JB è un collega clinico CRUK, AS è uno studente di dottorato Wellcome Trust, il laboratorio di SR è finanziato da un CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Questo lavoro è stato supportato da due Wellcome Trust Awards strategici (097945/B/11/Z e 095931/Z/11/Z).

1. Cella Cultura e trattamento <ol><li> Raccogliere i reagenti e attrezzature elencati nella tabella 1 alla cultura osteosarcoma umano (U2OS) cellule. Preparare tutti i reagenti e condurre tutte le tecniche di coltura tissutale nella cappa a flusso laminare per garantire la sterilità </li><li> Preparare il terreno di coltura come segue: aggiungere 50 ml di FCS, 5 ml di L-glutammina e 5 ml di penicillina / streptomicina alla DMEM per ottenere concentrazioni finali di 10% (FCS), 2 mM (L-glutammina), 50 U / ml ( penicillina) e 50 U / ml (streptomicina). Riscaldare il terreno di coltura a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Preparare le cellule per il trattamento: <ol><li> Sterilizzare diversi coprioggetto in etanolo al 70%, lasciare asciugare e posizionare uno sul fondo di sei piastre 3,5 cm. </li><li> Immergere i coprioggetti in 2 ml riscaldati DMEM completa (37 ° C), premendo con le pinze coprioggetto per garantire che essi rimangano aderito al fondo dei pozzetti. </li><li> Staccare le cellule U2OS dal loro culto tessutopiastra ure lavando una volta con 3 ml di PBS, applicando 4 ml riscaldato 0,05% tripsina-EDTA (1%) e incubando a 37 ° C per 7 minuti. </li><li> Risospendere le cellule in 6ml riscaldato completo DMEM per inattivare la tripsina-EDTA e contare con un emocitometro. </li><li> Piastra 2 x 10 5 cellule a ciascuna delle piastre cm 3,5 preparate al punto 1.3.1. Agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione delle cellule ancora. Permettono alle cellule di aderire notte prima del trattamento. </li></ol></li><li> Trattare le cellule ponendo quattro piastre 3,5 cm nella workstation ipossia e lasciare gli altri due piastre 3,5 cm di incubatrice a 37 ° C in condizioni normali dell&#39;ossigeno. Essere pronta ad avviare l&#39;RNA etichettatura saggio in condizioni trattati (nella camera di ipossia per le cellule trattate ipossia) 1 ora prima del trattamento ipossia termina. </li><li> Esporre cellule all&#39;ipossia per 1 h 15 min, 1 ora e 30 min, 2 ore e 24 ore. Questi punti temporali sono flessibili e determinato dall&#39;utente. </li><li> Utilizzare un normoxic piastra da 3.5 cm come controllo positivo e un normossia piastra 3,5 centimetri trattata con actinomicina D (10 mcg / ml concentrazione finale) per 4 ore come controllo negativo. Actinomicina D è un inibitore della sintesi dell&#39;RNA globale. </li></ol> Avvertenze: Hoechst 33342 è un agente mutageno conosciuto. DMSO è noto per facilitare l&#39;ingresso di molecole organiche nei tessuti. NaOH è corrosiva. HCl è corrosivo. Paraformaldeide è altamente tossico per tutti gli animali e può causare la morte negli esseri umani. Triton X-100 può causare irritazione della pelle a seguito di contatto diretto. Actinomicina D è tossico a contatto con la pelle e per ingestione. Prendere le opportune precauzioni quando si maneggia tutte le sostanze chimiche pericolose. 2. Click-iT Assay <ol><li> Raccogliere i seguenti reagenti necessari oltre al kit di analisi Istruzioni-iT: tampone fosfato salino (PBS) pH 7.2 - 7.6, 3.7% paraformaldeide (PFA) in PBS, 1% Triton X-100 In PBS, acqua deionizzata (dH 2 O), dimetilsolfossido (DMSO), 10 M di idrossido di sodio (NaOH) e acido cloridrico 37% (HCl); Strisce indicatrici di pH - opzionale. </li><li> Preparare una soluzione stock PFA fresco prima di eseguire la reazione di Click-iT come segue: <ol><li> Mettere 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O e 10 microlitri di10 M NaOH in un tubo Falcon da 50 ml. Bollire 300-400 ml di H 2 O in un grande bicchiere nel microonde per fare un bagno di acqua e sopportare questo in una cappa aspirante. </li><li> Posizionare il 50 ml Falcon in bagno di acqua e agitare delicatamente per 10 min, rilasciando periodicamente il coperchio finché il PFA è sciolta. </li><li> Siringa la soluzione PFA attraverso un filtro da 0,2 micron in un&#39;altra provetta Falcon da 50 ml, ottenendo così una soluzione 37%. </li><li> Diluire la 10x aggiungendo PBS e portare il pH a 6,8 con l&#39;aggiunta di circa 12 ml di HCl concentrato. Opzione: Confermare il corretto pH con le strisce indicatore della cappa. </li><li> Utilizzare immediatamente o conservare overnight a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare le soluzioni madre del kit imaging RNA come segue: <ol><li> Aggiungere 373 microlitri dH 2 O al componente A con conseguente in una soluzione stock di 100 mm di UE. Conservare a -20 ° C per un massimo di un mese. </li><li> Aggiungere 85 ml di DMSO al componente B (Alexa Fluor 594) e mescolare pipettando o vortex. Conservare sia a -20 ° C per un massimo di un anno. </li><li> Aggiungere 2 ml dH 2 O per il componente e per creare una soluzione 10X dell&#39;additivo tampone di reazione kit imaging RNA. Conservare a -20 ° C per un massimo di un anno, scartare quando la soluzione si sviluppa un colore marrone. </li></ol></li><li> Etichettatura delle cellule con l&#39;UE: Preparare una soluzione di lavoro 2X dell&#39;UE dal magazzino 100 mM preparata nella fase 2.3 nel mezzo completo preriscaldata (37 ° C) Eseguire il resto di questo passo e passo 2,5 nella camera di ipossia delle cellule trattate con ipossia. . Diluire a 1X aggiungendo un volume uguale di questa soluzione di lavoro 2X per il cont mezziaining cellule. Incubare per 1 ora in trattamento condizioni di coltura delle cellule. </li><li> Fissazione delle cellule: Lavare ogni bene una volta con PBS e aggiungere 1 ml di 3,7% PFA magazzino preparate al passo 2.2 in condizioni di trattamento. Incubare per 15 min in condizioni di trattamento. I campioni trattati con ipossia possono essere rimossi dalla camera di ipossia a questo punto. Togliere il fissativo e lavare ogni pozzetto una volta con PBS (Prenditi cura di disporre di PFA sprecare responsabilmente). Eseguire le prossime tappe a temperatura ambiente. </li><li> Permeabilizzazione: Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 1 ml di 1% Triton X-100 in PBS in ciascun pozzetto. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il buffer permeabilizzazione e lavare ogni pozzetto una volta con PBS. </li><li> Etichettato RNA Detection: <ol><li> Preparare una soluzione fresca 1X lavoro di additivo immagini RNA tampone di reazione kit diluendo la soluzione 10X (preparata nella fase 2.3) 1:10 con dH 2 O. </li><li> Preparare il kit imaging RNACocktail di reazione secondo la Tabella 2 per l&#39;uso subito dopo la preparazione. </li><li> Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 500 ml di RNA di imaging cocktail reazione kit per ogni campione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. </li><li> Rimuovere la rappresentazione RNA cocktail reazione kit e lavare una volta con 1 ml di RNA di imaging reazione kit tampone di lavaggio (componente F), quindi rimuovere la reazione kit buffer di risciacquo di imaging RNA. </li></ol></li><li> Reazione multiplex Optional: Eseguire etichettatura anticorpi supplementare di campioni, a questo punto secondo le raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Colorazione DNA: Lavare i campioni con PBS quindi rimuovere la soluzione di lavaggio. Diluire la Hoechst 33342 (Component G) 1:1000 in PBS. Aggiungere 1 ml di diluito Hoechst 33342 in ciascun pozzetto ed incubare per 15 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Rimuovere la soluzione Hoechst 33342 e lavare le cellule due volte con PBS. Rimuovere la solutio lavaggion e procedere al microscopio ottico. </li></ol> 3. Microscopia ottica <ol><li> Mount Coprivetrini: <ol><li> Trasferire 10 ml di mezzo di fissaggio sul centro di un vetrino da microscopio standard. </li><li> Posizionare il coprioggetto con cella lato sul centro del vetrino da microscopio a coprire l&#39;aliquota di mezzo di montaggio. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle nel mezzo di montaggio come questo oscurare la successiva acquisizione delle immagini. </li><li> Attaccare il vetrino al vetrino da microscopio applicando smalto chiaro al suo perimetro. Lasciare asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce. I campioni possono essere conservati a -20 ° C in seguito montaggio. </li></ol></li><li> Acquisizione Image: Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a grande campo in grado di rilevare la fluorescenza. Approssimativamente maxima emissione di fluorescenza / eccitazione per il colorante Alexa Fluor e Hoechst 33342 legato al DNA sono mostrati in Tabella 3. </li><li> Perform Imaging utilizza una lente immersione in olio 40X/1.30 NA e catturare immagini con una telecamera CCD raffreddata. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Deconvolve immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini (vedi tabella Materials) prima di importare al cliente OMERO. Normalizzare il rendering impostazioni per tutte le immagini nello stesso esperimento nel software microscopio visualizzazione e analisi d&#39;immagine applicando le impostazioni di rendering da cellule normossiche controllo di tutte le altre condizioni. </li><li> Utilizzare la regione di interesse (ROI) strumento nel software microscopio visualizzazione di immagini e analisi (vedi tabella materiali) per selezionare nuclei da ogni immagine. Avere intensità media per ogni ROI e calcolare la deviazione media e standard per ciascuna condizione scegliendo l&#39;opzione analisi intensità, compreso un numero compreso tra 30-50 cellule. </li><li> Costruire diagrammi a dispersione utilizzare un software di grafica di dati (vedi tabella Materials), riportando tutti i singoli valori di intensità medi ottenuti nella fase 4.2 to riflettere la variabilità tra le cellule sotto ogni condizione. In alternativa, costruire grafici a barre per rappresentare l&#39;intensità media media più la deviazione standard di RNA nascente. </li></ol>

<ol>
	<li>Kenneth, N. S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gene+expression+by+hypoxia.">Regulation of gene expression by hypoxia.</a> Biochem J. 414, 19-29 (2008).</li><li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1,+PHD2,+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor.">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li><li>Lancaster, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+dimerization+and+substrate+phosphorylation+inhibit+factor+inhibiting+hypoxia-inducible+factor+(FIH)+activity.">Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity.</a> Biochem J. 383, 429-437 (2004).</li><li>Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+under+low+oxygen:+holding+your+breath+for+transcription.">Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription.</a> Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).</li><li>Schodel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+genome-wide+mapping+of+HIF-binding+sites+by+ChIP-seq.">High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq.</a> Blood. 117, (2011).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).</li><li>Breinbauer, R., Kohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide-alkyne+coupling:+a+powerful+reaction+for+bioconjugate+chemistry.">Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry.</a> Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugation+by+copper(I)-catalyzed+azide-alkyne+[3+++2]+cycloaddition.">Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMERO:+flexible,+model-driven+data+management+for+experimental+biology.">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nat Methods. 9, 245-253 (2012).</li><li>Culver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+hypoxia-induced+NF-kappaB.">Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB.</a> Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+of+DNA+replication+and+RNA+synthesis:+Historical+perspective+and+recent+advances+based+on+"click+chemistry.">Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry.</a> Cytometry A. 79, 328-337 (2011).</li></ol>

Il JRS è fondatore di Glencoe Software, Inc., una società commerciale statunitense open-source che contribuisce alla OMERO.

Abbiamo descritto il nostro utilizzo di un kit imaging RNA per esaminare gli effetti dell&#39;ipossia sulla sintesi di RNA in osteosarcoma (U2OS) cellule. Questa tecnica è relativamente semplice e fornisce dati relativi trascrizione globale a livello di singola cellula. Abbiamo modificato il protocollo convenzionale per questo kit per incorporare etichettatura in una camera di ipossia. A nostra conoscenza questo è il primo rapporto di utilizzo di questa tecnica per misurare le variazioni di sintesi dell&#39;RNA in ipossia. Il kit imaging RNA abbiamo usato è adatto per la sperimentazione in ipossia poiché richiede isotopi radioattivi e tecnicamente compatibili con le limitazioni di lavorare in una workstation atmosfera controllata. I problemi più comuni con questo fissazione efficiente tecnica preoccupazione e l&#39;etichettatura del campione. E &#39;estremamente importante che il PFA utilizzata per fissare il campione è fresco e le fasi di lavaggio che seguono la reazione&#39; scegliere &#39;vengono eseguite come descritto per garantire bassa bassa colorazione del campione. Se background fluorescenza diventa un problema, si raccomanda di lavare ancora una volta con 1 ml di imaging RNA tampone di reazione kit di risciacquo dopo il punto 2.7.4. Il kit imaging RNA qui menzionato rappresenta un avanzamento significativo nella tecnologia di imaging RNA in termini di semplicità d&#39;uso e la specificità e la velocità di reazione. Questa tecnica è limitata principalmente dal tempo necessario per etichettare il campione. Il kit imaging RNA richiede un periodo di etichettatura 1 ora che impedisce l&#39;esame dei rapidi cambiamenti RNA globale che si verificano di solito entro questo lasso di tempo. E &#39;per questo motivo il nostro punto prima volta è limitato a 1 ora e 15 min. La tecnica è associata con poche altre limitazioni che riguardano principalmente reagente compatibilità con altri marcatori fluorescenti, per esempio, questo kit imaging RNA non è compatibile con falloidina colorazione. Tutti gli approcci esistenti di studiare la sintesi di RNA in cellule sono basati su incorporazione di nucleosidi modificati nellaRNA nascente e il rilevamento di etichette incorporate con mezzi diversi. L&#39;approccio pionieristico si è basata sull&#39;utilizzo di precursori di RNA marcati radioattivamente seguita da rilevamento con autoradiografia. Questo metodo ha portato alla scoperta di fasi del ciclo cellulare e altri reperti importanti; tuttavia, ha un sacco di svantaggi, come la macchinosità del lavoro radioattività, tempi di esposizione lunghi e le immagini a bassa risoluzione di autoradiografia 6. Il successivo avanzamento nel campo sfruttato mezzi dell&#39;immunochimica per eliminare la necessità di radioattività. RNA è stato etichettato per incorporazione di Bru seguita da rilevazione immunochimica. Tuttavia, anticorpo efficace legame necessario denaturazione degli acidi nucleici per migliorare l&#39;accesso al DNA o RNA che ha causato la perdita di morfologia cellulare e danneggiato gli epitopi di molte proteine, impedendo loro ulteriore rilevazione con anticorpi fluorescente 13. L&#39;introduzione della tecnologia &#39;click chemistry&#39; semplificato il processo di rilevamento e tegli procedura rispetto a autoradiografia e immunochimica. La tecnologia è basata su azide-alchino Huisgen reazione di cicloaddizione dove alchino terminale 5-ethyniluridine lega con azide coniugato con il fluoroforo in presenza di Cu (I). La reazione è specifica, rapida, non richiede ulteriori passaggi, ed è facilmente compatibile con la rilevazione immunochimica di altri costituenti cellulari. Utilizzando questa tecnologia di imaging RNA abbiamo dimostrato che le cellule, nella stessa popolazione monostrato, hanno diversi livelli di sintesi di RNA in risposta all&#39;ipossia. Abbiamo ristretto il nostro esperimento per esaminare l&#39;effetto della sola produzione di RNA; tuttavia, è del tutto possibile con questo kit imaging RNA modificati, effettuare ulteriori reazioni multiplex che consentono una più complessa analisi della produzione di RNA. Ad esempio, la colorazione secondaria utilizzando un anticorpo specifico per marcatori di trascrizione attivi quali i livelli di fosforilazione RNA polimerasi II o anche componenti della traduzionezione macchinari per dare un&#39;indicazione della quantità di questo RNA di nuova produzione che viene convertito in proteine ​​sono possibili. Proteine ​​addizionali, quali actina, una proteina che non dovrebbe cambiare significativamente con ipossia, possono essere testati come controllo aggiuntivo. Inoltre, diversi tipi cellulari possono essere testate, in quanto è molto probabile che le cellule differenti avranno differenti tassi di sintesi di RNA e anche risposte diverse a ipossia. L&#39;utilizzo di questo kit imaging RNA è molto semplice, purché i passaggi vengono eseguiti come descritto. Passaggi critici nel protocollo riguardano placcatura cellule, la fissazione delle cellule e la colorazione e l&#39;acquisizione delle immagini. E &#39;importante per placcare le cellule ad una densità descritto per evitare sopra o sotto confluenza in sperimentazione che influenzerà notevolmente il risultato. E &#39;anche importante usare fissativo fresco, assicurando la migliore&#39; fotografia &#39;della cellula è preso e curare quando si lava le cellule dopo colorazione per ridurre il background ad un livello accettabile per l&#39;analisi efficiente. Infine, il metodo di acquisizione di immagini è di vitale importanza per ottenere immagini che sono di buona qualità sufficiente per la successiva analisi. Si consiglia di utilizzare il miglior microscopio ottico a disposizione per esaminare i campioni otticamente come il microscopio utilizzato in questo protocollo che è disponibile presso i centri più intensivo di ricerca a livello globale.

Ipossia (tensioni basse ossigeno) si verifica quando il normale di ossigeno ad un tessuto è disturbato. Ossigeno ambientale è sia una sostanza nutritiva e una molecola di segnalazione, fornendo spunti importanti per vari tipi di cellule. Le variazioni di ossigeno ambientale vengono rilevati da un gruppo di diossigenasi che controllano l&#39;attività di un fattore di trascrizione essenziale famiglia conosciuta come i fattori inducibili ipossia (HIF). Le HIF sono composte da due subunità, α e β. Ci sono tre isoforme conosciute di HIF-α (1, 2, e 3) e molteplici varianti di splicing di HIF-1β. HIF-1β è costitutivamente espresso e non regolato da livelli di ossigeno ambientali 1. I membri della famiglia HIF-α sono regolate in modo dinamico da una classe di prolina-idrossilasi (dottorati di ricerca) e il fattore di inibizione HIF (FIH); che richiedono entrambi ossigeno come co-fattore per catalizzare l&#39;idrossilazione di HIF-α 2,3. In normoxia i familiari HIF-α sono idrossilati e contrassegnati per proteosomal degrado della E3-ligasi, von Hippel Lindau (VHL). In ipossia i dottorati e FIH sono inattivi o hanno una ridotta attività. Le isoforme HIF-α stabilizzarsi, formano un eterodimero con HIF-1β, e per effetto di trascrizione di geni che forniscono la risposta cellulare all&#39;ambiente ipossico (Figura 1A) 4. Attuali tecniche di analisi dell&#39;RNA concentrano sulla quantificazione dei valori medi di tutti una data popolazione cellulare. Le cellule rispondono a uno stimolo ipossico avviando la trascrizione di una miriade di geni che permettono loro di adattarsi al loro ambiente ostile 5. Tuttavia, ipossia esiste spesso una sfumatura e cellule in un ambiente ipossico non sono soggetti ad uno stimolo ipossico uniforme. Descriviamo una implementazione dei kit di imaging RNA Click-iT in una workstation di ossigeno controllato per esaminare la sintesi di RNA globale a livello di singola cellula in ipossia. Il kit imaging RNA utilizza un anucleoside lkyne modificati, 5-etinile uridina (UE) e legatura chemoselective abilitare il rilevamento di sintesi di RNA globale temporalmente e spazialmente in cellule e tessuti 6. Brevemente, le cellule vengono trattate con ipossia e coltivate in presenza di UE. Vengono poi fissate e permeabilizzate e l&#39;incorporazione UE in RNA nascente viene rilevato mediante legatura chemoselective dell&#39;UE con azide contenente colorante. Un flusso di lavoro tipico per questa reazione è mostrato in Figura 1B. Abbiamo utilizzato il kit imaging RNA esaminare sintesi di RNA a livello di singola cellula che ha portato dal trattamento con ipossia. Le ridotte dimensioni del tag alchino consente incorporazione efficiente del nucleoside modificato in RNA specifico. La legatura chemoselective o &#39;click&#39; di reazione è altamente efficiente, veloce e specifico 7-10. Tutti i componenti di reazione sono bioinerte e la reazione non richiede temperature estreme o solventi. La reazione click negail requisito per la radiomarcatura convenzionale e permette la visualizzazione diretta dei risultati poiché l&#39;uscita è leggero. Inoltre, la molecola di rilevamento può facilmente penetrare campioni complessi per consentire analisi multiplex compresi gli anticorpi per la rilevazione di proteine ​​RNA-interattiva. Questo test di imaging RNA è compatibile con coloranti organici, tra cui Alexa Fluor e fluoresceina (FITC). Abbiamo misurato il cambiamento di sintesi di RNA dopo il trattamento delle nostre cellule utilizzando un&#39;implementazione dell&#39;ambiente microscopia porta oggetti remoti (OMERO). OMERO è un software open-source, disponibile all&#39;indirizzo <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . Questo software microscopio di visualizzazione e analisi delle immagini consente l&#39;accesso a, e l&#39;utilizzo di una vasta gamma di dati biologici, compresa la gestione di set di dati multidimensionali, eterogenei. L&#39;applicazione client consente la visualizzazione e l&#39;analisi di complessi dati immagine biologica 11 remoto;abbiamo usato per quantificare i cambiamenti visivi a livello mondiale e un&#39;unica sintesi di RNA cellulare. Questi dati e le operazioni necessarie per analizzare il nostro esperimento di imaging RNA utilizzando questo microscopio visualizzazione di immagini e software di analisi sono riportati di seguito. Abbiamo esaminato i cambiamenti nella sintesi di RNA globale a seguito del trattamento di osteosarcoma umano (U2OS), le cellule con ipossia fino a 24 ore. In tutte le condizioni, abbiamo rilevato cellula-cellula variazione del livello di produzione di RNA. Tempi brevi di esposizione all&#39;ipossia non hanno comportato cambiamenti significativi al livello di RNA nascente nelle cellule. Tuttavia, l&#39;esposizione di 24 ore di ipossia determinato un aumento significativo della quantità di RNA prodotta in cellule. La maggior parte delle risposte cellulari all&#39;ipossia sono misurate seguenti periodi prolungati di esposizione, come quelli 4 a 24 ore. Tuttavia, alcuni meccanismi vengono messi in atto molto prima, per esempio; Attivazione di NF-kB si verifica entro 5-15 min dell&#39;ipossia esposizione 12. Indagare ipo brevetempi di esposizione Xia è quindi giustificato e potrebbe sminuire le risposte più complesse, come il ciclo cellulare e l&#39;apoptosi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1313px;" width="1314">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">U-2 OS Primary Cells</td>
			<td style="width:92px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td align="right" style="width:115px;">92022711</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:703px;"><a href="http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&amp;dosearch=true">http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&#38;dosearch=true</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">14190094</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">41966029</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029">https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10270106</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-603E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin-EDTA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hypoxia Chamber</td>
			<td>Ruskinn</td>
			<td>InVivo2 300</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ruskinn.com/products/invivo2300">http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-10329/C10330</td>
			<td></td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&#38;catKey=601107&#38;filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&#38;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76240</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10M NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37% HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20252.335</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&amp;searchOp=or">https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&#38;searchOp=or</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VectaShield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483">http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actinomycin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deltavision Core Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.appliedprecision.com/">http://www.appliedprecision.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">softWoRx [Refered to in text as image processing software]</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.api.com/softworx.asp">http://www.api.com/softworx.asp</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CoolSnap HQ2 CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php">http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software]</td>
			<td>OME</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software]</td>
			<td>Systat Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php">http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of global rna synthesis at the single cell level following hypoxia

Ipossia o abbassamento della disponibilità di ossigeno è coinvolto in molti processi fisiologici e patologici. A livello molecolare, le cellule iniziano un particolare programma trascrizionale per montare una risposta cellulare appropriato e coordinato. La cella possiede parecchi enzimi sensore di ossigeno che richiedono ossigeno molecolare come cofattore per la loro attività. Queste vanno da prolina-idrossilasi a demethylases istoni. La maggior parte degli studi che analizzano risposte cellulari all&#39;ipossia sono basati su popolazioni cellulari e studi medi, e come tale analisi singola cella di cellule ipossiche sono raramente eseguita. Qui si descrive un metodo di analisi della sintesi di RNA globale a livello di singola cellula in ipossia utilizzando i kit di imaging RNA Click-iT in una workstation di ossigeno controllata, seguita da analisi al microscopio e quantificazione. Utilizzando cellule tumorali esposte all&#39;ipossia per periodi di tempo diversi, RNA è etichettato e misurato in ogni cella. Questa analisi consentela visualizzazione e cellula-cellula cambiamenti temporali sintesi dell&#39;RNA globale seguenti stress ipossico.

Uno schema della reazione kit imaging RNA è mostrato nella Figura 1B. Abbiamo usato questa reazione per determinare quantitativamente la sintesi di RNA totale in cellule U2OS dopo il trattamento con ipossia a livello sia globale (popolazione di cellule) individuale (singola cella) e. Le cellule sono state trattate con ipossia e coltivate in presenza di UE. Sono state poi fissate e permeabilizzate e da parte dell&#39;UE è stato rilevato da legatura chemoselective dell&#39;UE con azide contenente colorante. Questo &#39;click&#39; i risultati di reazione in un emissione di fluorescenza che può essere rilevato e quantificato utilizzando la microscopia a fluorescenza. Figura 2A mostra un tipico risultato di questo esperimento. Cellule fluorescente sono pseudocolored rosso e l&#39;immagine &#39;stato aperto in ambiente di microscopia aperto per gli oggetti remoti (OMERO). Questo software microscopio visualizzazione e analisi d&#39;immagine ha un attrezzo incorporato ROI che può essere utilizzato per selezionare individuo struttura subcellulareScritture e quantitativamente analizzano l&#39;intensità dell&#39;immagine all&#39;interno della regione prescelta. Un tipico esempio di output dati in seguito all&#39;uso di questo strumento nel programma client può essere visto in Figura 2B; intensità delle singole celle sono riportati accanto un&#39;immagine rappresentativa dall&#39;esperimento che serve come un controllo visivo per accertare la validità dei dati. Le singole intensità di fluorescenza delle cellule possono essere riportati in grafico a dispersione per mostrare la distribuzione delle singole intensità cellulari all&#39;interno della popolazione di cellule trattate. Un esempio di questo tipo di grafico è visto in Figura 2C. Rappresentazione grafica dei dati di intensità in questo modo è utile perché permette un rapido confronto dei risultati di trattamento e dimostra chiaramente il notevole eterogeneità una popolazione cellulare trattamento che è altrimenti oscurata utilizzando rappresentazione dei dati standard. L&#39;eterogeneità risposta è interessante in questo esperimento perché anche se uno stimolo ipossico uniforme era unpplied alle cellule, è evidente che ogni cellula dalla stessa popolazione monostrato risponde diversamente a questo stimolo. Figura 2D raffigura il risultato complessivo del nostro esperimento. Intensità di fluorescenza di tutte le cellule all&#39;interno di una popolazione di trattamento sono stati mediati e poi tracciate in questo grafico a barre. T-test di Student è stato utilizzato per calcolare la probabilità statistica di ciascun gruppo di trattamento significativamente diversa dal controllo. È interessante notare, questi dati mostrano che vi è un aumento statisticamente significativo sintesi di RNA globale nel tempo quando le cellule vengono trattate con U2OS ipossia (a volte maggiore di 1 ora e 30 min * p &lt;0.01;. ** P &lt;0,05 e p *** &lt;0.001 e n&gt; 30). Questi dati mostrano che dopo periodi di trattamento più lunghi ipossia, la cella concentra i suoi sforzi sulla produzione di RNA anche in questo ambiente ipossico ostile. Actinomicina D trattamento ablates completamente l&#39;intensità di fluorescenza come previsto.<img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> Figura 1. A. Il sistema HIF risponde ai cambiamenti di ossigeno cellulare. In questo ipossia schema semplificato stabilizza dell&#39;eterodimero HIF impedendo HIF-α idrossilazione (-OH) dagli enzimi prolyl idrossilasi (dottorati di ricerca) e la sua successiva polyubquitination di von Hippel-Lindau proteine ​​(VHL). Risultati stabilizzazione HIF l&#39;attivazione di una miriade di geni che aiutano il rispondono cellulare all&#39;ipossia cellulare B. sintesi di RNA può essere rilevato utilizzando il saggio Click-IT.; le cellule sono etichettati con l&#39;UE dopo il trattamento la reazione Click rileva sintesi di RNA che può essere quantificata da intensità di fluorescenza e microscopia ottica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una più grande vers</a>ione di questa figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> Figura 2. A. Screenshot da OMERO per mostrare output tipico microscopio a seguito di etichettatura RNA. Questo software microscopio visualizzazione di immagini e di analisi in grado di estrarre rapidamente i dati di intensità su un livello di singola cellula utilizzando il macro ROI integrato. Uno screenshot del output di questo comando è mostrato in sintesi B. globale RNA può essere dedotta dalla intensità singola cella, l&#39;intervallo di cui può essere visto in un diagramma a dispersione C. Una rappresentazione formale di questi dati aggregati può essere visto D. * p &lt;0.01; ** P &lt;0.05 e *** p &lt;0.001 e n&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <table border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagenti coltura cellulare </td></tr><tr><td> Tampone fosfato (PBS) a pH 7,2-7,6 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) </td></tr><tr><td> Siero fetale di vitello (FCS) sterilizzato per filtrazione </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td></tr><tr><td> L-glutammina </td></tr><tr><td> 0,05% tripsina-EDTA (1%) </td></tr><tr><td> 70% di etanolo </td></tr><tr><td> Actinomicina D (1 mg / mL magazzino) </td></tr><tr><td> Cella Cultura Attrezzature </td></tr><tr><td> Sterile Pasteur Pipettes </td></tr><tr><td> Una gamma di colture cellulari trattati plastico adatto per la manutenzione e il trattamento di cellule in coltura </td></tr><tr><td> Bagnomaria a 37 ° C </td></tr><tr><td> Cappa a flusso d&#39;aria laminare </td></tr><tr><td> Incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Ipossia Workstation fissata a 37 ° C, 5% CO 2, 1% O 2 </td></tr><tr><td> Vetrini </td></tr><tr><td> pinze di precisione </td></tr><tr><td> Emocitometro </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti e le attrezzature necessarie per la coltura delle cellule U2OS. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> Componenti di reazione </td><td colspan="6"> Numero di Coprivetrini </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Click-iT tampone di reazione RNA (Component C) </td><td> 428 microlitri </td><td> 856 microlitri </td><td> 1,7 ml </td><td> 2.1 ml </td><td> 2.58 ml </td><td> 4.3 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 (Component D) </td><td> 20 microlitri </td><td> 40 microlitri </td><td> 80 microlitri </td><td> 100 microlitri </td><td> 120 microlitri </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor azide (preparato nella fase 2.3) </td><td> 1,8 microlitri </td><td> 3,7 microlitri </td><td> 7.4 microlitri </td><td> 9.3 microlitri </td><td> 11.28 microlitri </td><td> 18.8 ml </td></tr><tr><td> Click-iT Additivo tampone di reazione (Preparata nel passo 2.3) </td><td> 50 microlitri </td><td> 100 microlitri </td><td> 200 ml </td><td> 250 microlitri </td><td> 300 ml </td><td> 500 microlitri </td></tr><tr><td> Approssimativa volume totale </td><td> 500 microlitri </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> . Tabella 2 di imaging RNA cocktail di reazione kit: Tabella di riferimento dettagliare rapporto dei componenti della miscela master per l&#39;imaging RNA reazione kit in base al numero di vetrini da colorare. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fluoroforo </td><td> Eccitazione (nm) </td><td> Emission (nm) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342, legato al DNA </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . Tabella 3 massimi di emissione di fluorescenza / eccitazione: approssimativamente massima emissione di fluorescenza / eccitazione per Alexa Fluor colorante e Hoechst 33342 legato al DNA.

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Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Descriviamo una tecnica per l&#39;analisi della sintesi dell&#39;RNA globale in ipossia utilizzando immagini. Click-chimica etichettatura di RNA non è stato precedentemente eseguito in ipossia e consente la visualizzazione dei cambiamenti di RNA globali a livello di singola cellula. Questo approccio integra le tecniche RNA medi esistenti, permettendo la visualizzazione diretta di cellula-cellula cambiamenti nella sintesi dell&#39;RNA globale.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

analysis-global-rna-synthesis-at-single-cell-level-following

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  University of Dundee, UK.  Descriviamo una tecnica per l'analisi della sintesi dell'RNA globale in ipossia utilizzando immagini. Click-chimica etichettatura di RNA non è stato precedentemente eseguito in ipossia e consente la visualizzazione dei cambiamenti di RNA globali a livello di singola cellula. Questo approccio integra le tecniche RNA medi esistenti, permettendo la visualizzazione diretta di cellula-cellula cambiamenti nella sintesi dell'RNA globale. 

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Ricerca

Biologia

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Analisi diretta di singole cellule mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l&#39;RNA fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analisi della funzione Beta-cellulare usando la formazione immagine del calcio cella singola risoluzione in Zebrafish isolotti

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...