Name: an enzyme- and serum-free neural stem cell culture model for emt investigation suited for drug discovery
Uploaded: 2016-08-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery at JoVE.com

L&#39;étude a été soutenue par la Fondation Université de Bâle des sciences et de la Fondation nationale suisse par une subvention à MHS et AG (SNF IZLIZ3_157230). Nous remercions: Dr Tania Rinaldi Burkat pour fournir généreusement l&#39;infrastructure; tous les membres du groupe Bettler pour des discussions et des commentaires. Nous remercions Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Suisse) pour une installation professionnelle et compétente de la caméra vidéo HD complet MC170 (Leica Microsystems, Suisse).

Toutes les procédures animales ont suivi le «Guide pour le soin et l&#39; utilisation des animaux de laboratoire» (publication NIH, 8 e édition, 2011) et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de Bâle (Directives suisses pour le soin et l&#39; utilisation des animaux). Par ces lignes directrices du protocole animal est considéré comme de la «qualité de la gravité de l&#39;animal le plus bas». 1. Préparation de l&#39;Expansion Medium Remarque: Le travail dans de...

<ol>
	<li>Nieto, M. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP2+and+FGF2+cooperate+to+induce+neural-crest-like+fates+from+fetal+and+adult+CNS+stem+cells.">BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells.</a> J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).</li><li>Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+contractions+in+the+human+melanoma+cell+line+SK-mel+28+after+muscarinic+cholinergic+stimulation.">Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation.</a> Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).</li><li>Wicki, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+role+of+podoplanin+in+tumour+invasion.">The potential role of podoplanin in tumour invasion.</a> Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).</li><li>Wicki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+invasion+in+the+absence+of+epithelial-mesenchymal+transition:+podoplanin-mediated+remodeling+of+the+actin+cytoskeleton.">Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton.</a> Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).</li><li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+podoplanin+in+malignant+astrocytic+tumors+as+a+novel+molecular+marker+of+malignant+progression.">Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression.</a> Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).</li><li>Motomura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis-based+proteomic+subclassification+of+newly+diagnosed+glioblastomas.">Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas.</a> Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).</li><li>Kono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+the+lymphatic+marker+podoplanin+in+diverse+types+of+human+cancer+cells+using+a+novel+antibody.">Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody.</a> Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).</li><li>Raica, M., Cimpean, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-AA+mediates+B104CM-induced+oligodendrocyte+precursor+cell+differentiation+of+embryonic+neural+stem+cells+through+Erk,+PI3K,+and+p38+signaling.">PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling.</a> J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).</li><li>Galvao, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+astrocytoma+pathogenesis+in+vitro+and+in+vivo+using+cortical+astrocytes+or+neural+stem+cells+from+conditional,+genetically+engineered+mice.">Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice.</a> JoVE. , e51763 (2014).</li><li>Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. 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Dans cette étude , un système standardisé pour EMT analyse NSCs utilisant est décrite (résumé dans la figure complémentaire 3). La normalisation permet la reproductibilité (Tableau 1 et 2). Les NNC sont dérivées du cortex développement, un tissu qui, normalement, ne subit pas EMT. Ceci est avantageux pour l&#39;analyse des premières étapes de l&#39;EMT. Les premières étapes dans EMT ne peuvent pas être étudiés de manière adéquate dans les cellules tumorales qui ont a...

Pendant plusieurs stades du développement embryonnaire, les cellules épithéliales perdent leur forte adhérence à l&#39;autre (par exemple, les jonctions serrées) et d&#39; acquérir un phénotype migratoire dans un processus appelé transition épithélio mésenchymateuse (EMT) 1. EMT est requis pour la formation d&#39; autres types de cellules, telles que les cellules de la crête neurale mésenchymateuses, une population qui se sépare de la neuroepithelium 2. EMT est essentielle non seulement au cours des stades embryonnaires , mais aussi nécessaire à des étapes ultérieures de la vie adulte pour maintenir les processus physiologiques dans l&#39;organisme adulte, comme la cicatrisation 3 et le système nerveux central (SNC) dans la régénération des lésions démyélinisantes 4. Les tumeurs épithéliales sont connus pour réactiver EMT comme une étape d&#39;initiation pour la migration, l&#39; invasion et les métastases, conduisant finalement à la progression du cancer 1,3. EMT est en effet lié au centre de la forte 1,3 de migration. Les étapes cellulaires de conditioning, initier, subissant et maintenir EMT ne sont pas pleinement compris et ont besoin d&#39;une enquête plus approfondie. Ici, un système in vitro de modèle normalisé basé sur EMT NNC, des facteurs de croissance définis et des milieux (sans sérum et sans l&#39; utilisation de l&#39; enzyme) est présentée. Ce système modèle est pertinent pour les scientifiques travaillant sur EMT. Les escargots, Zeb et Twist familles de protéines se sont avérés être critique pour EMT tant dans le développement et la maladie 1. Les escargots, Zeb et Twist familles sont également impliqués dans le système présenté. Le système est basé sur une région spécifique du cerveau antérieur qui, normalement, ne subit pas de EMT fournir un avantage particulier pour l&#39;étude des premiers événements au cours EMT induction. Le système de modèle pourrait être appliquée à l&#39;étude EMT dans les épithéliums en dehors du système nerveux central, depuis inducteurs EMT clés, tels que l&#39;escargot, Zeb et les protéines Twist, sont également présents au cours EMT dans les systèmes de tissus en dehors du système nerveux central. Ce modèle système permet l&#39;isolement normalisé de NNC du cortex en développement pour étudier les caractéristiques de cellules souches en général et EMT en particulier. Grâce à ce système, nous avons isolé NSCs, EMT induite et étudié la migration ultérieure sous l&#39;effet de FGF2 et BMP4. Nous avons observé que interagit FGF et BMP-signalisation avec TGF-signalisation pour promouvoir la migration cellulaire, validant ainsi le système modèle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BMP4, rhBMP4</td>
			<td>RnD Systems&#160;</td>
			<td>314-BP-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pancreas insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>CBA-110</td>
			<td>24 well plate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish with grid</td>
			<td>Ibidi 500 mm dish, 35 mm</td>
			<td>80156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Plasma membrane dye, use at 1:1000 .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1:1 medium bottle</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2, rhFGF2</td>
			<td>RnD Systems</td>
			<td>233-FB-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectine, bovine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>F4759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement&#160;</td>
			<td>Gibco Invitrogen&#160;</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics software with pixel measurement feature</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>fiji.sc/Fiji</td>
			<td>version 2.0.0-rc-30/1.49s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS media</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H9394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human apo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco Invitrogen&#160;</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin, Mouse anti Nestin antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX26142</td>
			<td>Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody</td>
			<td>Provided by Hirohide Takebayash</td>
			<td>Personal stock</td>
			<td>Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td>
			<td>Gibco Invitrogen&#160;</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>DM3614P</td>
			<td>Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5780</td>
			<td>Skin and eye irritant. Appropriate protection required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody</td>
			<td>Millipore Chemicon</td>
			<td>AB5774</td>
			<td>Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb1, rhTGFb1</td>
			<td>RnD Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uncoated Petri dishes</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzyme- and serum-free neural stem cell culture model for emt investigation suited for drug discovery

Épithéliale de transition mésenchymateuses (EMT) décrit le processus de l&#39;épithélium transdifferentiating en mésenchyme. EMT est un processus fondamental au cours du développement embryonnaire qui se produit également souvent dans le glioblastome, la tumeur la plus fréquente du cerveau maligne. EMT a également été observé dans de nombreux cancers, y compris en dehors du cerveau cancer du sein, le cancer du poumon, le cancer du côlon, le cancer gastrique. EMT est lié au centre de malignité en favorisant la migration, l&#39;invasion et la formation de métastases. Les mécanismes de EMT induction ne sont pas pleinement compris. Nous décrivons ici un système in vitro pour isoler des cellules corticales normalisé souches neurales (NSC) et l&#39; induction subséquente EMT. Ce système offre la possibilité d&#39;utiliser soit des cellules simples ou explant. Dans ce système, un rat ou la souris NNC prosencéphale embryonnaires sont mises en culture dans un milieu défini, dépourvu de sérum et les enzymes. Les NSCs exprimés Olig2 et Sox10, deux facteurs de transcription observée dans oligodendrocles cellules précurseurs yte (OPC). En utilisant ce système, les interactions entre les FGF, TGF et BMP signalisation impliquant ZEB1, ZEB2 et Twist2 ont été observées lorsque la TGFß activation améliorée de manière significative la migration des cellules, ce qui suggère une BMP / TGF-interaction synergique. Les résultats indiquent un réseau de FGF, BMP et TGF-signalisation d&#39;être impliqués dans EMT induction et l&#39;entretien. Ce système de modèle est utile pour étudier EMT in vitro. Il est rentable et présente une forte reproductibilité. Il permet également la comparaison des différents composés par rapport à leurs réponses de migration (de mesure de distance quantitative), et le criblage à haut débit de composés à inhiber ou amplifier EMT (mesure qualitative). Le modèle est donc bien adapté pour tester les bibliothèques de médicaments pour les substances affectant EMT.

Ce système modèle EMT est basée sur l&#39;isolement normalisé de NNC à la fois comme des cellules individuelles ou sous forme d&#39; explants provenant d&#39; une région spécifique du tube neural en développement, le cortex central (figures 1 et 2). Pour l&#39; évaluation quantitative, les explants ont été ensemencées à droite au centre d&#39;une boîte de culture de grille de 500 um (figure 3). Des explants de cortex centra...

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An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Recherche

Biologie du développement

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

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Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus Infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Cytométrie en cellules vivantes en temps réel d’enquêter sur l’Influx calcique, la Formation de pores et phagocytose par les récepteurs P2X7 dans des cellules progénitrices neurales adultes

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Modèle d'impact cortical contrôlé des dommages de cerveau de souris avec la transplantation thérapeutique des cellules neurales pluripotentes induites par l'homme de cellules souches

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléaires périphériques et différenciation vers les précurseurs du neurone dopaminergique pour les études de transplantation