Name: establishment of cancer stem cell cultures from human conventional osteosarcoma
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00
Duration: 9 min 25 s
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This study was supported by ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.

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The authors declare that they have no competing financial interest.

CSCs têm várias propriedades que permitem a identificação deste subconjunto celular particular na massa do tumor. Na base destas características, tais como resistência adquirida à citotóxica agentes de quimioterapia para a sobre-expressão de ATP-ligação cassete multidrogas transportadores de efluxo 28, 32, 33, ou para a regulação positiva da expressão de enzimas de desintoxicação tais como ALDH 32, para a expressão de um marcador de superfície específico, como CD133, CD44, CD34, CD90, e outros 30, 34, 35, 41, vários métodos diferentes para isolar CSCs foram desenvolvidos 42-44. Uma dessas técnicas é o ensaio de formação de esfera, que se baseia na capacidade das CSCs a crescer sob condições de não-aderentes. A capacidade das células-tronco de tecidos e CSCs para formar esferas foi descrita pela primeira vez em estudos sobre a identificação de células-tronco neurais por Reynolds et al. 37. Subsequentemente, Gibbs et ai. 38 nósEd estes estudos para começar a isolar CSCs de tumores sólidos, em particular, a partir de sarcomas ósseos. Decidimos usar o método de ensaio de formação de esfera ilustrado por Gibbs et al. Isolar CSCs de linhas celulares OSA obtidos a partir de biópsias OS convencionais. Nós adaptado o método original para melhorar os resultados deste ensaio e para facilitar a sua reprodutibilidade por outras linhas de células de cancro. Com referência à realização do ensaio de formação de esfera, verificou-se que o plaqueamento 40.000 células / poço é uma boa prática para a manutenção de células em isolamento no início do ensaio. Este truque é muito importante para evitar a possibilidade de que as colónias esféricas são originários de agregação celular e não a partir da capacidade particular e exclusivo de um único CSC a crescer sob condições de não-aderentes e formar uma colónia esférica. Esta capacidade é um ponto particularmente crítico deste ensaio. Nós também certificou que para obter uma boa taxa de formação de esfera, É suficiente para refrescar alíquotas de factores de crescimento a cada 3 d e não todos os dias, como descrito no método original. No presente estudo, nós também estabelecido e amplamente descrito um bom método para o isolamento das colónias esféricas que se formaram, quando cultivadas sob condições não-aderentes. Este passo é crítico neste ensaio, porque é muito importante para tentar isolar o maior número de esferas quanto possível, que são formadas em cada poço sem danificá-los. É também importante para isolar apenas as esferas e não as células individuais, que podem permanecer em suspensão durante a duração do ensaio. Para superar estes pontos críticos, temos desenvolvido um método de isolamento em particular, que, conforme mostrado acima, deu bons resultados para o isolamento CSC. Obviamente, existe a possibilidade de que nem todas as esferas que se formaram pode ser recuperada, mas a percentagem de perda é muito baixa. Na verdade, temos também a possibilidade de usar um filtro com 40 mm poros para isolar esferas depois que eles se tornam grandes (formaed cerca de 100-200 células). Este isolamento pára a formação de esfera, mas permite que as células individuais, parte do resíduo de metilcelulose, e as mais pequenas esferas para ser filtrada. Esta eliminação é realizada por meio de filtração profunda, tal como descrito no protocolo. Além disso, a selecção das maiores colónias esféricas através dos 40 uM de malha com a consequente perda das colónias mais pequenas esféricas permite seleccionar os CSCs com a maior capacidade para formar colónias esféricas e com maior stemness. Todas estas modificações foram realizadas para melhorar o ensaio e para ajudar os investigadores que estudam CSCs de compreender e reproduzir a etapa mais crítica do método original de ensaio de formação de esfera. Entre os estudos sobre métodos in vitro para CSCs de isolamento, este estudo teve como objetivo mostrar como esse ensaio de formação de esfera adaptada poderia ser um bom método para isolar CSCs delinhas de células SAOS. As adaptações para o método original e a técnica de isolamento detalhada descrito melhorar a sua eficácia. Num curto espaço de tempo, um bom número de CSCs podem ser obtidas e usadas para várias experiências. Portanto, é possível confirmar rapidamente os fenótipos tronco-like e, em particular, para estudar o fenótipo estaminais-como dupla que caracteriza OS-CSCs. Assim, este ensaio pode ser modificado uma boa técnica para isolar e estudar os CSCs sua biologia. No futuro, este método, com adaptações adicionais, podem também ser utilizados para isolar os CSCs de outras linhas celulares de cancro finito obtidos por biópsias de tumores sólidos raras. A possibilidade de isolar CSCs de tumores sólidos raras, tais como SO, não apenas permite a melhoria de estudos sobre o cancro em particular, mas também se estende para estudos de diferentes tipos de cancro para desenvolver melhores métodos para o seu isolamento e para futuros estudos sobre a biologia de este subconjunto celular importante. Portanto, como nóster feito neste estudo, é importante para melhorar os métodos de isolamento CSC através do estudo da CSC biologia, com o objectivo final de encontrar alvos moleculares e desenvolver uma terapia anticancro muito específica dirigida contra este subconjunto celular particular, que é provavelmente responsável por a manutenção do tumor primário, o desenvolvimento da sua recorrência, e a origem de metástases em vários órgãos. O estudo da CSC biologia também é importante para encontrar terapias que poderiam ser incisiva na cura de cânceres, como o OS, para os quais a taxa de sobrevivência após o tratamento neoadjuvante continua a ser muito pobre.

Sarcomas são um grupo heterogêneo de tumores raros do tecido conjuntivo malignas de origem predominantemente a partir da mesoderme embrionária 1. Os diferentes tipos incluem sarcomas ósseos e sarcomas de tecidos moles. sarcomas ósseos, um grupo de tumores primários relativamente pouco frequentes, consistir em vários subtipos, incluindo osteossarcoma (OS). OS, um dos tumores primários mais comuns do tecido ósseo, é um tumor maligno mesenquimal que exibe extensa clínicos, histológicos e heterogeneidades moleculares 2, 3. Infelizmente, OS ocorre predominantemente em crianças e em adultos jovens 4, 5 e representa 60% do os subtipos histológicos comuns de sarcoma do osso na infância 6, 7. oS geralmente afecta as áreas do esqueleto, as quais são caracterizadas pelo crescimento ósseo rápido (por exemplo, a metáfise de ossos longos). Entre os histologicamente diferentes subtipos de OS, sistema operacional convencional, também chamado medular ou OS central, tem um alto grau de malignidade e uma quota share de 80% 8. Este 80% é composto de 60% OS convencional osteoblástica, 10% OS condroblástico, e 10% de SO fibroblástica 6, 8-10. Outros subtipos do sistema operacional incluem anaplásico, telangiectatic, rico em células gigantes e OS de pequenas células. Apesar dos avanços na cirurgia e quimioterapia na gestão OS combinados, o resultado permanece pobre, com uma taxa de sobrevivência a longo prazo de 65-70% em pacientes sem metástase 11, 12. Recorrências distantes ocorrem frequentemente como metástases pulmonares ou, menos frequentemente, como metástases aos ossos distantes e recidivas locais 13. As metástases são frequentemente resistentes aos tratamentos convencionais. Esta resistência é a razão pela qual a sobrevida livre de doença de 10 anos é de aproximadamente 30% em pacientes com doença metastática no momento do diagnóstico 14, 15. Como com o tecido normal, tecido de cancro é composto de uma colecção heterogénea de tipos celulares. As células dentro do tumor parece corresponder a diferentes fases de desenvolvimento. Dentro de qualquer Normal tecido reside uma subpopulação de células com a capacidade de selfrenew, proporcionando assim progenitores e células maduras para a homeostase do tecido. Do mesmo modo, o cancro é composta por uma população heterogénea semelhante de células em diferentes fases de desenvolvimento, com diferentes graus de proliferação e potencial tumorigénico. Um subconjunto destas células de cancro, denominado cancro de células estaminais (CSCs), constitui um reservatório de selfsustaining células com a capacidade para selfrenew exclusiva e manter o potencial de malignidade de tumores, assim gerar as diferentes linhagens de células que constituem a maior parte do tumor 16. Na década de 1990, estudos sobre a leucemia mielóide aguda forneceu a primeira evidência convincente para a existência de CSC subpopulações 17, 18. CSCs já foram isolados a partir de um grande número de tumores sólidos 19, tornando-se um dos temas mais pesquisados na pesquisa do câncer. CSCs pode, de facto surgem a partir de células estaminais normais por mutações em genes que tornam a normaiscélulas cancerosas 20-23 haste. Múltiplas mutações transformando e interações com o microambiente também poderia contribuir para progenitores saudáveis ​​e células maduras que adquirem a capacidade selfrenewal e imortalidade que tipificam CSCs. Existem várias hipóteses sobre esta transformação. Progenitores saudáveis, células maduras saudáveis e células cancerosas, pode dedifferentiate às células-tronco, obtendo um fenótipo estaminais-como ativando genes associados à selfrenewal 24-28. Apesar de vários estudos recentes, as origens da CSCs têm ainda a ser descoberto. Uma característica particular de CSCs é que a sua capacidade para resistir a aproximação multi-terapia, que consiste em cirurgia e quimioterapia combinadas com diferentes drogas. Estudos recentes têm mostrado que os CSCs também podem adquirir resistência a agentes citotóxicos quimioterapia. Possíveis explicações para essa resistência incluem a superexpressão de ATP vinculativo cassete (ABC) transportador de múltiplas drogas (isto é,MDR1 e BCRP1), a sobre-expressão de enzimas metabolizadoras de quimioterapia tais como aldeído desidrogenase 1 (ALDH1), e / ou alterações na cinética do ciclo celular 30-33. A consequência directa de todos os conceitos que têm sido descritos até aqui é que uma terapia de cancro seria eficiente apenas se a subpopulação CSC foram completamente eliminadas, enquanto que a recorrência local ou metástase distante poderia ocorrer se mesmo um único CSC sobreviveram. A descoberta de CSCs em sarcomas humanos 34, particularmente OS 35, ou em quaisquer outros tipos de câncer ósseo e dos tecidos moles, tem grande importância clínica, pois oferece uma possível explicação de por que muitos tratamentos parecem ser eficazes no início, mas os pacientes depois recaída. Portanto, a esperança para o futuro batalha contra OS convencional é encontrar terapias direcionadas novos e específicos com base no desenvolvimento de medicamentos inovadores dirigidos a OS-CSCs graças à caracterização molecular deste subpopulação e para o estudo da biologia CSC. Em 1992, Reynolds e colegas, que investigam se um subconjunto de células estaminais estava presente no cérebro de mamíferos adultos, desenvolveu um método para isolar células que se suspeita serem células 36, 37 da haste semelhante. Este método baseia-se na capacidade particular de estas células para formar colónias esféricas quando cultivadas sob condições não aderentes. Técnicas semelhantes foram empregadas por Gibbs e seus colegas em 2005 para estudar uma subpopulação de células-tronco, como em sarcomas ósseos 38. Para isolar e caracterizar OS-CSCs a partir de culturas de células primárias de diferentes tipos de OS convencional, decidimos adaptar esta técnica para linhas de células do sistema operacional. Aqui, nós descrevemos este método adaptado do ensaio de formação de esferas, chamado &quot;ensaio sarcosphere&quot;, que pode ser utilizado para isolar SO-CSCs a partir de linhas de células primárias derivadas finitos a partir de biópsias humanas de SO convencional. Descrevemos também todas as técnicas used para validar o fenótipo CSC-haste como as de linhas de células isoladas por este ensaio: 1) a avaliação da expressão de genes que caracterizam células estaminais embrionárias pluripotentes (CES) e do gene de CD133, que é um marcador de CSCs; 2) (CFU) ensaio de unidades formadoras de colónias; 3) Avaliação da capacidade destas células para se diferenciarem em osteoblastos e adipócitos sob condições de diferenciação adequados; 4) estudo dos marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais (MSCs) (ie, CD44, CD105 e Stro-1) por imunofluorescência e por análise de citometria de fluxo; 5) Avaliação da actividade de ALDH destas células.

establishment of cancer stem cell cultures from human conventional osteosarcoma

As melhorias atuais na terapia contra o osteossarcoma (OS) ter prolongado a vida de pacientes com câncer, mas a taxa de sobrevivência de cinco anos continua a ser pobre quando a metástase ocorreu. A teoria de haste do cancro celular (CSC) sustenta que há um subconjunto de células tumorais dentro do tumor que têm características tronco-semelhantes, incluindo a capacidade de manter o tumor e para resistir a múltiplos fármacos de quimioterapia. Portanto, uma melhor compreensão da biologia OS e patogénese é necessária, a fim de avançar no desenvolvimento de terapias específicas para erradicar este subconjunto particular e para reduzir a morbidade e mortalidade entre os pacientes. Isolando CSCs, estabelecendo culturas de células de CSCs, e estudar sua biologia são passos importantes para melhorar a nossa compreensão da biologia OS e patogênese. O estabelecimento de origem humana OS-CSCs a partir de biópsias de OS tem sido possível usando vários métodos, incluindo a capacidade de criar culturas de células estaminais em 3 dimensões sob nonadherecondições NT. Sob estas condições, os CSCs são capazes de criar colónias flutuantes esféricas formadas por células estaminais filhas; essas colônias são denominadas &quot;esferas celulares&quot;. Aqui, descrevemos um método para estabelecer culturas CSC de culturas de células primárias de OS convencional obtidos a partir de biópsias OS. Nós descrever claramente as várias passagens necessários para isolar e caracterizar CSCs.

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Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) em sarcomas ósseos foi recentemente ligada à sua patogênese. Neste artigo, apresentamos o isolamento de CSCs de culturas de células primárias obtidas a partir de biópsias humanas de osteossarcoma convencional (OS) que utilizam a capacidade dos CSCs a crescer sob condições não aderentes.

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

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