Name: a 3d human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection
Uploaded: 2015-10-05T16:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection at JoVE.com

The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Link&#246;ping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Link&#246;ping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.

<ol>
	<li>Sakamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Veterinary pathology. 49, 423-439 (2012).</li><li>Saunders, B. M., Britton, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+in+the+granuloma:+immunopathology+of+tuberculosis.">Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis.</a> Immunol Cell Biol. 85, 103-111 (2007).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+issues+in+tuberculosis.+Ann+Rheum+Dis.">New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis.</a> Ann Rheum Dis. 63, ii50-ii56 (2004).</li><li>Morrison, J., Pai, M., Hopewell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis+and+latent+tuberculosis+infection+in+close+contacts+of+people+with+pulmonary+tuberculosis+in+low-income+and+middle-income+countries:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of people with pulmonary tuberculosis in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect Dis. 8, 359-368 (2008).</li><li>Barry 3rd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+latent+tuberculosis:+rethinking+the+biology+and+intervention+strategies.">The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 845-855 (2009).</li><li>Puissegur, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+dual+model+of+mycobacterial+granulomas+to+investigate+the+molecular+interactions+between+mycobacteria+and+human+host+cells.">An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells.</a> Cell Microbiol. 6, 423-433 (2004).</li><li>Kapoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granuloma+In+Vitro+Model,+for+TB+Dormancy+and+Resuscitation.">Human Granuloma In Vitro Model, for TB Dormancy and Resuscitation.</a> PLoS One. 8, e53657 (2013).</li><li>Nguyen Hoang, ., T, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+functional+properties+in+a+three-dimensional+tissue+model+of+human+lung+mucosa.">Dendritic cell functional properties in a three-dimensional tissue model of human lung mucosa.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L226-L237 (2012).</li><li>Parasa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Mycobacterium+tuberculosis+early+granuloma+formation+in+experimental+human+lung+tissue.">Modeling Mycobacterium tuberculosis early granuloma formation in experimental human lung tissue.</a> Dis Model Mech. 7, 281-288 (2014).</li><li>Cozens, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+and+chloride+secretion+in+polarized+immortal+human+bronchial+epithelial+cells.">CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).</li><li>Brighenti, S., Andersson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+immune+responses+in+human+tuberculosis:+learning+from+the+site+of+infection.">Local immune responses in human tuberculosis: learning from the site of infection.</a> J Infect Dis. 205, S316-S324 (2012).</li><li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection.">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136, 37-49 (2009).</li><li>Gupta, U. D., Katoch, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis.">Animal models of tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 85, 277-293 (2005).</li><li>Kashino, S. S., Napolitano, D. R., Skobe, Z., Campos-Neto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guinea+pig+model+of+Mycobacterium+tuberculosis+latent/dormant+infection.">Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection.</a> Microbes Infect. 10, 1469-1476 (2008).</li><li>Singhal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+tuberculosis+in+the+Wistar+rat:+a+model+for+protective+immunity+and+control+of+infection.">Experimental tuberculosis in the Wistar rat: a model for protective immunity and control of infection.</a> PLoS One. 6, e18632 (2011).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase-4+inhibition+alters+gene+expression+and+improves+isoniazid-mediated+clearance+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+rabbit+lungs.">Phosphodiesterase-4 inhibition alters gene expression and improves isoniazid-mediated clearance of Mycobacterium tuberculosis in rabbit lungs.</a> PLoS Pathog. 7, e1002262 (2011).</li><li>Lin, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+neutralization+results+in+disseminated+disease+in+acute+and+latent+Mycobacterium+tuberculosis+infection+with+normal+granuloma+structure+in+a+cynomolgus+macaque+model.">Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model.</a> Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).</li><li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+immune+responses+in+human+tuberculosis:+few+CD8++effector+T+cells+but+elevated+levels+of+FoxP3++regulatory+t+cells+in+the+granulomatous+lesions.">Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions.</a> Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination. 
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9. 
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions. 
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11. 
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.

В людях, ответы на инфекции, воспаление тканей, клеточной найма, ремоделирования ткани и регуляции гомеостаза тканей являются сложными мероприятия с участием различных типов клеток. Следовательно, эти процессы лучше всего изучать в локальной среде ткани. Ранее это было возможно, главным образом, с использованием экспериментальных моделей на животных. Однако широко используемые экспериментальные животные провести много ограничений, поскольку они часто отвечают на патогенов по-разному, чем люди, а также отображать различные течения заболевания 1. У человека в пробирке модель легочной ткани имеет возможности изучать специфические иммунные реакции в легких человека. Заражение человека туберкулезом (ТБ) в основном заболевание, поражающее легкие. Микобактерии туберкулеза (микобактерии туберкулеза), возбудитель туберкулеза, достигает легких через аэрозольных капель, которые транспортируются к альвеолярной пространства, где бактерии охвачен легких dendriтик клетки и альвеолярные макрофаги как часть врожденной иммунной реакции на инфекцию. 2,3 Фагоцитоз возбудителя приводит к разобщенности ошибка в пределах фагосомы и идеально приводит к нейтрализации и убийства возбудителя по фагоцита. До 50% лиц, подвергшихся М. туберкулез, как полагают, чтобы иметь возможность очистить инфекции через врожденного иммунного ответа 4. Другие результаты инфекции оформление по адаптивной иммунной системы на более позднем этапе, латентной инфекции или в худших случаях хронический активный болезнь 5. Раньше не было никаких моделей тканей в пробирке для исследования человеческого туберкулеза. Одиночные клеточные культуры человеческих макрофагов, или других клеток периферической крови часто использовались 6,7. Недостатком этого подхода является то, что они не могут отражать динамику различных типов клеток, работающих вместе в легочной ткани воздействия M. туберкулез </eм&gt;. Таким образом, существует потребность в модели ин витро, чтобы иметь возможность выполнять функциональные и механистических исследований на ТБ. Ячейка основе в пробирке модель человеческого легочной ткани, описанной здесь первоначально был создан в нашей группе по изучению дендритных клеточных функций 8. Мы адаптировали этот метод для исследования туберкулеза. Модель человеческого легочной ткани, представленные здесь состоит из ткане-специфических эпителиальных клеток и фибробластов 8. Эти клетки культивируют в матрице коллагена в верхней части пористую мембрану в Transwell вставки и формы структуры, напоминающие нормальную человеческую ткань легких (рисунок 1). При соприкосновении с воздухом клетки начинают вырабатывать слизь в апикальной стороне 8. По имплантации первичных макрофагов человека заражены М. туберкулез модели, мы наблюдали, как иммунные клетки мигрируют в ткани и образуют ранние этапы гранулем туберкулеза 9. Это первый человек модель ткани DESCRibed туберкулеза и представляет многообещающую инструмент для изучения врожденных иммунных ответов на ТБ и других заболеваний легких. На сегодняшний день, мы использовали только моноциты и макрофаги, как иммунные клетки в модели, но уровень сложности может быть увеличена путем включения соответствующих дополнительных типов клеток. <img alt="фигура 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Рисунок 1. Схема очертания модели легочной ткани. (А) Модель состоит из легких конкретных эпителиальных клеток человека, М. туберкулез -infected первичных макрофагов и красный краситель, помеченные моноциты высевают на коллагеновых встроенные фибробластов, полученных на Transwell фильтра. Воздействие на модели ткани на воздухе инициирует производство внеклеточных матричных белков, секрецию слизи и стратификации эпителием. Модель 3D ткани, таким образом, разработаны является полезным инструментом для изучения М. инфекции туберкулеза в окружающую среду, что ССНСэли напоминает человеческую легких. (B) Типичные микроскопических изображений на различных этапах подготовки модели ткани. (С) Полная структура раздела модели легочной ткани. Масштаб -. 100 мкм <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells, lung fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC#CCL-171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16HBE cells, lung epithelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (5 x DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-082</td>
			<td>Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with glucose (DMEM) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle&#8217;s salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (71.2 mg/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Heat inactivated for 30 min, 56 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen PA treated (500 ml)</td>
			<td>Organogenesis</td>
			<td>200-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml)</td>
			<td>Advanced biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg)</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human monocytes/macrophages</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human whole blood or buffy coats.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red fluorescent cell linker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 medium&#160;</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook ADC Enrichment</td>
			<td>BBL</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin B sulfate (20 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection

Туберкулез (ТБ) по-прежнему имеет серьезную угрозу для здоровья людей во всем мире, и существует необходимость для экономичных, но надежных моделей, чтобы помочь нам понять механизмы заболевания и продвигать открытия новых вариантов лечения. В пробирке клеточных культур монослоев или со-культуры не хватает трехмерной (3D) окружающей среды и ответов ткани. Здесь мы опишем инновационный в пробирке модель человеческого легочной ткани, которая держит обещание, чтобы быть эффективным инструментом для изучения сложных событий, которые происходят во время инфекции с туберкулезом (Mycobacterium туберкулеза М.). Модель 3D ткань состоит из ткане-специфических эпителиальных клеток и фибробластов, которые культивировали в матрице коллагена в верхней части пористой мембраны. Под воздействием воздуха, эпителиальные клетки наслаиваются и выделяют слизь на апикальной стороне. Вводя первичных макрофагов человека заражены М. туберкулез в режиме тканил, мы показали, что иммунные клетки мигрируют в инфицированной ткани-и образуют ранние этапы гранулемы туберкулеза. Эти структуры воспроизводят Отличительной чертой человеческого туберкулеза, гранулемы, которая принципиально отличается или нет, обычно наблюдается в широко используемых экспериментальных животных моделях. Этот метод позволяет органотипической культура визуализации 3D и надежную количественный анализ, который обеспечивает основную информацию о пространственных и временных характеристик клеток-патоген взаимодействий принимающих. Взятые вместе, модель легочной ткани обеспечивает физиологически соответствующую тканях микро-среды для исследований по ТБ. Таким образом, модель легочной ткани имеет потенциальные последствия для обеих основных механистической и прикладных исследований. Важно отметить, что модель позволяет добавлять или манипуляции отдельных типов клеток, которые, таким образом, расширяет его использование для моделирования различных инфекционных заболеваний, которые влияют на легкие.

3D-модель легочной ткани человеческого туберкулеза могут быть эффективно использованы для изучения хозяин-патоген взаимодействия в М. туберкулезная инфекция. Основные этапы этого способа, представительные микроскопические изображения различных этапов и общей микроскопической структуры раздела тканей описаны на рисунке 1. Модель имеет несколько компонентов человеческой легочной ткани, в том числе легочных фибробластов, бронхиальных эпителиальных клеток и первичных моноцитов / макрофагов встроен в среде 3D ткани. Кроме того, включение компонентов человеческого легочной ткани, модель напоминает физиологических условиях, а именно расслоение эпителия и секрецию слизи. Примером использования модели легких тканей в области мониторинга инфекции ТБ представлена ​​на рисунке 2. Для визуализации М. туберкулез -immune миграцию клеток и взаимодействия, мы ввели макрофаги, инфицированные M. туберкулез, которые выражают GFP(зеленый) вместе с свежеизолированных PKH26 меченных моноцитов (красный) в модели ткани (синий, DAPI окрашенных ядер). На 7 день после того М. туберкулез -infected клетки к модели ткани, конфокальной микроскопии показывает кластеризации красных моноцитов на сайте инфекции (зеленый) (рис 2), которая имитирует отличительной чертой поражения человека ТБ 9. Серия представительных изображений для 3D визуализации М. туберкулез -infected модель ткани и количественная оценка клеточных кластеров показано на рисунке 3. 3D-визуализация дает пользователю гибкость, чтобы взаимодействовать, исследовать и количественно несколько особенностей в 3D изображении. Пространственное расположение зеленых бактерий и красных кластеров моноцитов видно из апикальной, вращательного и боковым видом, как показано на фигуре 3В, который показывает кластеризации моноцитов на участке М. туберкулез. Кластеры не-об-служил в неинфицированных тканей (рис 3а). Мы количественно размер и количество моноцитов кластеров клеток и обнаружили, что размер (объем) кластеров клеток усиливается (р &lt;0,001), в то время как число индивидуальных моноцитов уменьшилось (р &lt;0,01) в М. туберкулез инфицированных тканей по сравнению с моделями неинфицированных тканей (фиг.3С и 3D). Эти данные подтверждает нашу предыдущую нахождение начале формирования гранулемы в М. туберкулезная инфекция наблюдается в моделях легочной ткани, анализируемых в 2D срезов 9. Наши данные показывают, что модель ткани обеспечивает естественную среду обитания 3D исследовать комплекс хозяина клеточную М. Сеть туберкулез связи. Мы также обнаружили, что 3D визуализация и количественный анализ являются лучшими инструментами для изучения особенностей в модели ткани (рисунок 3). Количественное определение кластера чеек (гранулемы, например) часто стретч<html> HES до нескольких слоев клеток и может быть полностью захвачен 3D количественного анализа. Кроме того, визуализация точных пространственных и временных характеристик отдельных клеток или бактерий в модели позволяют жить-изображений, миграция и отслеживания исследования в назначенной лаборатории. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Рисунок 2. моноцитов в модели ткани кластера вокруг опасной М. туберкулез. Представительства конфокальные изображения неинфицированных и М. туберкулез модель инфицированных тканей представлена. Панели из зеленого (М. с туберкулезом GFP), красные (PKH26 меченных моноцитов), синий (DAPI-окрашенные ядра) и объединенные каналы показывают набор моноцитов в инфицированной ткани по сравнению с неинфицированных тканей. Масштаб - 100 мкм.large.jpg &quot;стиль =&quot; Размер шрифта: 14px; высота строки: 28px; &quot;цель =&quot; _blank &quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Рисунок 3. 3D визуализации и количественного анализа модели ткани содержат полезную информацию. Типичные изображения 3D визуализации всей модели ткани (А) незараженные ткани, (Б) инфицированных M. туберкулез, через оптический срезов с использованием Zeiss LSM700 конфокальной микроскопии и количественного анализа Imaris программного обеспечения для обработки изображений (версия 7.6.8). Эти изображения были получены при увеличении 20Х, 14 Z-стеки, охватывающих толщину тканей 19,5 мкм с 1,5 мкм интервала, позволяя визуализацию с апикальной, вращательного горизонтальной, вертикальной и вращательного сбоку (А и В). (С) условиемntitative анализ кластеров моноцитов клеток выявляют расширение (р &lt;0,0001) размер кластеров начале гранулемы после М. туберкулезная инфекция по сравнению с отсутствием инфекции. (D) Количественное определение числа моноцитов показали снижение (р &lt;0,01) в пораженной ткани по сравнению с неинфицированных тканей, вновь более кластеров в инфицированной ткани. Зеленый - М. туберкулез -GFP, красный - PKH26 меченные моноциты, синий - клеточные ядра, шкала -. 100 мкм <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection at JoVE.com

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Инфекция

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Пример подготовки<em&gt; Микобактерий туберкулеза</em&gt; Экстракты для ядерно-магнитного резонанса исследований Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Усиление микрочипов

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Роман микродиссекция подход к Восстановление<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Конкретные Стенограммы из фиксированных формалином и залитые парафином легких гранулемы

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Легионелл везикул наружной мембраны: Выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Анализ 18FDG ПЭТ/КТ изображений как инструмент для обучения микобактерии инфекции и лечение в Non-human приматов

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...