Name: detection of copy number alterations using single cell sequencing
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing at JoVE.com

Мы благодарим Стюарт Levine комментариев к этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Грант GM056800 и Кэти и Curt Marble фонда исследования рака Ангелика Амон и частично Koch институт поддержки Грант P30-CA14051. Ангелика Амон также следователь Медицинского института Говарда Хьюза и Гленн фонда биомедицинских исследований. KAK поддерживается NIGMS Training Грант T32GM007753.

<ol>
	<li>Kahlem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+Level+Alterations+Reflect+Gene+Dosage+Effects+Across+Multiple+Tissues+in+a+Mouse+Model+of+Down+Syndrome.">Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome.</a> Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).</li><li>Torres, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317 (5840), 916-924 (2007).</li><li>Itsara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+Analysis+of+Large+Copy+Number+Variants+and+Hotspots+of+Human+Genetic+Disease.">Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease.</a> Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).</li><li>Sudmant, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity,+population+stratification,+and+selection+of+human+copy-number+variation.">Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation.</a> Science. 349 (6253), aab3761 (2015).</li><li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumor+progression+from+genomic+heterogeneity.">Inferring tumor progression from genomic heterogeneity.</a> Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).</li><li>Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+genomic+heterogeneity+in+breast+cancer+with+clonal+divergence+between+primary+carcinomas+and+lymph+node+metastases.">Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases.</a> Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).</li><li>Yates, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing.">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).</li><li>Forsberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+somatic+structural+changes+in+the+nuclear+genome+of+human+blood+cells.">Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells.</a> Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).</li><li>Laurie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detectable+clonal+mosaicism+from+birth+to+old+age+and+its+relationship+to+cancer.">Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).</li><li>Jacobs, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detectable+clonal+mosaicism+and+its+relationship+to+aging+and+cancer.">Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).</li><li>Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+low+levels+of+aneuploidy+across+mammalian+tissues.">Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).</li><li>Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+megabase-scale+somatic+copy+number+variation+using+single-cell+sequencing.">Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing.</a> Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).</li><li>. KAPA Library Quantification Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2016)</li><li>. DNAcopy Available from: <a target="_blank" href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html">https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html</a> (2016)</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li><li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Szulwach, K. E., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Genetic+Analysis+Using+Automated+Microfluidics+to+Resolve+Somatic+Mosaicism.">Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).</li><li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Detection+of+Single-Nucleotide+and+Copy-Number+Variations+of+a+Single+Human+Cell.">Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+in+breast+cancer+revealed+by+single+nucleus+genome+sequencing.">Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing.</a> Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).</li><li>Zhang, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromothripsis+from+DNA+damage+in+micronuclei.">Chromothripsis from DNA damage in micronuclei.</a> Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).</li><li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Genomics:+Advances+and+Future+Perspectives.">Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives.</a> PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Традиционно, определение ВКК и анеуплоидии на уровне отдельных клеток, необходимых цитологические методы, такие как рыба и небо. Теперь одна клетка секвенирование возникла в качестве альтернативного подхода к таким вопросам. Single секвенирование ячейка имеет преимущества по сравнению с FISH и SKY, как это и геному и высокое разрешение. Кроме того, при применении соответствующих методов контроля качества, одна ячейка секвенирование может обеспечить более надежную оценку ВКК и анеуплоидии, как он не восприимчив к гибридизации и распространения артефактов, присущих FISH и SKY. Тем не менее, многие из недавних применений одноклеточной секвенирования не были подтверждены тщательной оценки чувствительности и специфичности методов и анализов. В самом деле, некоторые из аналитических подходов , используемых в других исследованиях, связанных с высокими частотами (&gt; 50%) ложноположительных ХНОП вызовов 12. Подход, который мы описали были тщательно протестированы с использованием клеток кпсобственное бремя ХНОП для того , чтобы определить истинные и ложные скорости обнаружения и оптимизации чувствительности и специфичности обнаружения CNV 12. Используя контроль качества и аналитических подходов, описанных в данном протоколе, примерно на 20% 5 прироста Mb, 75% 5 потерь Мб, а все ВКК превышает 10 Мб может быть обнаружен. Хотя определение частоты ложных обнаружения одиночных клеток секвенирования трудно, мы подсчитали, что это будет меньше, чем на 25%. Этот протокол может быть применен к клеткам из разных источников, сценарии могут быть изменены, чтобы настроить разрешение обнаружения CNV, и протокол может быть адаптирован для идентификации других типов геномных изменений. Есть множество средств отделяя свежих тканей на отдельные клетки, и многие публикации описывают процедуры , оптимизированные для конкретных тканей, таких как кожа 24 и 25 мозга. Мы предпочитаем, чтобы изолировать отдельные клетки с помощью микроаспирацией, поскольку она позволяет FO<html> R визуальная оценка каждой ячейки для секвенирования. Тем не менее, также можно выделить отдельные клетки с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) 26 и микроканалов устройств 27. Если одиночный изолятор и весь геном амплификации осуществляется вручную, целесообразно выделить и усилить до сорока клеток в один прием. Для получения высокого качества данных секвенирования одной клетки, очень важно, что усиление отдельных геномов клеток является равномерным и полным. Мы считаем, что качество отдельных клеток изолированы, а также эффективности лизиса и усиления оказывает значительное влияние на качество данных секвенирования. Таким образом, клетки должны быть собраны из их родной среды как раз до выделения и амплификации целого генома следует начинать сразу же после того, как клетки выделяют. Кроме того, лизис и фрагментация шаг следует следовать в точности, как описано в 2,3-2,6 шагов. &quot;&gt; Алгоритмы могут быть скорректированы , чтобы изменить разрешение обнаружения CNV, с противоположными эффектами на чувствительность и специфичность 12. Кроме того , можно настроить пороговые значения для обнаружения целого хромосом анеуплоидии в установке тетраплоидия 11. Тем не менее, мы находим , что наш подход ограничивается обнаружением CNVs более 5 Мб, так как шум , вводимый в течение всего генома амплификации усложняет обнаружение небольших вариантов 12. Будущие улучшения в целом подходы генома амплификации должны в конечном итоге повысить разрешение обнаружения CNV использованием одноклеточной секвенирования. Одно секвенирование ячейка позволяет для исследования не только число копий изменений , но и отдельных вариаций 28 нуклеотидов, 29 и 30 структурных вариаций. Наш протокол для выделения одной ячейки могут быть применены, чтобы ответить на эти другие Questions. Тем не менее, выбор всего метода амплификации генома зависит от конкретного применения. Описанный в данном протоколе, который основан на полимеразной цепной реакции, лучше всего подходит для обнаружения изменений в количестве копий , поскольку оно связано с более низкими уровнями смещения 32 усиления. Для исследования других типов геномных изменений, таких как единичные нуклеотидные другие методы амплификации целого генома , как полагают, более подходящим 31, 32.

Изменения в ДНК число копий может варьироваться в размерах от нескольких пар оснований (число копий вариантов) (ВКК) для целых хромосом (анеуплоидии). Скопировать номер изменения , затрагивающие большие участки генома может иметь серьезные последствия фенотипические путем изменения экспрессии до тысяч генов 1, 2. ВКК , которые присутствуют во всех клетках популяции могут быть обнаружены с помощью объемной секвенирование или микрочипов методов 3, 4. Тем не менее, население также может быть генетически гетерогенную, с ВКК существующих в подгруппе населения или даже отдельных клеток. Генетическая гетерогенность является общим при раке, вождение эволюции опухоли, а также присутствует в нормальных тканях, с неизвестным следствие 5, 6, 7, 8, 9 <suр&gt;, 10. Традиционно, генетическая гетерогенность была оценена либо цитологических подходов или навального секвенирования. Цитологические подходы, такие как флуоресценции в гибридизация (FISH), хромосомных спредов и спектральное кариотипирование (SKY) в, имеют преимущество , идентифицирующих изменений , присутствующих в отдельных клетках , но имеют высокий процент ошибок из - за артефактов гибридизации и распространения 11. Эти подходы также ограничены в своей резолюции только выявить изменения количества копий, охватывающих несколько megabases. Секвенирование или микрочипы сыпучего ДНК, хотя и выше, в точности и разрешающей способности, является менее чувствительным. Для того чтобы обнаружить генетическую гетерогенность подходами, популяционных, варианты должны присутствовать в существенной доли клеток в популяции. Появление методов для амплификации геномной ДНК из отдельных клеток позволило последовательности генома отдельных клеток. Одноместный seque ячейкаncing имеет преимущества высокого разрешения, высокой чувствительностью, и, когда применяются соответствующие методы контроля качества, высокая точность 12. Здесь мы опишем метод обнаружения Мегабазе масштаба изменения в количестве копий в одиночных камерах. Выделим отдельные клетки с помощью микроаспирацией, амплификации геномной ДНК с использованием линкер-адаптер PCR, подготовить библиотеки для следующего поколения секвенирования, и обнаружить число копий варианты обеими скрытой марковской модели и круговой бинарной сегментации.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing (ID 3/16&#34;, OD 5/16&#34;, ~1 foot)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing (ID 5/16&#34;, OD 7/16&#34;, ~6 inches)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 um)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28144-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (5 ml)</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-2837-5</td>
			<td>Any plastic 5 mL pipette should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Water Trap for Oxygen Use</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>700220210813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34502-99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470156-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell&#160;Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR&#160;Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td>Any 96-well PCR plate should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-081</td>
			<td>Any 96-well tissue culture plate should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSA5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini plate spinner</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1225Z37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096&#160;</td>
			<td>Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Ampure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Any similar magnetic tube strip should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4845&#160;</td>
			<td>This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of copy number alterations using single cell sequencing

Обнаружение геномных изменений в одной резолюции ячейки имеет важное значение для характеристики генетической гетерогенности и эволюции в нормальных тканях, рака и микробных популяций. Традиционные методы оценки генетической гетерогенности были ограничены низким разрешением, низкой чувствительностью и / или низкой специфичности. Одно секвенирование клетка стала мощным инструментом для обнаружения генетической гетерогенности с высокой разрешающей способностью, высокой чувствительностью и, когда надлежащим образом проанализированы, высокой специфичности. Здесь мы приводим протокол для выделения, амплификации целого генома, секвенирование и анализ отдельных клеток. Наш подход позволяет надежной идентификации Мегабазе масштаба варианты количества копий в одиночных камерах. Тем не менее, аспекты данного протокола также могут быть применены для исследования других типов генетических изменений в отдельные клетки.

Собранный аспиратор должен появиться похожий на тот , на рисунке 1А. Игла должна быть обращено таким образом, что она достаточно широкая для одной ячейки, но не настолько широк, что большой объем составлен с одной ячейкой. Аспирационные отдельные клетки легче , когда есть от одного до пяти ячеек в поле 10X (Рисунок 1В). Если весь геном амплификации является успешным, образец будет выглядеть как мазок на агарозном геле (рис 2, полосы 1, 2, 4, 5, 6 и 7). Слабое или отсутствие мазка указывает неудавшуюся реакции амплификации , и образец не должен быть секвенирован (рисунок 2, полосы 3 и 8). После подготовки библиотеки, распределение по размерам фрагмент образцов следует оценивать с помощью капиллярного электрофореза на анализатор фрагмента.Успешно подготовленные библиотеки будут иметь достаточно равномерное распределение размеров фрагментов от 150 до 900 пар оснований (фиг.3, А, В). Ошибка подготовка библиотеки приведет к неравномерным распределением размера фрагмента и такие библиотеки не должны быть секвенированы (3С). Обработка данных секвенирования с помощью скрытой марковской модели (HMMcopy) и круговой бинарной сегментации (DNAcopy) будет анализировать геном каждой клетки на сегменты расчетного количества копий. Эти сегменты затем могут быть отфильтрованы , чтобы идентифицировать те , с предполагаемым числом копий в соответствии с коэффициентом усиления или потери в одной ячейке (таблица 1). Эти отфильтрованные сегменты из HMMcopy и DNAcopy должны затем быть перекрыты для выявления высокого доверия ВКК. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> Рисунок 1. Одиночные изоляцию клеток. (<html> А) Собранный microaspirator. (B) 10X поле показ диссоциируют клеток (стрелки) и microaspirator иглы (нижний правый угол). Аспирационные отдельные клетки легче, когда есть от одного до пяти ячеек в поле 10Х. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> Рисунок 2. Амплификация полного генома. Электрофорез в агарозном геле 5 мкл полного генома продуктов амплификации. Образцы, которые успешно усиливающие будут отображаться в виде ярких мазков из 100 б.п. до 1 кб (полосы 1, 2, 4, 5, 6 и 7) и могут быть упорядочены. Образцы, которые не успешно усиливающие будет производить слабые мазки или не мазок (полосы 3 и 8) и не должны быть секвенировали.large.jpg &quot;целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> Рисунок 3. Подготовка библиотеки. Типичные результаты анализатора фрагмента. Графики показывают, что размер фрагмента (в п.н.) по оси X и относительных единицах флуоресценции (РФС) по оси Y. Справа от каждого графика представляет собой инсценировку гель пер. (А) Результаты для идеального образца, с равномерным распределением от 150 до 900 пар оснований и без резких пиков или смещения в одну сторону. Этот пример является приемлемым для секвенирования. (B) Результаты в образце, ладно с распределением по размерам перекос в сторону меньших размеров фрагментов. Хотя это не является оптимальным, образец все еще может быть секвенирован. (C) Результаты с неисправного образца, с преобладанием небольших размеров фрагментов. Это, вероятно, вызвано длительной инкубации в течение стадии tagmentationподготовки библиотеки. Этот пример не должен быть секвенированы. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> Образец </td><td> сегмент </td><td> Chr </td><td> Начало </td><td> Конец </td><td> состояние </td><td> медиана </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> chr8 </td><td> 144500001 </td><td> 146500000 </td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67000001 </td><td> 134500000 </td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> сhr19 </td><td> 1 </td><td> 20000000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> chrY </td><td> 1 </td><td> 59500000 </td><td> 2 </td><td> -1,506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> Образец </td><td> Chrom </td><td> Старт бен </td><td> Конец бин </td><td> Начало </td><td> Конец </td><td> Seg среднее </td><td> Seg мед </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62612945 </td><td> 129971511 </td><td> 1,4688 </td><td> 0,157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28416392 </td><td> 1,4141 </td><td> 0,1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrX </td><td> 77 </td><td> 126 </TD&gt; <td> 51659160 </td><td> 95343369 </td><td> 1,3548 </td><td> 0,1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrY </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23805358 </td><td> -2,7004 </td><td> 0,3591 </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Анализ данных. Отфильтрованные сегменты, генерируемые HMMcopy и DNAcopy из одной ячейки. Перекрытие этих двух результатов показывает прирост на хромосоме 10 от 67 до 130 Мб, а также усиления на хромосоме 19 от 0 до 20 Мб. Мы обнаружили , что прибыль от проксимальной части хромосомы 19 являются артефактом одноклеточ- секвенирования 12.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing at JoVE.com

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Одно секвенирование клетка становится все более популярным и доступным инструментом для решения геномных изменений при высоком разрешении. Мы предоставляем протокол, который использует одноклеточной секвенирования для идентификации числа копий изменений в одиночных камерах.

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Одноклеточный экспрессии генов с помощью Multiplex RT-КПЦР к характеризации гетерогенности редких популяций лимфоидных

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Одноклеточный экспрессии генов профилирование с помощью FACS и КПЦР с внутренними стандартами

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

На основе массива сравнительной геномной гибридизации платформа для эффективного обнаружения копии номер вариации в быстро нейтрон-индуцированной Люцерна truncatula мутантов

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Создание трансгенных растений с одной копии вставки с помощью бинарный вектор BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Одноклеточная РНК секвенирование и анализ островков поджелудочной железы человека

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...