The authors have no acknowledgements.

1. הדגימה ספוגית בתחום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבש זוג נקי של כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את גודל שטח הדגימה בלי לגעת פני השטח באמצעות קלטת או שליט מדידה. נסו להעריך את האזור בצורה מדויקת ככל האפשר ולמלא טופס דיווח (לוח משלימה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הערכה הספוגית עבור דליפות אפשריות ושקיות תחבורת תווית מדגם וערכות ספוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הספוגית על פני שטח הדגימה כדלקמן: במכה אחת בכיוון אופקי, במכה אחת בכיוון אנכי, ושבץ אחד בכיוון אלכסוני. אל ספוגית שטח פנים גדול יותר מ -700 ס&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל ספוגית לתוך צינור ו להדק את המכסה מאובטח. </li></ol> אחסון 2. ותחבורה של מטליות אל המעבדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מטליות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות. אם אחסון לפרקי זמן ארוכים יותר נדרש, לאחסן את המטליות ב -20 ° C (או -70 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינורות ב C 0-4 מעלות (כלומר. , להשתמש חבילות קרות) במכל מבודד במהלך הובלה למעבדת הספינה בתוך 24-48 שעות של אוסף. </li></ol> 3. ריכוז וירוס, הפקת רנ&quot;א נגיפי וטיהור הערה: כל הצעדים צנטריפוגה להשתמש בצנטריפוגה בראש הטבלה ב 5000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת. מומלץ לשים לב ולהיזהר כשעובדים עם חילוץ חומצה האוניברסלי גרעין (יונקס) החיץ. תלבש משקפי מגן או מגן פנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל אחד 15 מ&quot;ל צינור ואחד טור RNA Midi עבור כל דגימה. כלול שליטת חילוץ שלילית בכל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את הפתרון תמוגה עבור 10 מטליות, לערבב 25 מ&quot;ל של חיץ יונקס עם 25 מ&quot;ל של PBST (PBS pH 7.2 המכיל 0.02% Tween-80). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של ההשעיה coliphage MS2 (10 6 PFU / μl) 50 מ&quot;ל של תמיסת תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ספוגית בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל ולהוסיף 5 מ&quot;ל פתרון תמוגה. מערבבים דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוסף 5 מ&quot;ל 100% אתנול לצינור כל מערבולת עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הספוגית מ -15 צינור המ&quot;ל (הוא מכיל מאגר יונקס) לחיצה קלה כנגד הצד של הצינור כדי להסיר עודפי נוזלים ולאחר מכן למחוק את הספוגית. הכרכים הנותרים צריכים להיות בין 9-10 מ&quot;ל. </li></ol> 4. טור Midi ויראלי גרעין הפקת חומצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר 4.5 מ&quot;ל יונקס / אתנול תערובת משלב 3.6 על בצנטריפוגה midi טור, וזורקים את תסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 4.5 אחר מיליליטר מאותה התערובת על הטור, צנטריפוגות אותו, וזורק את התסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הכביסה הראשונה, להוסיף 3.5 מ&quot;ל של אתנול 70% על הטור Midi, צנטריפוגות וזורקים את תסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשטוף את השני, להוסיף 3.5 מ&quot;ל של אתנול 70% על הטור Midi. צנטריפוגה וזורק את התסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ספין יבש, צנטריפוגות עמודות מידי כדי להסיר כל עקבות של אתנול (אשר יכול להשפיע התאוששות רנ&quot;א נגיפי שלך באופן שלילי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">מניחים את הטור Midi בתוך שפופרת צנטריפוגות 15 מ&quot;ל חדש. הוסף 250 μl חיץ elution על הטור Midi; לחכות 1 דקות לפני צנטריפוגה להשיג התאוששות רנ&quot;א נגיפי הגבוהה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את חומצות גרעין שחולצו ב -70 ° C או להמשיך מיד לשלב 5. </li></ol> ריכוז 5. ויראלי חומצות גרעין שימוש RNA נקי ערכות מרוכזות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של RNA חיץ מחייב 250 μL של RNA eluted בשלב 4.7 לעיל ו מערבולת למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 750 μL 100% אתנול ו מערבולת למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל טור ספין עבור כל דגימה. טענתי מדגם 750 μL על טור ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עמודות ספין XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את 750 μL הנותרים על עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קדם שטיפה, להוסיף 400 חיץ הכנה μL RNA כל עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הכביסה הראשונה, להוסיף 800 μL RNA הצפת לשטוף כל עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשטוף את השני, להוסיף 400 μL RNA לשטוף הצפת לטוות עמודה צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ספין יבש, צנטריפוגות טור ספין כדי להסיר כל עקבות של חיץ לשטוף ב XG 12,000 במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות ספין עמודה צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ elution 25 μL על הטור ספין דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. זה יגביר את ההתאוששות של רנ&quot;א נגיפי מהעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף הרנ&quot;א על ​​ידי צנטריפוגה העמודה ספין על XG 10,000 דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כך או להמשיך ישירות RT-qPCR (שלב 6) או RNA החנות ב -70 ° C. </li></ol> 6. Mutiplex RT-qPCR איתור של Genogroup לי, ו- II noroviruses, ו Coliphage MS 2 (לוח משלימה 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטחי עבודה נקיים, pipettes, צנטריפוגות עם פתרון טיהור RNase כדי להפחית את זיהום אפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר ריאגנטים RT-qPCR על הקרח. RNA להפשיר על הקרח (באזור / חדר נפרד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר תגובות ולהוסיף לפחות 10% יותר מהם (למשל, אם 10 תגובות נדרשות, לעשות תערובת אב 11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבים וורטקס תערובת אמן יחיד, למעט 25x האנזים RT-qPCR עבור 5 ים. בזהירות ומערבבים האנזים על ידי מצליף את הצינור עם האצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מאסטר צנטריפוגות רכיבים לערבב במשך 5 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת מאסטר לאיתור בזמן אמת RT-PCR של GI norovirus ו GII בהתאם להוראות ערכת ולהוסיף פריימרים oligonucleotide ספציפי norovirus ו בדיקות צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge (לוח משלים 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת מאסטר ידי pipetting 5-10 פעמים למעלה ולמטה (vortexing אינה מומלצת). Aliquot 22 μL של מיקס מאסטר היטב בכל צלחת 96-היטב בזמן אמת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA המדגם וורטקסבמשך 5 שניות, ולאסוף על ידי צנטריפוגה קצר (5 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 μL של המדגם RNA ו- GI ו שולטת חיובית GII לצלחת RT-qPCR (אחרי תבנית מתוך טבלה 2). להוסיף 3 μL של nuclease-Freewater בבארות ללא תבנית שליטה (NTC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת בזמן אמת עם סרט דבק אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות בצנטריפוגה הצלחת בזמן האמת ב -1,300 XG דקות 1 כדי להסיר בועות אוויר או טיפות נוזלות שעשויה להיות נוכח הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מכשיר בזמן אמת PCR ועל הגדרת התנאים thermocycling הבאים: 1) שלב RT במשך 10 דקות. ב 45 ° C (2) הפעלת פולימראז תקי, 10 דק &#39;. ב 95 מעלות צלזיוס ו (3) 45 מחזורים של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס ו -60 של ב 60 ° C. </li></ol> 7. כימות norovirus בדגימות ספוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התוצאות של בקרות חיוביות ושליליות כדי לאמת תוצאות RT-qPCR (לוח משלים 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אם כל עקומת סטנדרט עונה עלערכים מקובלים מתפרסמים בלוח משלים 2 ולחשב את סטיית ההתקן כוללת על העקומה הרגילה באמצעות משוואת 1. (משוואת 1)% יעילים = 100 x 10 (CT ממוצע ערכים-יירוט) / סלופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תוכנת Cycler תרמית PCR לא לחשב את השיפוע עבור כל עקומת סטנדרט, לקבוע מדרון R 2 ערכים על ידי רגרסיה באמצעות תוכנה נתונה (למשל Excel, SPSS, או SAS). בנוסף, לחשב את יעילות% עבור עקומות סטנדרטיות הבא אני המשוואה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר עותק RNA מחושב על ידי תוכנת Cycler תרמית עבור כל דגימות הבדיקה מבוססות על עקומות סטנדרטיות העונות על הקריטריונים מפורטים בטבלה משלימה 4. שידור חוזר כל דגימות עם כובע לא עקום סטנדרטי אינו עומד בקריטריונים או יש בקרות חיוביות שגויות. בדוק ערכי ה- CT של coliphage MS2, שהתווסף בקרה פנימית לפקח עיכוב PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המספר הכולל של p עותקי RNAמדגם ER ידי הכפלת מספר עותק RNA המחושב בשלב 7.2 ידי היחס בין נפח (25 עד 50 μL) של eluent RNA סך לזה של רנ&quot;א (3 עד 5 μL) המשמש התגובה RT-qPCR. לחלופין, לחשב את צפיפות RNA על ידי חלוקת מספר עותק RNA הכולל ידי שטח הפנים אובייקט (2 ס&quot;מ) ניתחו. </li></ol> 8. Genotyping של דוגמאות בזמן אמת RT-PCR חיובי על ידי חמי מקונן PCR קונבנציונאלי הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את הסיבוב הראשון של תערובת אמן עבור כל קבוצה פריימר של assay RT-PCR (לוחות משלים 2, ו -5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μL של RNA חיובי norovirus עד 20 μL של תמהיל מאסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את RT-PCR בתנאים הבאים: (1) שלב RT למשך 30 דקות ב 42 ° C (2) הפעיל פולימראז תקי, 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ו- (3) 40 מחזורים של 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס 30 s, ב 50 מעלות צלזיוס, ו -60 שניות על 72 מעלות צלזיוס. אחרי 40 מחזורים, דגירה 10 דקות נוספות ב 72 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">מכינים את הסיבוב השני של תמהיל מאטר עבור כל קבוצה פריימר של assay RT-PCR (לוחות משלים 2 ו -5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 23 μL תמהיל מאסטר ולהוסיף 2 μL של מוצרים בסיבוב הראשון RT-PCR (מ בסיבוב הראשון) על צינור אחד (רצוי המוצר בסיבוב הראשון צריך להיות מדולל 1/10 במים RNase ללא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 8.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל agarose 2% ב 100 מ&quot;ל 1x טריס-אצטט EDTA (40 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ חומצה אצטית, ו 1 mM EDTA, ב- pH 8.3). לאחר המסת agarose על ידי חימום תערובת במיקרוגל, להוסיף 10 μL של כתם חומצות גרעין לכל 100 מ&quot;ל של ג&#39;ל מוכן לאחר קירור התערובת ל- C 60-70 מעלות, יוצקים את הג&#39;ל והכנס את מסרקים. תנו ג&#39;ל להסתפק לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 15 μl של כל מוצר RT-PCR עם 3 μL של צבע טעינת 6x. טען 15 μL של כל דגימה electrophorese הג&#39;ל agarose ב -100 V עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היעד ובלו שבר RT-PCR בגודל מתאים (330 נ&quot;ב עבור GI ו -341 נ&quot;ב עבור GII) מן ג&#39;לd לטהר RNA באמצעות ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית. מוצר PCR מטוהר כעת ניתן להשתמש עבור רצף סנגר. </li></ol>

<ol>
	<li>Isakbaeva, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+transmission+on+cruise+ship.">Norovirus transmission on cruise ship.</a> Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).</li><li>Lopman, B. A., Gasta&#241;aduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinj&#233;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+transmission+of+norovirus+gastroenteritis.">Environmental transmission of norovirus gastroenteritis.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).</li><li>Malek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+norovirus+infection+among+river+rafters+associated+with+packaged+delicatessen+meat,+Grand+Canyon,+2005.">Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005.</a> Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).</li><li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+shedding+after+experimental+human+infection.">Norwalk virus shedding after experimental human infection.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).</li><li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+gastroenteritis.">Norovirus gastroenteritis.</a> N. Engl. J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li><li>Park, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+New+Environmental+Sampling+Protocol+for+Detection+of+Human+Norovirus+on+Inanimate+Surfaces.">Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).</li><li>Barker, J., Jones, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+spread+of+infection+caused+by+aerosol+contamination+of+surfaces+after+flushing+a+domestic+toilet.">The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet.</a> J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).</li><li>Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolization+of+a+Human+Norovirus+Surrogate,+Bacteriophage+MS2,+during+Simulated+Vomiting.">Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting.</a> PloS one. 10, 0134277 (2015).</li><li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+50%+human+infectious+dose+for+Norwalk+virus.">Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus.</a> J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).</li><li>Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+introduction+routes+into+nursing+homes+and+risk+factors+for+spread:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies.">Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centers+for+Disease+Control+Prevention.+Norovirus+outbreak+in+an+elementary+school--District+of+Columbia,+February+2007.">Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).</li><li>Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+prolonged+environmental+survival+of+small+round+structured+viruses.">Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses.</a> J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).</li><li>Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+surface+sampling+methods+for+virus+recovery+from+fomites.">Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).</li><li>Taku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+detection+of+caliciviruses+from+food+contact+surfaces.">Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces.</a> J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).</li><li>Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+swab+sampling+method+for+the+detection+of+norovirus+and+rotavirus+on+artifically+contaminated+food+and+environmental+surfaces.">Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces.</a> Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).</li><li>Herzog, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+recovery+efficiency+for+bacteriophage+P22+on+fomites.">Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).</li><li>Vega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaliciNet:+A+Novel+Surveillance+Network+for+Norovirus+Gastroenteritis+Outbreaks+in+the+United+States.">CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).</li><li>Rolfe, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internally+controlled,+one-step,+real-time+RT-PCR+assay+for+norovirus+detection+and+genogrouping.">An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping.</a> J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).</li><li>Kittigul, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+GII-4+2006b+variant+circulating+in+patients+with+acute+Thailand+during+a+2006-2007+study.">Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study.</a> J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).</li><li>Teunis, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus:+how+infectious+is+it.">Norwalk virus: how infectious is it.</a> J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).</li><li>Wollants, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+norovirus+sampling+method+using+sodium+dodecyl+sulfate/EDTA-pretreated+chromatography+paper+strips.">Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips.</a> J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).</li><li>Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Surface+Sampling+and+Recovery+of+Viruses+and+Non-Spore+Forming+Bacteria+on+a+QMRA+Model+for+Fomites.">The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+of+food+and+animal+feed-Horizontal+method+for+determination+of+hepatitis+A+virus+and+norovirus+in+food+using+real-time+RT-PCR.">Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR.</a> International Organization for Standardization (ISO). , (2013).</li><li>Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+to+defining+"high-touch"+surfaces+in+hospitals.">A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).</li><li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+norovirus+outbreak+at+a+long-term-care+facility:+the+role+of+environmental+surface+contamination.">A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).</li><li>Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+recovery+of+viruses+from+water:+a+comprehensive+review.">Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review.</a> Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).</li><li>Gallimore, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+monitoring+for+gastroenteric+viruses+in+a+pediatric+primary+immunodeficiency+unit.">Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).</li><li>Ganime, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+human+adenoviruses+and+rotavirus+species+A+on+fomites+of+hospital+pediatric+units.">Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units.</a> Am J Infect Control. , (2016).</li><li>Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+contamination+of+aerosol+and+surfaces+through+toilet+use+in+health+care+and+other+settings.">Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings.</a> Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).</li></ol>

Authors have no conflicting interest. The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the official position of the Centers for Disease Control and Prevention.

יש noroviruses מנת זיהומיות אדם 50% בין 18 ו -10 חלקיקי 3 וירוס 20. לכן, גם זיהום ברמה נמוכה של משטחים עלול להוות סיכון לבריאות הציבור. כמה היבטים של פרוטוקול הדגימה הספוגית הוערכו כולל: 1) חומרי ספוגית שונה, 2) מטליות תנאי אחסון במהלך הובלה, 3) ריכוז הנגיפי RNA, ו -4) c...

<html> Noroviruses אדם הם גורם מוביל של מגיפת גסטרואנטריטיס החריפה ספורדית 1 בעולם, 2, 3. הווירוס הוא מאוד מדבק עוברים מאדם לאדם באמצעות אדם ישיר אינטראקצית אדם או בעקיפין באמצעות מגע עם מזון מזוהם, מים או משטחים סביבתיים. Noroviruses ניתן לשפוך לפארקים וממושכת הישרדות של הנגיף על משטחים סביבתיים תועדה 1, 2, 3. במהלך שפיכת שיא, מיליארדים של חלקיקי נגיף משתחררים לגרם של צואה, וקיא מכיל גם מספר מספיק של חלקיקים נגיפיים כדי לגרום לזיהום 4, 5, 6, 7, 8,EF &quot;&gt; 9, 10. בנוסף, העברת הנגיף בין משטחים דוממים עור אנושי יכולה להתרחש 2 בקלות, 11, 12. לפיכך, ניטור של זיהום סביבתי עשוי לסייע בחקירה פרוצה ו בהערכת היעילות של למעלה נקי נהלי חיטוי. מספר פרוטוקולי דגימה סביבתיים תוארו לצורך זיהוי של רוטה-וירוס, coliphage MS2, calicivirus חתולים (FCV), ואת בקטריופאג P22 13, 14, 15, 16. עם זאת, תנאי האימות תארו במחקרים אלה, לרבות התייבשות מהירה (&lt;1 שעה) ואת שטח פנים קטן (25 x 100 סנטימטרים 2), לא יכולים לייצג הגדרות שדות כראוי. בנוסף, צפוי זיהום ברמות נמוכות של סביבתימשטחי nmental דורשים פרוטוקולים מסוגלים לזהות חלקיקי נגיף מעט מאוד. פתחנו שיטת דגימת משטח מבוסס macrofoam לאיתור וההקלדה של norovirus. שיטה זו תאומת במהלך פרצתי מספר פעמים norovirus. הפרוטוקול כולל 1) איך לאסוף דגימות ספוגית ממשטחים הסביבה (2) מהי הדרך הטובה ביותר כדי לשמור על שלמות של דגימות במהלך איסוף ומשלוח למעבדה, ו -3) בדיקות מעבדה והקלדה של norovirus.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Generic name for kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Macrofoam swab&lt;/strong&gt;</td><td>Premoistened EnviroMax Swab kit&amp;nbsp;</td><td>Puritan</td><td>2588060PFUW</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA Lysis buffer&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>CDC UNEX buffer</td><td>Microbiologics</td><td>Cat No MR0501</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA extraction spin column&lt;/strong&gt;</td><td>Midi column</td><td>Omega Biotek</td><td>Cat No R6664-02</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA purification spin column&lt;/strong&gt;</td><td>Zymol RNA Clean and Concentrator kit&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>Cat No R1016</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Real time RT-PCR kit&lt;/strong&gt;</td><td>AgPath kit One-Step RT-PCR Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Cat No 4387391</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Conventional RT-PCR kit&lt;/strong&gt;</td><td>Qiagen one step RT-PCR kit</td><td>Qiagen kit</td><td>Cat No 210212</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Gel extraction kit&lt;/strong&gt;</td><td>Qiagen QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen kit</td><td>Cat No 28704 or 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Cat No 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>RNA run-off transcripts</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Realtime PCR platform</td><td>Applied Biosystems</td><td>Model ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>Optical 96-well reaction plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4316813</td></tr><tr><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp;amp;showAddButton=true&amp;amp;productID=4306311&amp;amp;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx%0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D&amp;amp;returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*&quot;&gt;MicroAmp Clear Adhesive Film&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4306311</td></tr></tbody></table>

swab sampling method for the detection of human norovirus on surfaces

noroviruses אדם הם גורם מוביל של מגיפת גסטרואנטריטיס ספורדי ברחבי העולם. מכיוון שרוב הזיהומים או מופצים ישירות דרך המסלול של אדם אל אדם או בעקיפין באמצעות משטחים סביבתיים או מזון, fomites מזוהם ומשטחים דוממים הם כלים חשובים עבור התפשטות הנגיף במהלך התפרצויות norovirus. פיתחנו ומוערכת פרוטוקול באמצעות מטליות macrofoam לאיתור והקלדה של noroviruses האדם מן משטחים קשים. בהשוואה מטליות שקצהו סיבים או מגבונים אנטי-סטטי, מטליות macrofoam לאפשר התאוששות וירוס (טווח 1.2-33.6%) ממשטחים מושב האסלה של עד 700 ס&quot;מ 2. הפרוטוקול כולל שלבים עבור החילוץ של הנגיף מן המטליות וריכוז נוסף של רנ&quot;א הנגיפי באמצעות עמודות ספין. בסך הכל, 127 (58.5%) של 217 דגימות ספוגיות שנאספו ממשטחים באוניות שיוט ומתקני סיעודים שבו גסטרואנטריטיס norovirus היהדיווח נדבקה norovirus GII ידי RT-qPCR. 29 אלה (22.8%) ניתן genotyped בהצלחה. לסיכום, איתור של norovirus על משטחים סביבתיים באמצעות הפרוטוקול שפתחנו עשויה לסייע בקביעת רמת הזיהום סביבתי במהלך התפרצויות, כמו גם זיהוי של וירוס כאשר דגימות קליניות אינן זמינות; היא עשויה גם להקל על ניטור של יעילות של אסטרטגיות משיקום.

איור 1 מציג תרשים זרימה של פרוטוקול הדגימה הספוגית. פרוטוקול זה מכיל ארבעה שלבים עיקריים; 1) אוסף מדגם, 2) מדגם אחסנה והובלה 3) טיהור רנ&quot;א נגיפי וריכוז ו -4) RT-qPCR assay ו גנוטיפ. <img alt="איור 1" src...

Watch this Scientific Journal Video about Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces at JoVE.com

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

swab-sampling-method-for-the-detection-of-human-norovirus-on-surfaces

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K Views.  Centers for Disease Control and Prevention. A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces. 

Video: Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Environment

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

אצבע מקל דגימה דם מתודולוגיה לקביעת אפופטוזיס-תרגיל המושרה הלימפוציטים

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of hospitalizations in children with a public health impact similar to that of Rotavirus. NoVs are RNA viruses of great genetic diversity and there is a continuous appearance of new strains. Five genogroups are recognized; GI and GII with their many genotypes and subtypes being the most important for human infection. However, the diagnosis of these two genotypes remains problematic, delaying diagnosis and treatment. 1, 2, 3
For RNA extraction from stool specimens the most commonly used method is the QIAmp Viral RNA commercial kit from Qiagen. This method combines the binding properties of a silica gel membrane, buffers that control RNases and provide optimum binding of the RNA to the column together with the speed of microspin. This method is simple, fast and reliable and is carried out in a few steps that are detailed in the description provided by the manufacturer. 
 Norovirus is second only to rotavirus as the most common cause of diarrhea. Norovirus diagnosis should be available in all studies on pathogenesis of diarrhea as well as in outbreaks or individual diarrhea cases. At present however norovirus diagnosis is restricted to only a few centers due to the lack of simple methods of diagnosis. This delays diagnosis and treatment 1, 2, 3. In addition, due to costs and regulated transportation of corrosive buffers within and between countries use of these manufactured kits poses logistical problems. As a result, in this protocol we describe an alternative, economic, in-house method which is based on the original Boom et al. method4 which uses the nucleic acid binding properties of silica particles together with the anti-nuclease properties of guanidinium thiocyanate.
For the detection and genogrouping (GI and GII) of NoVs isolates from stool specimens, several RT-PCR protocols utilizing different targets have been developed. The consensus is that an RT-PCR using TaqMan chemistry would be the best molecular technique for diagnosis, because it combines high sensitivity, specificity and reproducibility with high throughput and ease of use. Here we describe an assay targeting the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region; the most conserved region of the NoV genome and hence most suitable for diagnosis. For further genetic analysis a conventional RT-PCR that targets the highly variable N-terminal-shell from the major protein of the capsid (Region C) using primers originally described by Kojima et al. 5 is detailed. Sequencing of the PCR product from the conventional PCR enables the differentiation of genotypes belonging to the GI and GII genogroups.

A One-Step RT-PCR assay for detection and genogroup identification of Norovirus isolates from children&#x2019;s stools, that utilizes primers and TaqMan probes specific to the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region, the most conserved region of the Norovirus genome is described. A non-commercial, cost-effective RNA extraction method is detailed.

איתור Genogrouping של Noroviruses מ שרפרפים לילדים עד Taqman צעד אחד RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Medicine

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Biology

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

After preparing the reagents, antibodies, and bacteria as described in the manuscript, assemble all the materials in a BSL II biosafety cabinet.
Virus-like particles for human norovirus are listed as BSL II pathogens, and all work performed using VLPs should be conducted in a certified biosafety cabinet.
Add 10 micrograms of human norovirus VLPs to each tube of bacteria, and mix thoroughly by pipetting. Incubate the tubes for 1 hour at 37 degrees Celsius with constant rotation. After incubation, centrifuge the tubes at 10,000 times g for 5 minutes.
Aspirate and discard the supernatant and resuspend the bacterial pellet in 1 milliliter of PBS. After repeating the wash steps once, centrifuge the tubes again at 10,000 times g for 5 minutes. Discard the supernatant and resuspend the VLP bacteria pellet in 150 microliters of 5% blocking buffer.
A common error that occurs is that tubes are swapped and the wrong treatment is added. To prevent this, arrange all tubes in lines that correspond to the correct treatment, and add one treatment all at once to the tubes.
For each bacterial sample, prepare 50 microliters of diluted human norovirus G2 antibody. Using 5% blocking buffer, dilute the antibody 1 to 125 for E. coli case samples. Prepare 50 microliters of diluted isotype antibody for each bacterial sample using the same dilution ratios. Divide each attachment assay sample into 350-microliter aliquots by transferring them into clean 1.5-milliliter centrifuge tubes.
To create unstained controls, add 50 microliters of blocking buffer to the first aliquot from each bacterial sample. For the stained samples, add 50 microliters of the G2 antibody dilution to the second set of aliquots. Create the isotype controls by adding 50 microliters of the diluted isotype antibody to the third set of aliquots.
Incubate all the samples on ice and in the dark for 30 minutes. Then, centrifuge all the samples at 10,000 times g for 5 minutes. Discard the supernatants and resuspend each sample in 150 microliters of FCSB. Again, centrifuge all the samples at 10,000 times g for 5 minutes. Again, discard the supernatants and resuspend the samples in 100 microliters of FCSB.
After centrifuging the samples one final time and discarding the supernatant, resuspend the samples in 150 microliters of FCSB. Transfer each sample to a tube containing 400 microliters of FCSB for a total volume of 550 microliters. Store the samples at 4 degrees Celsius until they are analyzed by flow cytometry.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video