Name: in vitro disassembly of influenza a virus capsids by gradient centrifugation
Uploaded: 2016-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation at JoVE.com

Vi tackar Yohei Yamauchi och Roberta Mancini för att förse oss med reagens. AH laboratorium stöddes av Marie Curie Initial Training Networks (ITN), European Research Council (ERC) och av den schweiziska National Science Foundation (Sinergia).

1. Framställning av Buffertar och stamlösningar <ol><li> Förbered MNT buffert (20 mM MES, 30 mM Tris och 100 mM NaCl) genom att lösa 470 mg Tris hydroklorid, 390 mg MES hydrat och 580 mg NaCl i 80 ml ​​DDH 2 O. Justera bufferten till pH 7,4 och föra den till en slutlig volym av 100 ml med DDH 2 O. </li><li> Förbered tre identiska lösningar av 500 mM MES-buffert genom upplösning av 9,76 g MES hydrat i 80 ml ​​dH 2 O vardera. Justera buffertarna till pH 5,8, 5,4, och 5,0,...

<ol>
	<li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Evolution,+Host+Adaptation,+and+Pandemic+Formation.">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host &amp; microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li><li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry:+the+influenza+hemagglutinin.">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li><li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).</li><li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line.">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li><li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells.">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li><li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li><li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+virus+entry+via+endocytosis.">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li><li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus.">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li><li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus.">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li><li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins:+The+viral+matrix+protein+(M1)+promotes+export+and+inhibits+import.">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47.">Chapter 47.</a> Fields Virology. , 1647-1690 (2006).</li><li>Chou, Y. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis.">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).</li><li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus.">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li><li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins.">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus.">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li><li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K++is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration.">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li><li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+matrix+protein+M1/M+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses.">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li><li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry.">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li><li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation.">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li><li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry.">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).</li><li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses.">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li><li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores.">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li><li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus.">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li><li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+influenza+virus:+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles.">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li><li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+virus+uncoating.">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li><li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+at+a+glance.">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li><li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+Influenza+C+Viruses,+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH.">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li></ol>

Virala kapsider är metastabila makromolekylära komplex. Även montering av virioner kräver inkapsling och kondensering av virusgenomet, inledningen av nästa omgång av infektion beror på demontering av denna kompakta kapsid struktur. Virus har utvecklats till att utnyttja olika cellulära mekanismer för att styra beläggnings uncoating cykel, inklusive cellulära receptorer, chaperones, proteolytiska enzymer, fysiska krafter som tillhandahålls av motorproteiner eller helikaser samt pH och joniska omkopplare ...

Influensa A-virus (IAV) är ett höljevirus och tillhör familjen Orthomyxoviridae. Dess gener kodas på en segmenterad, negativ-sense och enkelsträngat RNA-genomet. Hos människor orsakar IAV luftvägsinfektioner, som förekommer i säsong utbrott epidemiska och bär risken för globala pandemier 1. Vid bindning till sialinsyrarester på värdcellytan 2, är IAV internaliseras av clathrin-beroende endocytos och clathrin oberoende vägar 3-8. Den sura miljö (pH &lt;5,5) i de endocytiska vakuoler utlöser en stor konformationsförändring i IAV spik glykoprotein hemagglutinin (HA), vilket resulterar i fusion av det virala och den sena endosomala membranet 9. När väl IAV kapsiden (här även hänvisad till som viral &quot;kärna&quot;) har undkommit från sena endosomer (LES), är det inte belagda i cytosolen följt av transport av de virala ribonukleoproteiner (vRNPs) in i kärnan - platsen of virusreplikation och transkription 10-13. Innan syraaktivering av HA viruset upplever en gradvis minskning av pH i den endocytiska systemet, som primär kärnan för dess efterföljande demontering 14-16. I denna &quot;priming&quot; steg M2 jonkanaler i virusmembranet mediera tillströmningen av protoner och K +10,14,16. Förändringen i jonkoncentration i virus inre stör samspelet bygga upp av den virala matrisprotein M1 och åtta vRNP bunten, och underlättar IAV uncoating i cytoplasman efter membranfusion 10,14-17. Direkt och kvantitativ analys av evakueringssteget har hindrats av det faktum att endosomer är svåra att komma åt experimentellt. Inmatningsprocessen är för övrigt i hög grad icke-synkron. Dessutom har end-point-analyser, såsom QRT-PCR av frigjorda virala RNA eller infektions mätningar, inte ge en detaljerad bild av den biokemiska tillstånd virala Capsid vid varje givet steg av posten. Även störning av endosomer av siRNA eller läkemedelsbehandling har väsentligt bidragit till förståelsen av IAV inträde 18-20,-tuning bra är svårt och benägna att ospecifika biverkningar i hårt kontrollerad endosomen mognad program. För att undvika dessa problem, har vi anpassat en tidigare utvecklad in vitro-protokoll baserat på användningen av hastighets gradientcentrifugering 17. Till skillnad från andra försök 21,22, 23,24, som oftast var baserade på kombinationer av proteolytisk klyvning och tvättmedel behandling följt av EM analys, detta tillvägagångssätt möjliggjorde en lätt mätbar resultat. Centrifugering genom olika lutning lager tillåter sedimente partiklarna att utsättas för och reagera med förändrade förutsättningar på ett kontrollerat sätt. I den presenterade protokollet, IAV härrörande från klar allantoisvätska eller renade virala partiklar sedimenteras till en två-lagers glycerolgradient i vilken det undre lagret innehåller den icke-joniska detergenten NP-40 (Figur 1). Eftersom viruset kommer in i andra, tvättmedel som innehåller lager, de virus lipid kuvert och kuvert glykoproteiner försiktigt solubiliseras och kvar. Kärnan, som består av den åtta vRNP knippet och omgiven av ett matrisskikt, sediment som en stabil struktur in i pelletfraktionen. Virala kärnproteiner, till exempel M1 och vRNP-associerad nukleoprotein (NP), kan identifieras i pelleten med SDS-PAGE och Coomassie-färgning. I synnerhet dra nytta av kommersiellt tillgängliga gradientgeler och färgning med den mycket känsliga kolloidalt Coomassie 25, möjliggör hög precision och detektion av även små mängder av viruskärn associerade proteiner. Detta utgör grunden för att testa om olika förhållanden såsom pH, saltkoncentration, och förmodade uncoating faktorer har effekter på sedimenteringsbeteende kärnkomponenter och kärn stabil<html> heten. För detta syfte, är endast den nedre, detergent-innehållande skikt i glycerolgradient modifieras genom införande av faktorn eller ett tillstånd av intresse. Tekniken har varit särskilt värdefullt att utreda effekten av olika pH-värden och saltkoncentrationer på integritet IAV kärnan 16. Mellanliggande steg av IAV uncoating kunde övervakas inkluderande dissociation av matrisskiktet vid milt surt pH (&lt;6,5) följt av vRNP dissociation vid pH 5,5 och lägre 16,17 (Figur 1). Det senare steget förstärktes ytterligare genom närvaron av hög K + koncentration i glycerolskiktet, vilket återspeglar en sen endocytiska miljö 16. Således, eftersom viruset och kärnan sedimente genom gradienten de upplevde en föränderlig miljö som efterliknar förhållandena i endosomer. Resultatet var en stegvis demontering av den virala kärnan in vitro komplement resultat som härrör från cellbiologiska analyser. t &quot;&gt; Den metod som presenteras här har möjliggjort snabb och mycket reproducerbar analys av IAV (X31 och A / WSN / 33) och IBV (B / Lee / 40) uncoating utlöses av surt pH och öka K +16,17 samt demontering av paramyxovirus kärnor vid alkaliskt pH exponering 17. det är tänkbart att tillvägagångssättet kan anpassas till andra inkapslade virus att få insikt i de biokemiska egenskaperna hos den virala kapsiden struktur och kapsiden demontering under cellinträde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1103">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">cOmplete&#8482;, EDTA-free protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">11873580001</td>
			<td style="width:473px;">The stock solution can be stored at 2 to 8 &#176;C for 1 to 2 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol anhydrous BioChemica</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Now commercially available as IGEPAL&#174; CA-630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; LDS sample buffer (4X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; MOPS SDS running buffer (20X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH indicator strips, pH 4.0 - 7.0</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodiumhydroxide</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steritop&#8482; filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris hydrochloride&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid</td>
			<td>Virapur</td>
			<td></td>
			<td>Freshly thawed on 4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro disassembly of influenza a virus capsids by gradient centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Som redan diskuterats, priming i endosomer krävs för att göra IAV kärnan uncoating kompetent. Protonering av kärnan försvagar interaktionen av M1 och vRNPs (bestående av det virala RNA, NP, och polymeraset komplex PB1 / PB2 / PA). Denna process initieras när inkommande viruset utsätts för ett pH av 6,5 (eller lägre) i tidiga endosomer (EES) och fortsätter tills viruset säkringar vid omkring pH 5,0 i LES. I syfte a...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation at JoVE.com

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

I vitro Demontering av influensa A-virus-kapsider genom gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering av humana monocyter från Double gradientcentrifugering och deras differentiering till makrofager i teflonbelagda Cell Culture Väskor

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa viruspropagering i embryonerade hönsägg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av Mouse Mx1 Protein med influensa A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes för influensa A-virus Upptäckt och isolering från svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Mätning Attachment och Internalisering av influensa A-virus i A549-celler genom flödescytometri

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...