Name: expression and purification of virus-like particles for vaccination
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00
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Vogliamo riconoscere i membri precedenti del laboratorio Ross che hanno contribuito a ottimizzare il protocollo per la massima efficienza e rendimento.

1. sistema mammifero di espressione per la generazione di influenza H3N2 VLP <ol><li> Sottoclone virale glicoproteine ​​strutturali emoagglutinina (HA), neuraminidasi (NA), e il virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV) Gag p55 in vettori di espressione eucariotica, come descritto in precedenza pTR600. 7 </li><li> Amplificare il DNA in Escherichia coli chimicamente competente (ad esempio, DH5α) e isolare trasfezione-grade plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide secondo le istru...

<ol>
	<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+virus-like+particles:+a+review.">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).</li><li>Jain, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+stabilization+of+recombinant+protein+based+virus-like+particle+vaccines.">Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2014).</li><li>Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+pH+stability+-+how+influenza+A+virus+hemagglutinin+affects+host-specific+virus+infection.">Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engerix-B+package+insert.">Engerix-B package insert.</a> GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).</li><li>Giles, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+optimized+hemagglutinin+virus-like+particle+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+that+protect+nonhuman+primates+from+H5N1+infection.">A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection.</a> J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).</li><li>Giles, B. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+optimized+broadly+reactive+antigen+(COBRA)+based+H5N1+VLP+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+in+mice+and+ferrets.">A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets.</a> Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).</li><li>Green, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3d+enhancement+of+neutralizing+antibodies+to+measles+hemagglutinin.">C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin.</a> Vaccine. 20, 242-248 (2001).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-Clade+Protective+Immune+Responses+to+Influenza+Viruses+with+H5N1+HA+and+NA+Elicited+by+an+Influenza+Virus-Like+Particle.">Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle.</a> PLoS ONE. 3, e1501 (2008).</li><li>Yondola, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+Capability+of+the+Influenza+Virus+Neuraminidase+Can+Be+Modulated+by+Tetherin.">Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin.</a> J Virol. 85, 2480-2491 (2011).</li><li>Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles+for+antigen+delivery+at+mucosal+surfaces.">Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).</li><li>Murawski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus-like+particles+containing+respiratory+syncytial+virus+G+protein+induced+protection+in+BALB/c+mice,+with+no+evidence+of+immunopathology.">Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology.</a> J Virol. 84, 1110-1123 (2010).</li><li>Quan, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice.">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li><li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COBRA-Based+Dengue+Tetravalent+Vaccine+Elicits+Neutralizing+Antibodies+Against+All+Four+Dengue+Serotypes.">COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes.</a> J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+the+Laboratory+Diagnosis+and+Virological+Surveillance+of+Influenza.">Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza.</a> World Health Organization. , (2011).</li><li>Mitnaul, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balanced+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Activities+Are+Critical+for+Efficient+Replication+of+Influenza+A+Virus.">Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus.</a> J Virol. 74, 6015-6020 (2000).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Pijlman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enveloped+virus-like+particles+as+vaccines+against+pathogenic+arboviruses.">Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses.</a> Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy.">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li><li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A/goose/Guangdong/1/96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+:+Morbidity+and+mortality+weekly+report.">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li></ol>

Abbiamo usato le tecniche sopra descritte per esprimere con successo e purificare SVP e VLP composti da più proteine ​​strutturali di vari agenti patogeni. In generale, usiamo sistemi di espressione di mammifero per generare i nostri VLP. Tuttavia, nelle nostre mani, dei mammiferi cellule derivate Chik rendimenti VLP erano bassi. CHIK resa VLP è stato più robusto quando si utilizza un sistema di celle baculovirus-insetto ricombinante. In generale, baculovirus-insetti sistemi cellulari producono una maggiore quant...

particelle virus-simili (VLP) sono una tecnologia approvata per la vaccinazione umana. In effetti, alcuni dei vaccini più contemporaneamente in licenza, tra cui il papillomavirus umano (HPV) e l&#39;epatite Β (HepΒ) vaccini impiegano questo metodo. VLP sono formate da proteine ​​strutturali in grado di auto-assemblaggio. Le particelle assemblate imitano morfologie virali, ma non possono infettare o replicare perché non hanno genomi virali. VLP possono essere espressi e purificati da un certo numero di sistemi procariotici ed eucariotici. Una revisione della letteratura ha rivelato che diversi sistemi di espressione sono impiegati alle seguenti tariffe: batteri - 28%, lievito di birra - 20%, impianto - 9%, insetto - 28%, e di mammiferi - 15% 1. Da segnalare, vaccini HPV a base di proteine ​​del capside L1 sono prodotte nel lievito (Gardasil) o in un sistema di cellule di insetto (Cervarix) 2. Vaccini HepΒ, Recombivax e Engerix-Β, sono prodotti anche nel lievito, e sono composti da HepΒ antigene di superficie 3, 4. Usiamo sistemi di espressione di cellule di mammiferi e insetti per la produzione di VLP che richiedono co-espressione di molteplici proteine ​​strutturali per il montaggio. Il nostro lavoro si concentra sulla progettazione, produzione, e di vaccini VLP-based di depurazione contro gli agenti patogeni umani: virus dell&#39;influenza, virus respiratorio sinciziale (RSV), virus della dengue (DENV), e virus Chikungunya (CHIKV). I nostri metodi sono sufficientemente flessibili per permettere co-espressione delle molteplici proteine ​​strutturali da più plasmidi di espressione, o un singolo plasmide di espressione (Figura 1). In precedenza, abbiamo prodotto e purificato H5N1 VLP assemblato dalla co-espressione di plasmidi che codificano emoagglutinina influenza (HA), neuraminidasi (NA), e matrice (M1) in embrionali cellule 293T renali umane 5,6. I geni sono stati codone-ottimizzati per l&#39;espressione in cellule di mammifero e clonati in pTR600, un vettore di espressione eucariotica contenente i citomegalovirus immediato inizio promotore più INTRON A per avviare transcrizione di inserti eucariotiche e il segnale di poliadenilazione ormone della crescita bovina per la terminazione della trascrizione 7. Un approccio simile utilizzando tre plasmide co-espressione di HA, NA (Figura 1A) e una proteina della matrice virale alternativa, HIV Gag p55, è stato utilizzato per la generazione di influenza stagionale sottotipo umana H3N2 VLP in questo studio e ha dimostrato di generare VLP di dimensioni simili come particelle influenzali 8. Anche se vaccini contro l&#39;influenza prevalentemente suscitano anticorpi anti-HA, l&#39;aggiunta di neuraminidasi dell&#39;influenza media attività sialidasi per consentire VLP in erba da cellule trasfettate 9 e presenti anche gli obiettivi immunogenico aggiuntivi. Per produrre RSV VLP, abbiamo anche scelto il nucleo non collegato di HIV Gag per progettare vaccini prototipo che presentano glicoproteine ​​di superficie esclusivamente RSV per dimostrare ulteriormente la flessibilità della formazione VLP con HIV Gag, come descritto in precedenza e caratterizzato da microscopia elettronica 6,10. Altrihanno precedentemente dimostrato che VLP presentando glicoproteine ​​RSV possono essere assemblati utilizzando vari componenti virali da virus della malattia di Newcastle (NDV) 11, e l&#39;influenza di matrice 12. Full-length sequenze glicoproteina di superficie sono stati utilizzati in questo studio per mantenere conformazioni nativi che possono essere necessari per il recettore funzionale di legame e il dosaggio degli anticorpi riconoscimento attraverso test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). I nostri esempi di utilizzo di sistemi di singola espressione plasmide per generare particelle sono DENV e CHIKV. Nel caso di DENV, possiamo produrre particelle subvirale (SVP) senza capside in cellule 293T da un singolo plasmide contenente un PRM / E gene strutturale cassetta di espressione 13. Il termine SVP viene usato per indicare la mancanza di una proteina core o capside nell&#39;assemblaggio di proteine ​​strutturali virali. CHIK VLP può anche essere prodotto utilizzando un singolo plasmide contenente un CHIKV cassette gene strutturale, capside codifica e busta proteine, o in icellule nsect infettando con un baculovirus ricombinante che codifica per la stessa cassetta gene strutturale ottimizzato per l&#39;espressione di cellule di insetto (Figura 1B - C). Il risultato finale dell&#39;espressione approcci sopra discusso è il rilascio di VLP nel mezzo di coltura cellulare che possono poi essere purificato mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscino glicerolo 20%. In questo rapporto, presentiamo i metodi per esprimere e purificare queste VLP da sistemi cellulari di mammiferi e insetti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:167px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12163</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DMEM</td>
			<td style="width:167px;">Cellgro</td>
			<td>10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>L3000075</td>
			<td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Cimarec I 6 multipoint stirrer plate</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyclear ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Seton</td>
			<td style="width:119px;">7025</td>
			<td>Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate citrate buffer</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">o-phenylenediamine dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.22 &#956;m vacuum filter top (500 mL)</td>
			<td style="width:167px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">H2SO4</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">339741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sf-900 II SFM</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of virus-like particles for vaccination

particelle virus-simili (VLP) e particelle subvirale (SVP) sono un approccio alternativo per la progettazione di vaccini virali che offre i vantaggi di una maggiore sicurezza biologica e stabilità oltre l&#39;uso di agenti patogeni dal vivo. Non infettive e di auto-assemblaggio, VLP sono utilizzati per presentare proteine ​​strutturali come immunogeni, bypassando la necessità di agenti patogeni dal vivo o vettori virali ricombinanti per la consegna antigene. In questo articolo, abbiamo dimostrato le diverse fasi di progettazione VLP e sviluppo per applicazioni future in sperimentazione animale preclinico. Il procedimento comprende le seguenti fasi: selezione di antigene, espressione dell&#39;antigene in linea cellulare di scelta, purificazione di VLP / SVP, e quantificazione per il dosaggio dell&#39;antigene. Dimostriamo uso di entrambe le linee cellulari di mammiferi e insetti per l&#39;espressione dei nostri antigeni e dimostrare come le metodologie differiscono nella resa. La metodologia presentata può applicare a una varietà di agenti patogeni e può essere ottenuto sostituendo gli antigeni con str immunogenicoproteine ​​uctural di microrganismo dell&#39;utente di interesse. VLP e SVP assistono con caratterizzazione dell&#39;antigene e la selezione dei migliori candidati vaccini.

rendimenti VLP erano variabili in base alla progettazione di antigene virale costrutto. In questo protocollo, abbiamo dimostrato l&#39;uso di cellule di insetto e di mammiferi per la produzione di SVP o VLP nel surnatante e purificazione da ultracentrifugazione. Quattro sottotipi di DENV PRM / E gene strutturale cassette di espressione sono stati usati per costruire le versioni di DENV SVP (delimitate da 1-4) nella tabella 1 e dimostrare un range compreso tra 1,1-2,6 mg ...

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Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Qui, vi presentiamo un protocollo per la sintesi di particelle virus-simili che utilizzano sia baculovirus o sistemi di espressione di mammifero, e la purificazione ultracentrifugazione. Questo approccio altamente personalizzabile viene utilizzato per identificare antigeni virali come bersagli vaccino in modo sicuro e flessibile.

Espressione e purificazione di particelle virus-simili per la vaccinazione

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

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