Name: establishment of cancer stem cell cultures from human conventional osteosarcoma
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00
Duration: 9 min 25 s
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This study was supported by ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.

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The authors declare that they have no competing financial interest.

CSC hanno diverse proprietà che permettono l&#39;identificazione di questo particolare sottoinsieme cellulare nella massa tumorale. Sulla base di queste caratteristiche, come la resistenza acquisita citotossica agenti chemioterapici per la sovraespressione di ATP-binding cassette multidrug trasportatori di efflusso 28, 32, 33, o per la upregulation dell&#39;espressione di enzimi detossificanti come ALDH 32, per l&#39;espressione di un particolare marcatore di superficie, come CD133, CD44, CD34, CD90, e altri 30, 34, 35, 41, diversi metodi per isolare CSC sono stati sviluppati 42-44. Una di queste tecniche è il saggio formazione sfera, che si basa sulla capacità di CSC di crescere in condizioni non aderenti. La capacità delle cellule staminali dei tessuti e CSC per formare sfere è stato descritto in studi sulla identificazione delle cellule staminali neurali da Reynolds et al. 37. Successivamente, Gibbs et al. 38 usEd questi studi per iniziare a isolare CSC da tumori solidi, in particolare, dai sarcomi ossei. Abbiamo deciso di utilizzare il metodo di dosaggio formazione sfera illustrato da Gibbs et al. Isolare CSC da linee cellulari ottenute da biopsie OSA OS convenzionali. Abbiamo adattato il metodo originale per migliorare i risultati di questo test e facilitare la sua riproducibilità per altre linee cellulari di cancro. Con riferimento alla costituzione del saggio formazione sfera, abbiamo verificato che placcatura 40.000 cellule / pozzetto è una buona pratica per mantenere le cellule in isolamento all&#39;inizio del saggio. Questo accorgimento è molto importante per evitare la possibilità che le colonie sferiche provengono da aggregazione cellulare e non dalla capacità particolare ed esclusiva di un singolo CSC di crescere in condizioni non aderenti e formare una colonia sferica. Questa capacità è un punto particolarmente critico di questo test. Abbiamo inoltre attestato che per ottenere una buona velocità di formazione sfera, È sufficiente aggiornare aliquote di fattori di crescita ogni 3 d e non tutti i giorni come descritto nel metodo originale. In questo studio, abbiamo anche stabilito e ampiamente descritto un buon metodo per isolare le colonie sferiche che si sono formate quando coltivate in condizioni non aderenti. Questo passaggio è fondamentale in questo saggio perché è molto importante cercare di isolare il maggior numero di sfere possibile che si formano in ciascun pozzetto senza danneggiarle. E &#39;anche importante isolare solo le sfere e non le singole cellule, che possono rimanere in sospensione per la durata del test. Per superare questi punti critici, abbiamo sviluppato un particolare metodo di isolamento, che, come sopra indicato, ha dato buoni risultati per isolamento CSC. Ovviamente, c&#39;è la possibilità che non tutte le sfere che formano possono essere recuperati, ma la percentuale di perdita è molto bassa. In effetti, abbiamo anche la possibilità di utilizzare un filtro con 40 micron pori per isolare sfere dopo diventano grandi (moduloed circa 100 - 200 cellule). Questo isolamento arresta formazione sfera, ma permette alle singole celle, parte del residuo metilcellulosa, e le piccole sfere da filtrare. Tale eliminazione viene eseguita mediante filtrazione completa come descritto nel protocollo. Inoltre, la selezione delle più grandi colonie sferiche attraverso i 40 micron maglia con la conseguente perdita delle colonie sferiche più piccole permette di selezionare le CSC con la più alta capacità di formare colonie sferiche e con maggiore stemness. Tutte queste modifiche sono state eseguite per migliorare l&#39;analisi e per aiutare i ricercatori che studiano CSC di comprendere e riprodurre la fase più critica del metodo originale del saggio formazione sfera. Tra gli studi in materia di metodi in vitro per la CSC isolamento, questo studio ha lo scopo di mostrare come questo saggio formazione sfera adattato potrebbe essere un buon metodo per isolare CSC dalinee cellulari OSA. Gli adattamenti del metodo originale e la tecnica dettagliata isolamento descritti migliorare la sua efficacia. In breve tempo, buon numero di CSC può essere ottenuto e utilizzato per diversi esperimenti. Pertanto, è possibile confermare rapidamente i fenotipi staminali-simili e, in particolare, per studiare il fenotipo doppio stelo-like che caratterizza OS-CSC. Così, questo test modificato potrebbe essere una buona tecnica per isolare CSC e studiare la loro biologia. In futuro, questo metodo, con ulteriori adattamenti, può anche essere utilizzata per isolare CSC da altre linee cellulari tumorali finiti ottenuti da biopsie di tumori solidi rare. La possibilità di isolare CSC da tumori solidi rare come OS, non solo permette il miglioramento degli studi su questo particolare cancro, ma si estende anche a studi di diversi tipi di cancro per sviluppare metodi migliori per il loro isolamento e futuri studi di biologia questo importante sottoinsieme cellulare. Pertanto, come abbiamohanno fatto in questo studio, è importante migliorare i metodi di isolamento CSC attraverso lo studio di CSC biologia, con l&#39;obiettivo finale di trovare bersagli molecolari e di sviluppare una terapia antitumorale molto specifico diretto contro questo particolare sottoinsieme cellulare, che è probabilmente responsabile il mantenimento del tumore primario, lo sviluppo della sua ricorrenza, e l&#39;origine di metastasi in diversi organi. Lo studio di CSC biologia è importante anche per la ricerca di terapie che potrebbero essere incisivo nella cura di tumori, come il sistema operativo, per i quali il tasso di sopravvivenza dopo il trattamento neoadiuvante rimane molto povera.

I sarcomi sono un gruppo eterogeneo di tumori rari del tessuto connettivo maligni provenienti prevalentemente dal mesoderma embrionale 1. I diversi tipi includono sarcomi ossei e sarcomi dei tessuti molli. sarcomi ossei, un gruppo di tumori primari relativamente poco diffusa, costituiti da diversi sottotipi, tra osteosarcoma (OS). OS, uno dei tumori più comuni primari dell&#39;osso, è un tumore maligno mesenchimali che esibisce vasta clinica, istologica e eterogeneità molecolare 2, 3. Sfortunatamente, OS verifica prevalentemente nei bambini e nei giovani adulti 4, 5 e rappresenta il 60% i sottotipi istologici comuni di sarcoma osseo nell&#39;infanzia 6, 7. OS colpisce di solito le aree scheletrici, che sono caratterizzati da una crescita ossea rapida (ad esempio, la metafisi delle ossa lunghe). Tra i istologicamente differenti sottotipi di OS, OS convenzionale, chiamato anche midollare o OS centrale, ha un alto grado di malignità e sha contingentere del 80% 8. Questo 80% è composto da 60% OS convenzionale osteoblastica, 10% OS chondroblastic, e il 10% OS fibroblastico 6, 8-10. Altri sottotipi OS includono anaplastico, telangectasico, gigante ricco di cellule e piccoli OS cellule. Nonostante i progressi della chirurgia e chemioterapia combinata nella gestione del sistema operativo, il risultato rimane scarsa, con un tasso di sopravvivenza a lungo termine del 65-70% nei pazienti senza metastasi 11, 12. Ricorrenze lontane si verificano di frequente come metastasi polmonari o, meno frequentemente, come le metastasi alle ossa lontane e recidive locali 13. Le metastasi sono spesso resistenti ai trattamenti convenzionali. Questa resistenza è la ragione per cui la sopravvivenza libera da malattia a 10 anni è di circa il 30% nei pazienti con malattia metastatica alla diagnosi 14, 15. Come con tessuto normale, tessuto del cancro è composto da un insieme eterogeneo di tipi cellulari. Le cellule all&#39;interno del tumore sembrano corrispondere a diversi stadi di sviluppo. All&#39;interno di ogni ntessuto ormal risiede una sottopopolazione di cellule con la capacità di selfrenew, fornendo così progenitori e cellule mature per omeostasi tissutale. Analogamente, il cancro è composto di una popolazione eterogenea di cellule simili a diversi stadi di sviluppo, con differenti gradi di proliferazione e potenziale oncogeno. Un sottoinsieme di queste cellule tumorali, definito cellule staminali tumorali (CSC), costituisce una riserva di Portante in cellule con la capacità esclusiva di selfrenew e mantenere il potenziale maligno dei tumori, generando così le diverse linee cellulari che costituiscono la massa tumorale 16. Nel 1990, gli studi sulla leucemia mieloide acuta fornito la prima prova convincente per l&#39;esistenza di CSC sottopopolazioni 17, 18. CSC da allora sono stati isolati da un gran numero di tumori solidi 19, diventando così uno degli argomenti più studiati nella ricerca sul cancro. CSC può infatti derivare da cellule staminali normali da mutazioni nei geni che rendono il normalele cellule staminali cancerose 20-23. Mutazioni multiple trasformando e le interazioni con il microambiente potrebbe anche contribuire a progenitori sane e cellule mature che acquisiscono la capacità selfrenewal e l&#39;immortalità che caratterizzano CSC. Ci sono diverse ipotesi su questa trasformazione. Progenitori sane, le cellule mature sane e cellule tumorali, possono dedifferentiate alle cellule staminali, ottenendo un fenotipo staminali come attivando geni selfrenewal-associata 24-28. Nonostante i numerosi studi recenti, le origini del CSC sono ancora da scoprire. Una caratteristica particolare del CSC è che la loro capacità di resistere alla approccio multi-terapia, che consiste di chirurgia e chemioterapia combinata con diversi farmaci. Recenti studi hanno dimostrato che la CSC può anche acquisire resistenza agli agenti chemioterapici citotossici. Le possibili spiegazioni per questa resistenza sono la sovraespressione di ATP-binding cassette (ABC) multidrug transporter (vale a dire,MDR1 e BCRP1), sovraespressione di chemioterapia metabolizzare enzimi come l&#39;aldeide deidrogenasi 1 (ALDH1), e / o cambiamenti nella cinetica del ciclo cellulare 30-33. La conseguenza diretta di tutti questi concetti che sono stati descritti finora è che una terapia del cancro sarebbe efficace solo se la sottopopolazione CSC sono stati completamente eliminato, mentre recidiva locale o metastasi a distanza potrebbero verificarsi se anche un solo CSC sopravvissuto. La scoperta di CSC nei sarcomi umani 34, in particolare OS 35, o in qualsiasi altro tumori ossei e dei tessuti molli, ha una grande importanza clinica in quanto offre una possibile spiegazione del perché molti trattamenti sembrano essere efficaci inizialmente, ma i pazienti in seguito ricaduta. Pertanto, la speranza per il futuro battaglia contro OS convenzionale è quello di trovare nuove e specifiche terapie mirate basata sullo sviluppo di farmaci innovativi diretti a OS-CSC grazie alla caratterizzazione molecolare di questo subpopolazione e allo studio della biologia CSC. Nel 1992, Reynolds e colleghi, che stavano indagando se un sottogruppo di cellule staminali era presente nel cervello dei mammiferi adulti, sviluppato un metodo per isolare le cellule sospettate di essere cellule 36, 37 stem-like. Questo metodo si basa sulla capacità particolare di queste cellule a formare colonie sferiche se coltivate in condizioni non aderenti. Tecniche simili sono state impiegate da Gibbs e colleghi nel 2005 per studiare una sottopopolazione di cellule staminali simil-in sarcomi dell&#39;osso 38. Per isolare e caratterizzare OS-CSC da colture cellulari primarie di diversi tipi di sistema operativo convenzionale, abbiamo deciso di adattare questa tecnica per linee di cellule del sistema operativo. Qui, descriviamo questo metodo adattato del dosaggio formazione ambito, denominato &quot;assay sarcosphere&quot;, che può essere utilizzato per isolare OS-CSC da linee cellulari primarie derivate finite da biopsie umane di OS convenzionale. Noi descriviamo anche tutte le tecniche used per convalidare la radice come CSC fenotipo delle linee cellulari isolate da questo test: 1) valutazione dell&#39;espressione dei geni che caratterizzano pluripotenti cellule staminali embrionali (ESC) e del gene CD133, che è un marker di CSC; 2) (CFU) saggio formanti colonia unità; 3) valutazione della capacità di queste cellule di differenziarsi in osteoblasti e adipociti sotto opportune condizioni di differenziazione; 4) studio dei marcatori di superficie delle cellule staminali mesenchimali (MSC) (vale a dire, CD44, CD105 e Stro-1) per immunofluorescenza e mediante analisi di citometria di flusso; 5) valutazione dell&#39;attività ALDH di queste cellule.

establishment of cancer stem cell cultures from human conventional osteosarcoma

Gli attuali miglioramenti nella terapia contro osteosarcoma (OS) hanno prolungato la vita dei pazienti affetti da cancro, ma il tasso di sopravvivenza di cinque anni rimane scarsa quando si è verificato metastasi. L&#39;(CSC) teoria Cancer Stem Cell ritiene che ci sia un sottogruppo di cellule tumorali all&#39;interno del tumore che hanno caratteristiche staminali-simili, compresa la capacità di mantenere il tumore e di resistere chemioterapia multifarmaco. Pertanto, una migliore comprensione della biologia del sistema operativo e la patogenesi è necessaria al fine di promuovere lo sviluppo di terapie mirate per sradicare questo particolare sottoinsieme e per ridurre la morbilità e la mortalità tra i pazienti. Isolando CSC, che stabilisce colture cellulari di CSC, e studiare la loro biologia sono importanti passi per migliorare la nostra comprensione della biologia del sistema operativo e la patogenesi. La creazione di OS-CSC di derivazione umana da biopsie di OS è stato reso possibile utilizzando diversi metodi, tra cui la capacità di creare colture di cellule staminali 3-dimensionale sotto nonadherecondizioni NT. In queste condizioni, CSC possono creare colonie galleggianti sferici formate da cellule staminali derivate; queste colonie sono denominate &quot;sfere cellulari&quot;. Qui, si descrive un metodo per stabilire le culture CSC da colture cellulari primarie di OS convenzionale ottenuti da biopsie del sistema operativo. Descriviamo chiaramente i vari passaggi necessari per isolare e caratterizzare CSC.

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Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

La presenza di cellule staminali tumorali (CSC) in sarcomi ossei è stato recentemente collegato a loro patogenesi. In questo articolo, vi presentiamo l&#39;isolamento di CSC da colture cellulari primarie ottenute da biopsie umane di osteosarcoma convenzionale (OS) con la capacità di CSC di crescere in condizioni non aderenti.

Istituzione di Cancer Stem colture cellulari da umana convenzionale osteosarcoma

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

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