Name: isolation of perivascular multipotent precursor cell populations from human cardiac tissue
Uploaded: 2016-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue at JoVE.com

The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children's Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).

1. Processamento de Cardiac Humano Amostra <ol><li> Certifique-se que todos os fluidos, recipientes, instrumentos e da área operacional dedicado são estéreis. </li><li> Colocar a amostra de tecido cardíaco (adquiridos pelo banco de tecidos ou equipa cirúrgica) em meio de armazenamento composto de forma refrigerada de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) contendo 20% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) em gelo para o transporte 3. </li><li> Retirar a amostra cardíaca ...

<ol>
	<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).</li><li>Laflamme, A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Chen, W. C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myocardial+pericytes:+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity.">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).</li><li>Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mesenchymal+stem/progenitor+cells+in+human+first-trimester+fetal.">Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal.</a> Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).</li><li>Zuk, P. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+can+induce+long-term+acceptance+of+solid+organ+allografts+in+synergy+with+low-dose+mycophenolate.">Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate.</a> Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).</li><li>Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+heterogeneous+mesenchymal+stem+cells+with+single-cell+transcriptomes.">Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes.</a> Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Ozerdem, U., Stallcup, W. 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W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., P&#233;ault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+multipotent+progenitor+cells+in+human+organs.">Perivascular multipotent progenitor cells in human organs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).</li><li>Kang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+perivascular+localization+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+brain.">Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain.</a> Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).</li><li>Chen, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pericytes+for+ischemic+heart+repair.">Human pericytes for ischemic heart repair.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).</li><li>Campagnolo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+vena+saphena+contains+perivascular+progenitor+cells+endowed+with+clonogenic+and+proangiogenic+potential.">Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential.</a> Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).</li><li>Katare, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+pericyte+progenitor+cells+improves+the+repair+of+infarcted+heart+through+activation+of+an+angiogenic+program+involving+micro-RNA-132.">Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132.</a> Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).</li><li>Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., P&#233;ault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tunica+Adventitia+of+Human+Arteries+and+Veins+As+a+Source+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+long-term+culture+of+multipotent+progenitor+cells+affiliated+with+the+walls+of+human+blood+vessels:+myoendothelial+cells+and+pericytes.">Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes.</a> Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).</li></ol>

A evidência crescente suporta uma capacidade regenerativa limitada do coração humano adulto após a lesão. Identificação e caracterização de células precursoras nativas responsáveis ​​por estas respostas regenerativos em corações feridos são crítica, tanto para a compreensão dos mecanismos associados e vias de sinalização e o desenvolvimento de abordagens para utilizar estas células terapeuticamente. Protocolos anteriores descreveram o isolamento de subconjuntos de cél...

O coração tem sido considerada um órgão de pós-mitótico. No entanto, estudos recentes têm demonstrado a presença de volume de negócios de cardiomiócitos limitada nos corações humanos adultos 1. As células-tronco / progenitoras nativas com potencial de diferenciação de cardiomiócitos também foram identificados dentro do miocárdio em roedores adultos e corações humanos, incluindo Sca-1 +, c-kit +, formando-cardiosphere e, mais recentemente, as células precursoras perivasculares 2,3. Estas células representam candidatos atraentes para terapias destinadas a reforçar cardíaca reparação / regeneração por meio de transplante de células ou a estimulação da proliferação in-situ. Mesenquimais estaminais / células do estroma (MSC) foram isoladas a partir de quase todos os tecidos humanos 4,5 ensaios clínicos das aplicações terapêuticas de MSC foram realizadas para várias condições patológicas, tais como a reparação cardiovascular 6, reacção do enxerto contra o hospedeiro de doença 7 </sup&gt;, E cirrose hepática 8. Efeitos benéficos têm sido atribuídas à capacidade de MSCs para: lar de locais de inflamação 9; diferenciarem em diferentes tipos de células 10; secretam moléculas pró-reparadoras 11; e modular a resposta imune do hospedeiro 12. O isolamento de MSCs tem tradicionalmente contado com a sua adesão preferencial aos substratos de plástico. No entanto, a população resultante de células é tipicamente sensivelmente 13 heterogénea. Através da utilização de células activadas fluorescentes (FACS) com uma combinação de marcadores chave de células perivasculares, fomos capazes de isolar e purificar uma população precursora MSC como multipotentes (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) a partir de vários tecidos humanos, incluindo adultos músculo esquelético e gordura branca 14. populações de células em vários tecidos perivasculares não cardíacos foram mostrados como tendo propriedades / progenitoras de células-tronco umnd estão sendo investigados para uso clínico no cenário cardiovascular. Pericitos, um dos subconjuntos de células perivasculares mais conhecidos, são uma população heterogênea que desempenhar vários papéis fisiopatológicos, incluindo no desenvolvimento de novos vasos 15, a regulação da pressão arterial 16, e manutenção da integridade vascular 17,18. Como mostrado em vários tecidos, subconjuntos específicos de pericitos nativamente expressar antigénios MSC e sustentar seus fenótipos MSC-like em cultura primária após FACS purificação 14. Além disso, estas células de manter de forma estável os seus fenótipos de longo prazo no interior da cultura e exibem potencial de diferenciação de multi-linhagem, semelhante ao MSC 19,20. Estes resultados sugerem que pericitos são uma das origens da MSC evasivo 14. O potencial terapêutico dos pericitos foi demonstrada com uma redução na formação de cicatrizes do miocárdio e função cardíaca melhorada após o transplante em feridas isquemicamentecorações 21. Recentemente, purificado com sucesso pericitos do miocárdio humano e demonstrou seus fenótipos MSC-like e multipotency (adipogênese, condrogênese e osteogênese) com a ausência de tecido muscular esquelético 3. Além disso, pericitos do miocárdio apresentaram diferenciais cardiomiogênico capacidades potenciais e angiogénicos quando comparado com os seus homólogos purificados a partir de outros órgãos. A segunda população de células estaminais / progenitoras multipotentes perivasculares, a célula adventícia, foi isolado a partir de veias safenas humanas com base na expressão positiva CD34 22. Células adventícias venoso foram mostrados como tendo um potencial clonogénico, capacidade de diferenciação mesodérmicos e potencial pró-angiogénico in vitro. Transplante destas células para os corações de ratos lesionados por isquemia resultou numa redução na fibrose intersticial, um aumento na angiogénese e o fluxo sanguíneo do miocárdio, reduzida dil ventricularção, e aumento da ejecção cardíaca fracção 23. Interessantemente, as células adiposas adventícia foram mostrados a perder expressão de CD34 e CD146 regular a expressão na cultura em resposta ao tratamento angiopoietina II, sugerindo que a adopção de um fenótipo de pericitos estimulação com 24. Dentro do coração, no entanto, a população de células da adventícia ainda não foi prospectivamente purificado por FACS e / ou bem caracterizados. Utilizando os procedimentos de isolamento celular descritos nas seções a seguir, estamos actualmente a caracterizar células adventícias do miocárdio e investigar o seu potencial para aplicações regenerativas. Aqui nós descrevemos um método para isolar e purificar duas subpopulações de células estaminais / progenitoras perivasculares do miocárdio fetal ou adulto humano. Este método de isolamento de células prospectivo vai permitir aos investigadores obter subconjuntos de células tronco / progenitoras perivasculares isogênicas de biópsias cardíacas humanas para estudos comparativos e furtheR explorar o seu potencial terapêutico em várias condições patológicas cardíacas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AbC Anti-mouse Bead Kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100-017</td>
			<td rowspan="3">Reconstitute powder as required and filter sterilise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD34-PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555822</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD45-APC-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557833</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD56-PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557747</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD144-PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561566</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD146-AF647</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA2141A647</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM2-BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For collection of cells and culture until adhered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>10500-064</td>
			<td>Freeze in aliquots and keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Dilute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1k-PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1k-APC-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557873</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1k-PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557872</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1k-PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561566</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1k-647</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1209A647</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5905</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Film - Parafilm M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15979-063</td>
			<td>Freeze in aliquots and keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline pH 7.4</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td>Keep sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5%(10X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;FACSARIA FUSION</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Activated Cell Sorter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of perivascular multipotent precursor cell populations from human cardiac tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

As células individuais foram distinguidos dos detritos e dupletos na base de distribuições dispersão frontal e lateral. células vivas foram identificados por sua incapacidade de absorver o corante DAPI. A estratégia gating foi escolhido com base na rotulagem deste vivo, dissociação de células inteiras cardíaca (Figura 1) controlo de isotipo. A partir das células vivas, células CD45 + foram fechado em primeiro lugar para fora, seguido de células CD...

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Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Biologia do Desenvolvimento

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

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A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...