закрытом контейнере. </li></ol></li><li> Подготовка пористых каркасов из шелка решения. <ol><li> Сито гранулированного NaCl, чтобы отделить гранулы размером 500-600 мкм, который будет использоваться на последующих этапах. Откажитесь от гранулс размером менее 500 мкм и выше 600 мкм. (15 мин) </li><li> Налейте 30 мл 6% раствора шелка в политетрафторэтилена (ПТФЭ) формы (Рисунок 1). Аккуратно рассеивают 60 г просеянной NaCl над шелка. Нажмите контейнер, чтобы получить однородный слой соли. Инкубируют 48 ч при комнатной температуре для полимеризации шелк. </li><li> Поместите строительных лесов, содержащего ПТФЭ форму в печи при 60 ° С в течение 1 часа, чтобы завершить полимеризацию и испарить оставшуюся жидкость. </li><li> Поместите содержание ПТФЭ плесени в химический стакан, содержащий 2 л дистиллированной воды в течение 48 ч, чтобы выщелачивание соли. Менять воду 2-3 раза в день. Извлеките губку каркасов из форм, когда соль полностью вымывается точки остановки:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания. </li><li> Когда все будет готово, вырезать подмости с 5 мм диаметром биопсии удар. Нарезанные каркасов для достижения около 2 мм в высоту. ПуNCH ​​из центра на эшафот с 2 мм биопсии удар диаметр (рис 2А). (1 час) </li><li> Автоклав каркасов погружают в воду, чтобы стерилизовать их (мокрый цикл, 121 ° C, 20 минут) Остановка точку:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания. </li><li> Перед запланированной посева клеток, погружают каркасов в стерильной 0,1 мг / мл поли-D-лизином раствора (PDL). Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. </li><li> Промыть 3 раза каркасы с фосфатным буферным раствором (PBS), чтобы удалить не связанный PDL. (30 мин) </li></ol></li></ol> 2. Выделение Крыса корковых нейронов <ol><li> Проанализируйте кору из эмбриональных день 18 (E18) Спрэг Dawley крыс, как описано ранее Пачифичи и Перуцци 27 после утвержденного протокола животное получается. (2 ч) </li><li> Инкубируют 10 кору в 5 мл 0,25% трипсина с 0,3% ДНКазы I (от поджелудочной железы быка) в течение 20 мин при 37 ° С. </li><li> Инактивации трипсина, добавив равный объем 1 мг / мл соевого белка. </li><li> Растирают кору, используя 10 мл пипетки Пастера от пипетки вверх и вниз 20 раз, пока один клеточной суспензии не генерируется. Будьте нежны и избежать образования пузырьков воздуха. (10 мин) </li><li> Центрифуга клеточной суспензии в 127 мкг в течение 5 мин. </li><li> Повторное приостановить осадок клеток в 10 мл культуральной среды (Neurobasal среднего, 1x B27 добавки, 1x Glutamax, 1% пенициллина / стрептомицина). Граф клеток. Ожидаемый концентрации клеток примерно 2х10 7 / мл. (20 мин) </li></ol> 3. Построить Ассамблею и культура <ol><li> Леса посев с клетками. <ol><li> Перемещение стерильные каркасов и все необходимые столовые приборы внутри капот культуре клеток. Использование стерильного пинцета поместить каркасы в клеточной культуре 96-луночного планшета выделении одного каркас на лунку. (10 мин) </li><li> Погрузитесь каркасов в среде для культивирования клеток, чтобы уравновесить их до клеток семениIng. Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. (10 мин) </li><li> Аспирируйте избыток среды от лесов. </li><li> Применить 100 мкл клеточной суспензии / эшафот. (10 мин) </li><li> Инкубируйте клетки при 37 ° CO / N, чтобы для прикрепления клеток к плахе. </li><li> На следующее утро аспирации непривязанными клетки и применить 200 мкл / лунку свежую культуральную среду. (10 мин) </li></ol></li><li> Строительные леса встраивания с коллагеновой матрицы. (2 ч) <ol><li> Поместите 10x PBS, водой, 1 N NaOH и хвоста крысы коллагена на льду. Подготовка рабочего раствора коллагена в соответствии с инструкциями производителя. Поддержание на льду до конструкты клеток-затравку не готовы (до 1 ч). </li><li> Удалить клеточные семенами шелковые конструкции из инкубатора и аспирата избыток среды. </li><li> Использование стерильного пинцета передачи каркасов на пустые лунки на пластину погружают а каждый и каркас в 100 мкл 3 мг / мл раствора коллагена. Поместите планшета для культуры ткани обратнов инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить полимеризации коллагена. </li><li> Применить 100 мкл подогретого клеточной культуральной среды / лунку. Культура конструкты в течение одной недели замены среды ежедневно путем замены только половину объема среды. </li></ol></li></ol> 4. Анализ микроскопии <ol><li> Live / мертвых окрашивания (1 час) <ol><li> Подготовка исходного раствора пропидийиодидом (PI) 1 мг / мл (1,5 мМ) в дистиллированной воде. </li><li> Подготовка исходного раствора флуоресцеина диацетата (FDA) 2 мг / мл в ацетоне. </li><li> Подготовить рабочий раствор, содержащий 10 мкМ PI и 0,15 мкМ FDA разбавленный в PBS. Предварительно нагреть раствор до 37 ° С на водяной бане. </li><li> Вымойте клеток с подогретого PBS, чтобы удалить сывороточные эстеразы. Аспирируйте PBS. </li><li> Нанесите подогретого рабочего раствора на клетки в течение 2 мин и промойте его PBS. </li><li> Используйте эпифлуоресцентной микроскопа изображение клетки (ПИ экс λ = 490 нм, λ = EM 570 нм; FDA экс Л = 490 Нм, ет λ = 514 нм). Пятно остается стабильным в течение 40 мин. Длительное окрашивание может привести к неспецифической окрашивания в результате поглощения PI клетками и со-локализации ИП / FDA в клетках. </li></ol></li><li> Иммуноокрашивание <ol><li> В заданное время точки культуры фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре. Из-за токсичности PFA дымит шаг крепления должны быть выполнены в химической вытяжкой. </li><li> Промыть каркасов с 3x PBS точки остановки:. ПФА-фиксированные конструкции могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение нескольких дней, прежде чем приступить дальнейших шагов. </li><li> Инкубируйте каркасов в 0,2% Triton, 0,25% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS, содержащие первичное антитело O / N при 4 ° С. </li><li> На следующий день отказаться от окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного первичного антитела. </li><li> Инкубируйте образцы с вторичным антителом, разведенным в 0,2% Тритон, 0,25% BSA в PBS в течение 2ч при комнатной температуре. </li><li> Удалить окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного вторичного антитела. </li><li> Изображение каркасы, использующие конфокальной микроскопии с 20X цели, принимая 100 мкм Z-секции образца с 1 мкм шагом. Для визуализации тонких нейриты разрешение изображения должно быть минимальной 1,024 х 1,024 пикселей. </li></ol></li><li> РНК, ДНК и белка изоляция Примечание: РНК, ДНК и выделение протеина, использу коммерческий AllPrep ДНК / РНК / белок Mini Kit в соответствии с инструкциями производителя. <ol><li> Использование стерильного пинцета передачи каркасов из культурального планшета в 2 мл стерильной пробирке. Разместите один эшафот за трубку. </li><li> Добавить 200 мкл буфера RLT в каждую пробирку. </li><li> Лишить конструкцию фрагментируя его стерильными microscissors. </li><li> Для гомогенизации нарушенную ткань, передавать содержимое тубы на ротационную колонку. Спин в течение 2 мин на полной скорости в микроцентрифуге.Лизат гомогенизируют, как она проходит через ротационную колонку. </li><li> Собирают поток через и использовать его немедленно выделения РНК, ДНК и белка в соответствии с протоколом производителя. </li><li> Количественно выход нуклеиновых кислот любой другой совместимый метод (например, NanoDrop). </li><li> Количественная выход белка, используя BCA анализа белка в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте результаты анализа с помощью планшетного на длине волны 562 нм. Примечание: Ожидаемый выход нуклеиновых кислот и белка в конструкции по отношению к плотности клеток, показан на рисунке 4. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Public+health+principles+and+neurological+disorders.">Chapter 1, Public health principles and neurological disorders.</a> Neurological Disorders. , (2005).</li><li>Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+Quantitative+targeted+proteomics+for+understanding+the+blood-brain+barrier:+towards+pharmacoproteomics.">T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics.</a> Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).</li><li>Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+energy+demands+of+signaling+and+nonsignaling+components+in+brain+are+conserved+across+mammalian+species+and+activity+levels.">Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).</li><li>Wesseling, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+metabonomic+and+proteomic+approach+identifies+frontal+cortex+changes+in+a+chronic+phencyclidine+rat+model+in+relation+to+human+schizophrenia+brain+pathology.">A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology.</a> Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).</li><li>Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+axons+in+three-dimensional+astrocyte+cultures.">The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures.</a> Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Res. 1158, 103-115 (2007).</li><li>East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+astrocytes+increases+neuronal+growth+in+three-dimensional+collagen+gels+and+is+maintained+following+plastic+compression+to+form+a+spinal+cord+repair+conduit.">Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).</li><li>Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+survival+of+in+vitro+engineered+nervous+tissue+derived+from+the+specific+neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Hogberg, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+3D+model+of+human+brain+development+for+studying+gene/environment+interactions.">Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions.</a> Stem Cell Res Ther. 4, S4 (2013).</li><li>Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millimeter-sized+neural+building+blocks+for+3D+heterogeneous+neural+network+assembly.">Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly.</a> Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).</li><li>Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+three-dimensional+culture+of+neural+stem/progenitor+cells+in+collagen+type-1+gel.">Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel.</a> Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).</li><li>Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+formulation+determines+cell+fate+of+fetal+and+adult+neural+progenitor+cells.">Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells.</a> Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).</li><li>Gurkan, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al..Simple+precision+creation+of+digitally+specified,+spatially+heterogeneous,+engineered+tissue+architectures.">et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures.</a> Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).</li><li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering.">Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+with+long-distance+axon+tracts+for+determining+functional+connectivity.">Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity.</a> J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).</li><li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue.">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).</li><li>Rockwood, D. N., Preda, R. C., Y&#252;cel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin.">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).</li><li>Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+film+culture+system+for+in+vitro+analysis+and+biomaterial+design.">Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design.</a> J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).</li><li>Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+framework+for+clustering+and+quantitative+analysis+of+white+matter+fiber+tracts.">A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts.</a> Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).</li><li>Vepari, C., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+as+a+biomaterial.">Silk as a biomaterial.</a> Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).</li><li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-leached+silk+scaffolds+with+tunable+mechanical+properties.">Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).</li><li>Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+aqueous-derived+biomaterial+scaffolds+from+silk+fibroin.">Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin.</a> Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).</li><li>Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicoidal+multi-lamellar+features+of+RGD-functionalized+silk+biomaterials+for+corneal+tissue+engineering.">Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).</li><li>Hopkins, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+hydrogels+as+soft+substrates+for+neural+tissue+engineering.">Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering.</a> Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).</li><li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells:+A+quick+protocol.">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol.</a> Vis. Exp. (63), e3965 (2012).</li></ol>

Публикация этого видео-статьи авторами Corning.

Here we described the guidelines to assemble a compartmentalized 3D brain-like tissue model. The model is characterized by dense polarized culture of neurons resulting in the development of two morphologically different compartments: one containing densely packed cell bodies, second containing pure axonal networks. Overall, the scaffold architecture and growth pattern mimic brain cortical tissue including the six laminar layers and white matter tracts21.
The donut-shaped silk protein-based tissue model allows for modifications and tuning of mechanical properties, versatile structural forms, hydrogel fillers and cellular components. Thus, this tissue model establishes a base platform for a wide range of studies. Silk is a favorable candidate for biomaterial platforms due to its biocompatibility, aqueous-based processing, and robust mechanical and degradation properties22. The silk matrix also serves as a stable anchor to reduce collagen gel contraction over time in culture. The properties such as silk concentration and porosity of the scaffold used in this model have been previously adjusted to achieve optimal cell growth and mechanical properties resulting in brain-like tissue elasticity18,23,24. We suggest to keep these parameters constant to ensure the successful outcome and reproducibility of the experiments.
The 3D neuronal network formation was achieved by combining two types of biomaterials with different mechanical properties: a stiff scaffold to provide neuronal anchoring and a softer gel matrix to permit axon penetration and connectivity in 3D. Selective material preferences of the silk scaffold and soft hydrogel provide the underlying principle for compartmentalizing the neurons from the axonal connections. Due to the inert nature of the silk scaffold, functionalization with poly-D-lysine is required for neuronal attachment. However, other cell adhesion promoting factors can be applied such as RGD25 or fibronectin26. To achieve the 3D network formation the silk scaffold needs to be filled with hydrogel in a timely manner as soon as neurons are attached to the scaffold. Likewise, the collagen matrix filler can be replaced by other hydrogels, thus allowing the study of the influence of 3D extracellular environments on axonal network formation to serve as a platform to evaluate novel hydrogels in terms of neuronal compatibility. Additionally, apart from rat cortical neurons other neuronal sources such as hippocampal neurons or induced pluripotent cell (iPSc)-derived neurons can be utilized. Moreover, the tissue model can be used to study heterocellular interactions by including glial cells along with neurons and to build more complex brain-like tissue.
As shown previously, our model can be utilized to evaluate neuronal functionality in 3D microenvironment with a variety of assays such as cell viability, gene expression, LC-MS/MS and electrophysiology, thus demonstrating physiological relevance of the model18. Other methods, which are frequently utilized to evaluate 3D tissue-engineered constructs, such as immunostaining and microscopy8,9,11 can also be used to assess cell distribution and extent of axonal network formation. However, it has to be noted, that due to the high density of the collagen matrix, the penetration of antibodies and depth of the imaging is limited to few hundred micrometers. Moreover, the signal to noise ratio may be affected by nonspecific background fluorescence. This can be overcome by using lipophilic cell tracers and genetically expressed fluorescent proteins which diminish the need for immunostaining11. Alternatively, the imaging can be performed with 2-photon microscopy instead of usual one-photon technique, which may reduce the signal loss, photobleaching, and can be extended to several hundred micrometers of depth.
Summarizing, the silk and collagen-based brain-like tissue offers a robust platform to study neuronal networks in 3D and is a starting point for the development of more advanced models of neurological disorders in the future. Independent from the mode of evaluation, the relative simplicity of this tissue model supports its utility, success and reproducibility.

Центральная нервная система (ЦНС) могут быть затронуты различными нарушениями, связанных с сосудистой, структурные, функциональные, инфекционный или дегенеративный. По оценкам 6,8 млн человек ежегодно умирают в результате неврологических расстройств, что представляет собой растущую социально-экономическое бремя во всем мире 1. Тем не менее, лишь немногие из нарушений есть доступные процедуры. Таким образом, существует острая необходимость в инновационных терапевтических стратегий для пациентов, страдающих от неврологических расстройств. К сожалению, многие ЦНС целевые терапевтические неудачу в ходе клинических испытаний, в частности, из-за использования неадекватных доклинических исследований моделей, которые не позволяют оценить острых и хронических воздействий с физиологически соответствующих функциональных показаний. Несмотря на значительные усилия исследования в течение последних десятилетий, есть огромное количество неизвестно о структуре и функции ЦНС. Для того, чтобы получить больше знаний, модели животных часто намред модели патологических состояний, таких как травмы головного мозга травматического (TBI) или слабоумия, особенно в доклинических исследованиях. Тем не менее, животные существенно отличаются от людей как в анатомии ЦНС, а также в функции, экспрессии генов и метаболизма 2-4. С другой стороны, 2D культур в пробирке являются распространенным методом для исследования клеточной биологии и которые обычно используются для открытия новых лекарств. Однако культуры клеток 2D хватает сложность и физиологическое значение по сравнению с человеческим мозгом 5-7. Хотя не является заменой для низкой стоимости и простоты 2D исследований на клеточных культурах или сложности, предоставленной на животных моделях, 3D тканевой инженерии может генерировать усовершенствованные исследовательские модели, чтобы закрыть разрыв, который существует между 2D в пробирке и в естественных подходов. 3D тканевой инженерии обеспечивает более физиологически соответствующие экспериментальные условия, достигнутые 3D межклеточных взаимодействий и внеклеточных сигналов, предусмотренных биоматериала лесов. DespITE значительное доказательство за стоимости 3D культур, в настоящее время существует лишь несколько моделей ткани 3D ЦНС, таких как стволовые клетки получены Органоид культур 8-10, neurospheroids 11 и диспергируют гидрогеля культуры 12,13. Перспективные технические методы, включая многослойной литографии 14, и 3D-печати 15 были использованы для изучения легких, печени, почек и ткани. Тем не менее, есть отсутствие моделей 3D ЦНС, которые позволяют на секции роста нейронов, таких как имитируя корковой архитектуру и биологию. Отдельно рост нейритов из нейрональных клеток органов ранее продемонстрировано в 2D культур с помощью микрообработки 16,17 позволяя изучение трассировки аксонов тракта, притока кальция, сетевой архитектуры и деятельности. Эта идея вдохновила нас к разработке 3D поляризованного нервной ткани, где сотовые органы и аксонов массивы, расположенные в разных отсеках имитируя многоуровневую архитектуру мозга 18 </sup&gt;. Наш подход основан на использовании уникального дизайна шелковой лесов который вмещает высокую плотность клеток в ограниченном объеме и позволяет разрастание плотной аксонов сети в коллагеновый гель. Здесь мы демонстрируем полную процедуру сборки головного мозга, как ткани, включая изготовление лесов и нейронов культуры.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiBr</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>213225</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MWCO 3500 dialysis cassettes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>66110</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>No. 270, No. 35, No. 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE mold</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71382</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 5mm</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501909</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 2mm</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501908</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>final concentration 10 ug/ml, dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>final concentration 0.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522-100MG</td>
			<td>final concentration 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>warm up to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement 50x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>final concentration 3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-10MG</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7378-5G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;IIITubulin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2200</td>
			<td>rabbit 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa-546</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010</td>
			<td>goat 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-5ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP2 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>objective 20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023&#160;</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader Spectramax M2</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td>absorbance 562 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors, Economy, Vannas-type</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>1346</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered 3d silk-collagen-based model of polarized neural tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Твердые шелковые губки нарезанные по форме пончика, представляют собой уникальную и простую идею, чтобы достичь разобщенным архитектуру, напоминающую нервной ткани (рис 2а). Высоко пористая структура помост с размером пор 500 мкм приводит к исключительно высокой площадью поверхности, позволяющих посев и рост высокой плотности клеток в малом объеме (2x10 7 / мл) (2В). Кроме того, высокая пористость эшафот позволяет для неограниченного распространения питательных веществ и отходов, образующихся в превосходной жизнеспособности плотных клеточных культур в течение длительного времени кадров. После посева нейроны быстро и равномерно прикрепить к поверхности каркасных порах. После прикрепления клеток является полным и клетки уравновешивали в шелковой подложке, губка каркас заполняется мягкой коллагеновой матрицы, чтобы обеспечить среду для 3D аксонов формирования сети (рис 3 </strong&gt;). При отсутствии в коллагеновой матрице Компартментализация аксонов и клеточных тел невозможно, так как нейроны растут расширения только на поверхности пор в результате смешанных сетей, как обнаружено с 2D поверхностей (фигура 3В). В противоположность этому, коллагеновый гель обеспечивает сетчатую структуру, которая поддерживает обширный аксонный отросток в 3D, а нейронные клеточные тела остаются прикрепленными к шелковой помост (рис 3C). Эта модель роста приводит к разобщенности клеток органов и чистых аксонов сетей (рис 3D), который напоминает серого и белого вещества коры головного мозга. Помимо микроскопии, конструкции могут быть оценены с различными другими методами 18, в зависимости от вопроса за эксперимента. Например, выделение ДНК, РНК и белка из конструкций может быть легко выполнена с использованием коммерческих наборов (рисунок 4). Выход нуклеиновых кислот и белков PEг конструкция зависит от количества клеток изначально посеянных на шелковых каркасов. Чем больше клеток высевали тем выше выход ДНК, РНК и белка. <img alt="фигура 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> Рисунок 1. ПТФЭ формы используются для приготовления шелк губка лесов Размеры:.. 10 см в диаметре, 2 см высота <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> Рисунок 2. 3D мозга, как модель ткани. (А) пористого шелк губка эшафот. (Б) Live / мертвых окрашивания нейронов в 1 день на посев на шелковой эшафот, прежде чем коллаген встраивания (зеленый-живых клеток, красных мертвые клетки). Панели на правой стороне показать маgnification площади захваченного в красных рамках. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> Рисунок 3. нейронов разобщенным вырост в 3D-модели мозга, как ткани (A) Леса отсеков:. Кузовом купе красных клеток, Blue-купе аксонов. (Б) нейронов модель роста в 1-й день после посева до коллагена вложения. (С). Нейронов вырост на 7 день после посева в теле клетки отсека. (D) нейронов вырост на 7 день после посева в аксонов отсеке. Зеленый -. ΒIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этого</a>фигура. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> Рисунок 4. Ожидаемые выход (A) РНК и ДНК, и (б) белка в конструкции по отношению к количеству клеток, посеянных на эшафот (± SD, п = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue at JoVE.com

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Инженерная 3D Шелковый коллагена на основе модели поляризованного нервной ткани

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

engineered-3d-silk-collagen-based-model-of-polarized-neural-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Электрическое поле контролируемых Режиссер миграции нервных клеток предшественников в 2D и 3D среде

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Магнитно резонансная Эластография методологии по оценке тканей Разработан Construct роста

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Протокол Относительная оценка гидродинамических трехстворчатый клапан полимеров

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Тканевая инженерия человеческого 3D<em&gt; В пробирке</em&gt; Опухоль Тестовая система

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Генерация и прививка тканевой инженерии сосудов в мышиной модели

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Производственные, характеристики и потенциальные возможности использования в 3D тканевой инженерии человека пищевода слизистой модели

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Комбинированный 3D Tissue Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; В Silico</em&gt; Lung Опухоль модель для прогнозирования эффективности наркотиков в конкретных мутационные Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Заполнение и имплантации биосинтетических ткани инженерии трахеи трансплантата в мышиной модели

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

Ткань-инженерный трансплантат для обрезанной реконструкции пищевода у крыс

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...