The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

הערה: אזור עיין חומרים משלימים S1 עבור רשימה של הגדרות. נהלי QA קשורים שיטת USEPA 1615 מתוארי S2 הסעיף והחומרים משלימים. 1. מסנן Elution נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elution ראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 500 מ&quot;ל של תמצית בשר בקר 1.5% שנאגרו, pH 9.0, חימם לטמפרטורת החדר בתוך גליל סיימה. פתח את דיור המחסנית המסננת ולהוסיף כמות מספקת של תמצית בשר בקר כדי לכסות את מסנן electropositive לחלוטין. החזר את מכסה בית המסנן ויוצקים את תמצית בשר הנותרים לתוך מבחנה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות של זמן מגע, להעביר את פתרון תמצית בשר הדיור יחד עם זה שנותר בכוס סטרילית לאט דרך המסנן באמצעות מיכל לחץ או משאבת peristaltic. אסוף את eluate לתוך כוס זכוכית 2 ליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> elution שנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1 באמצעות 500 מיליליטר נוסף של תמצית בשר בקר 1.5% שנאגרו, אך להגדיל את זמן הקשר אצל שלב 1.1.2 עד 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תמצית בשר מן elution השני אל מבחנה 2 L המכילים כי מן elution הראשון. הוספת בר ומערבבים סטרילי אל מבחנה. </li></ol></li></ol> נוהל ריכוז 2. אורגני הפתתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר אלקטרודת שילוב מסוג עם תת-כלורי נתרן 0.525% עבור 5 דקות לפחות. יש לשטוף את האלקטרודה עם O סטרילי DH 2 ולאחר מכן טהר עם נתרן תיוסולפט 0.05 מ &#39;. כייל את מד pH באמצעות pH 4 ו -7 סטנדרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכוס המכילה את eluate בצלחת ומערבבים. הפעל את הצלחת להגדיל את מהירות ערבוב עד נוצרת מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של eluate ל -3.5 ± 0.1 לאט על ידי תוספת חכמה ירידה של 1.2 M HCl אל eluate. מוסיפים את HCl טיפה חכם כי בנוסף מהירה יהיה להשבית וירוס. במהלך תקופה זו eluate תהפוך מעוננת בתור משקע מתחיל להיוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את SPE ערבובed כדי לרגש איטי ולאחר מכן להמשיך לפקח ולשמור את ה- pH של eluate 3.5 ± 0.1 בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את ההשעיה תמצית בשר זירז לתוך בקבוקים צנטריפוגות אחד או יותר ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 2500 XG ב 4 ° C.. הסר את בקבוקי מתוך צנטריפוגה ואו לשאוב או לאט למזוג supernatant כדי למנוע אובדן של המשקע pelleted. בטל supernatant. הערה: לא יכול להיות הבדלים ניכרים בין המון תמצית בשר בכמות והאיכות של המשקע. המשקע המופק המון כמה יתמוסס במהירות תוך כי מתוך המון אחרים מתמוסס בקושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 מ&quot;ל של 0.15 M פוספט נתרן אל בקבוק צנטריפוגות המכיל את המשקע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 0.15 M פוספט נתרן, pH 9.0 עבור משקעים מתוך המון תמצית בשר הנמסים תוך 5 דקות. מערבבים במשך 10 דקות לאחר המשקע נמס לגמרי, ואז ללכת מיד לשלב 2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 0.15 M פוספט נתרן, pH 7.0-7.5 לכל משקעים אחרים. מערבבים במשך 10-15 דקות עד להמסה, או משקעים קשים יותר, לשבור אותם עם מרית סטרילי, על ידי ציור הפתרון שוב ושוב מעלה ומטה במהלך ערבוב עם טפטפת, ידי רועדת המשקע ב 160 סל&quot;ד על שייקר מסלולית, או על ידי שילוב של נהלים אלה. הערה: בעת שימוש ביותר מהתקן בקבוק צנטריפוגות אחד, לשלב את משקעים באמצעות פחות מ -30 מ&quot;ל של פוספט נתרן ולאחר מכן להשתמש בחלק הנותר של 30 מ&quot;ל לשטוף את הבקבוקים לאחר שילוב של משקעים לתוך בקבוק אחד או כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המשקע המשולב בתוך בקבוק צנטריפוגות תחתית שטוחה, מוסיפים בר ומערבבים אל הבקבוק. עבור לשלב 2.6.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המשקע המשולב בתוך בקבוק צנטריפוגות עם תחתית חרוטים, ולהעביר אותו לתוך כוס זכוכית קטנה ולהוסיף בר ומערבב עד המבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הבקבוק או כוס על גבי בוחש מגנטי, ומערבבים עד precipitate נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לעקר אלקטרודת סוג בשילוב עם תת-כלורי נתרן 0.525% ו טהר עם 0.05 מ &#39;נתרן thiosulfate כמתואר שלב 2.1. כייל את מד pH באמצעות pH 7 ו -10 תקנים. לאט ולהתאים את ה- pH של המשקע נמס לגמרי ל -9.0 עם 1 M NaOH ואז ומערבבים במשך 10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בר ומערבבים צנטריפוגות המשקע מומס במשך 10 דקות ב 4,000-10,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים בזהירות את supernatant לתוך כוס זכוכית מבלי להפריע גלולה. הוספת בר ומערבבים עד כוס וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכוס על גבי בוחש מגנטי, ומערבבים הפתרון. להוסיף 1.2 M HCl טיפה חכם להתאים את ה- pH ל 7.0-7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר את supernatant על ידי מעבר דרך מסנן לסטריליזציה המכיל prefilter כי כבר pretreated עם 15 מ&quot;ל של תמצית בשר בקר 1.5%, 0.05 מ &#39;גליצין, pH 7.0-7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Volum לדוגמא Assayחישובי דואר (S): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משוואת 1 לחשב S עבור כל דגימות הבדיקה, אלא המבוצר המעבדה בלנק מגיב המעבדה בלנק, <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> משוואה 1 כאשר D (היקף מדגם מים המקורי assayed) הוא 500 L עבור מי תהום, TSV (נפח דגימה סה&quot;כ) הוא הנפח של מדגם השדה עבר דרך מסנן מחסנית 5 האינץ electropositive שקבל במעבדה, FCSV (סופי מרוכז לדוגמא Volume) נפח לאחר סינון בשלב 2.10. דוגמה מוצגת S4.1 סעיף וחומרים משלימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב S עבור המעבדת המבוצרת בלנק (LFB; כלומר, בקרת איכות חיובית באמצעות מי כיתה מגיב זרע) ואת מגיב המעבדה בלנק (LRB; כלומר, בקרת איכות שלילית באמצעות מים מגיבים בכיתה) על ידי הכפלת FCSV ב -0.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את FCSV לתוך thresubsamples דואר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן subsamples 1 ו -2 עם נפח שווה 1.04 פעמים את נפח דגימת Assay. להקפיא subsamples אלה בבית או מתחת -70 ° C אם הם לא ניתן לנתח באמצעות assay הווירוס culturable הכולל (subsample 1, השלב 4) או מעובדי המבחנים המולקולריים (מוצג לא) בתוך 24 שעות; אחרת, להחזיק ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את נפח הנותרים (subsample 3) או מתחת -70 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח הבידוד על ידי חלוקת S ב -10. </li></ol> 3. וירוס סה&quot;כ culturable Assay quantal הערה: כל השלבים תמיד להוסיף פתרונות בזהירות כדי להימנע משיבוש monolayer התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג או מדיה לשאוב מכלי בדיקה המכילים בשכבה של תאי BGM בבית הפיצול 3-6 ימים לאחר ולאחר מכן להוסיף נפח של תמיסת מלח מאוזנת שווה תקשורת סיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג או לשאוב את פתרון המלח המאוזן מן te תרבית תאיםכלי רח בשימוש ואז לחסן את כלי בדיקת תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 כלי בדיקה עבור כל מדגם בדיקה עם נפח של subsample 1 שווה לנפח הבידוד יחד עם בקרות assay quantal הכוללות culturable הווירוס (S2.4 בסעיף חומרים משלימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור LFB ואת מטריקס מדגם מחוזק מעבדה (LFSM; כלומר, מדגם מטריקס מים זורע), להכין 5, 25, ו 125 דילולים באמצעות subsample 3 ו 0.15 M פוספט נתרן, pH 7.0-7.5 כמו diluent. דוגמה של הליך להכנת דילולים ניתנת S3 סעיף וחומרים משלימים. לחסן 10 כלי בדיקת תרבית תאי שטף לכל סדרת דילול באמצעות נפח בידוד על כל כלי בדיקה בנוסף הכלי מחוסן עם subsample חי 1 בשלב 3.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל מדגם בדיקה משלב 3.2.1 (חוץ מאלה מחוסנים בשלב 3.2.2) כי יש CPE בכל 10 המשכפל לאחר 14 ימי הדגירה (ראה שלב 3.3) קדםלקלף 5, 25, ו 125, ו 625-לקפל דילולים של subsample 3. לחסן 10 שטף כלי בדיקת תרבית תאים לכל סדרת דילול באמצעות נפח בידוד על כל כלי בדיקה יחד עם קבוצה חדשה של quantal הווירוס culturable הכולל שולט assay (S2.4 בסעיף חומרים משלימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ את הבידוד מעל פני השטח של monolayers התא על ידי הטיית הכלי הלוך ושוב. דגירת כלי הבדיקה בטמפרטורת חדר למשך דקות 80-120 על פלטפורמת נדנדה מכאנית ב 1-5 תנודות / min או עם הנדנדה של הכלי כל 15-20 דקות, כדי לאפשר לכל וירוס נוכחי כדי לספוג לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני תחזוקת prewarmed, ולאחר מכן דגירת כלי הבדיקה ב- C ° 36.5 ± 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש את המראה של CPE בכל כלי בדיקה באמצעות מיקרוסקופ כל יום במשך 3 ד הראשון ולאחר מכן לבחון אותם כל 2-3 ימים עד העברת יום 14. כל כלי בדיקה המראים ≥75% CPE במקפיא נקבע אומתחת -70 ° C. להקפיא את כל התרבויות הנותרים ואת שולטת assay quantal הכולל culturable וירוס או מתחת -70 ° C לאחר בחינת כלי ביום האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את כל התרבויות ולסנן ≥15% של המדיום מכל כלי הבדיקה CPE חיובי דרך פילטר עיקור 0.2 מיקרומטר. אם הנפח המוגדר ולא ניתן להעברה דרך המסנן עקב סתימה, צנטריפוגה בינוני למשך 10 דקות ב 1,500-18,000 XG ו -4 ° C לפני הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע קטע שני של כל כלי הבדיקה מעבר -1 באמצעות כלי בדיקת BGM שטף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את כלי בדיקה החדשים עם נפח חיסון מייצג 10% של המדיום המופשר מכל כלי הבדיקה השליליים מהמדיום המסונן מכלי חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.2.4-3.4.3, אך להקפיא את כל כלי בדיקה היה שלילי ב -1 מעבר רח וחיובי על 2 nd כמתואר שלב 3.3. בצע גבה 3 rdגיל כמתואר למעבר 2 nd באמצעות הפקדים assay ו בתרביות תאים שלילי רק כי היו שליליות במהלך 1 חלוף רח וחיובי במעבר 2 nd. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי כלי בדיקה אישית כמו וירוס חיובי כאשר הם מראים CPE הוא -1 ו -2 קטעי nd או, במקרה שבו CPE אינו מתרחש עד חלוף 2 nd, הוא 2 nd ו -3 הקטעים rd. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש במחשבון המספר הסביר ביותר של USEPA עם הגדרות תכנית ברירת המחדל להגדיר כפי שמוצג בטבלה S2 לחשב את titers הווירוס של כל דגימות הבדיקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את מספר כלי הבדיקה לשכפל חיובית וירוס משלב 3.6 עבור כל מדגם הבדיקה לתוך המחשבון כדי לקבוע את ערך MPN / מ&quot;ל (M מ&quot;ל) ואת העליונות (CL UML) ונמוך (CL LML) 95% גבולות הסמך / ערכים מ&quot;ל . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Obtain ערך MPN / L (L M) של מדגם הבדיקה התואם באמצעות 2 משוואה. <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> משוואה 2 M מ&quot;ל הוא הערך MPN / ml בשלב 3.7, S הוא נפח דגימה Assay, ו- D הוא נפח של דגימת מים מקורי assayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את גבול / L אמון העליון על ידי החלפת ערך CL UML עבור הערך M מ&quot;ל. חשב את L / גבול ביטחון נמוך על ידי החלפת ערך CL LML עבור הערך M מ&quot;ל. חישוב דוגמא מוצג S4.2 סעיף וחומרים משלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דווח M מ&quot;ל ערכים של 0 כמו ≤ 1 / D. לדוגמה, ≤ 0.002 MPN / L (≤ 1/500 L) עבור דגימות מי התהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבת את ערכי גבול ביטחון MPN ו -95% עבור כל מעבדה מחוזקת בלנק המעבדה Reהסוכן בלנק ידי הכפלת המ&quot;ל / הערכים הראשונים שהושג במחשבון ידי S ולאחר מכן חלוקת התוצאה ב -0.3. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells.">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li><li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters.">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li><li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico.">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li><li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming,+2001.">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li><li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+gastroenteritis.">Norovirus gastroenteritis.</a> N.Engl.J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li><li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+surveillance--United+States.">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li><li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+infections:+diagnosis+and+treatment.">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li><li>Abzug, M. J., Finn, A., Pollard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteroviruses:+an+emerging+infectious+disease?+The+real,+the+speculative+and+the+really+speculative.">The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative.</a> Hot Topics in Infection and Immunity in Children. , (2008).</li><li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths+from+norovirus+among+the+elderly,+England+and+Wales.">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li><li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan.">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li><li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+murine+norovirus,+feline+calicivirus,+poliovirus,+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater.">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li><li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water.">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li><li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus,+Coxsackievirus,+Echovirus,+and+Murine+Norovirus.">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li><li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment.">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPA/600/R-95/178.">EPA/600/R-95/178.</a> ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water.">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Parts+141+and+142+Revisions+to+the+Unregulated+Contaminant+Monitoring+Regulation+(UCMR3)+for+Public+Water+Systems+Final+Rule.">40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule.</a> Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Part+141+National+Primary+Drinking+Water+Regulations:+Monitoring+Requirements+for+Public+Drinking+Water+Supplies;+Final+Rule.">40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule.</a> Federal Register. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li><li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J., McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+occurrence+and+health+risks+in+drinking+water+.">Virus occurrence and health risks in drinking water .</a> Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).</li><li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).</li><li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters.">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li><li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee,+wisconsin,+collected+august+1994.">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li><li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water.">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples:+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies.">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

USEPA שיטת 1615 פותחה לשימוש במהלך מחזור הניטור השלישי של תקנת הניטור המזהמת ללא פיקוח (UCMR3) 17 ו מיועדת בעיקר למדידת התרחשות וירוס במי תהום. היא חולקת מספר צעדים משותפים עם כלל איסוף מידע (ICR) השיטה, 15,18 אבל יש שני הבדלים קלים. שניהם להשתמש מבחני quantal למדוד וירוס מייצרי CPE על משטחי תא BGM עם quantitation בהיותה מבוססת על חישובים רוב מספר Probable (MPN). השיטה 1615 מאפשרת השימוש במסנן electropositive חדש לריכוז מוירוס מטריצות מים שונים מפחיתה את מספר כלי בדיקת תרבית תאים משכפל לכל דילול מ -20 עד 10. שניהם שינויים קלים להפחית עלויות שיטה כוללות. הירידה במספר משכפל מפחית עבודה, אבל התוצאה היא גבול הגילוי נמוך במקצת. למרות groundwaters צפוי להיות בעלי ריכוזים נמוכים של וירוסים מאשר מים עיליים, 19,20 הכמות מדגם E assayed גבוה פי חמישה מריכוז של מים עיליים, פיצוי בין השאר על ההבדלים. השימוש משכפל יהיה פחות נאות עבור המים העיליים ביותר, אבל כמה ידרשו דילול מדגם. יש שיטה 1615 מספר צעדים ומגבלות קריטיים. תמציות בשר להשתנות ממגרש למגרש. כל הרבה צריך ייבדקו אפקטיבי של elution הווירוס ואת יכולת ריכוז וירוס לאורך שלבי ריכוז משני כמתואר הוא S2.3 סעיף וחומרים משלימים. השיטה משתמשת בנוסחאות מדויקות לחישוב כמות מדגם לחסן על תרביות תאים BGM ולקבוע titers וירוס. תוצאות לא מדויקות תופקנה אם נוסחות אלה אינן אחריו בקפדנות. טכניקת aseptic פרופר חייבת לשמש לשמירה על תרביות תאים. שולט נגוע תרבית תאי BGM המראים מצוקה במהלך תקופת דגירת 14 היום להצביע על בעיות סבירות עם תחזוקת תרבית תאים. בזהירות רבה גם חייבת להיות taקן במהלך pipetting השלבים הכרוכים עם חיסון של והוספת בינוני עד צלוחיות תרבית תאים, כדי למנוע זיהום צולב. פקדי האיכות המתוארים S2 סעיף חומרי משלים חייבים להיות מלווה בקפדנות. סעיף S2 גם מספק ייעוץ לפתרון בעיות איכות. המנגנון העיקרי של ספיחת נגיף electropositive מסנן אינטראקצית תשלום הקשורים לחוזק של המטען החיובי על המסנן ואת הכח של המטען השלילי &quot;הווירוס הקשורים חודה איזואלקטרית ואת ה- pH של המים נבדקים 21. Elution ממסנני מושפע גם את עוצמת האינטראקציות הללו. כי הם משתנים בין סוגי וירוס ואפילו בין זנים בתוך אותו הסוג, elution מהמסננים אינו אחיד. משמעות הדבר היא כי כל תוצאה שעלולה להמעיט בהערכת רמת בפועל של וירוס נוכחי במי סביבה. השימוש של הקו הסלולרי BGM היחיד גם מזלזל התרחשות וירוס. הטווחשל וירוס מעיים שיכולים לייצר CPE בתור תא זה בעיקר מוגבל polioviruses ו קפסיד מינים enterovirus B, כמו גם כמה reoviruses 14,15,22. סוגי וירוס מדבק אחרים לא יזוהו. החלמת poliovirus ממי קרקע כיתה המגיבה עמדה בקריטריונים לקבלת ביצועי USEPA שיטת 1615 הן הערכת הביצועים (PE; כלומר, דגימות מי כיתה מגיבה זורעת עם טיטר הידוע אנליסט המשמשים כדי להעריך את הביצועים של המטפל לפני התחילה מחקר) ודגימות LFB (S1 טבלת חומרים משלימים). התאוששות 58% ממי תהום באמצעות הליך התרבות דומה לזו שדווחה על ידי אחר באמצעות ברז מים 23,24. ההתאוששות הממוצעת מתחיילת דגימות LFB של 111% עם מקדם שונה (CV) של 100% גם פגשה את הקריטריונים לקבלת ביצועי שיטה למרות שהם גבוהים מזה שנצפה עבור דגימות PE during ICR. ICR מתכוון התאוששות מעבדתיות הייתה 56% עם מקדם השונה (CV) של 92% תוך החלמת intralaboratory ממוצע נעה בין 36 ל -85% (קו&quot;ח 58 כדי 131%; נתונים שלא פורסמו ממסד נתוני PE ICR). החלמה גבוהה נצפתה במחקר זה עבור דגימות נמוכות זרע LFB מאשר דגימות זרע גבוהות יותר (122 לעומת 42%). בזמנו כי ICR היה מתוכנן, זה היה צפוי כי דגימות PE קבלת ערכי זרע נמוכים תצטרכנה התאוששות נמוכה כי מקבלי זרעים גבוהים. דומה לזה שנצפה כאן עבור דגימות LFB, התאוששות poliovirus עבור דגימות PE ICR היו 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), ו -44% (CV 71%) עבור ערכים זרע ≤300 MPN, 300 1,500 MPN, ו&gt; 1,500 MPN, בהתאמה. ישנן שיטות רבות למדידת וירוס מדבק בדגימות מי 25. שיטה זו היא משמעותית ביחס לשיטות אחרות במידת סטנדרטיזציה. הסטנדרטיזציה לא רק כוללת בקרות איכות וביצועים,אלא גם משתמש כרכים ונוסחות מוגדרים על מנת להבטיח כי כל מעבדות האנליטיות לבצע את השיטה זהה. ללא סטנדרטיזציה, קשה להשוות את התוצאות על פני מעבדות, ולכן תקינה חיונית בעת ביצוע מחקרים רחבי היקף מעבדות אנליטיות מרובות. עם סטנדרטיזציה מובנית בשיטה זו ניתן להרחיב בעתיד לכלול סוגי וירוס נוספים שורות תאים. מחקר מתנהל כדי לספק נתונים עבור הכללת אדנו לתוך השיטה.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

וירוסים מעיים הם קבוצה מגוונת של וירוסים המדביקים מערכת העיכול האנושית ואשר מועברים באמצעות מחזור צואה-פה. וירוסים אלה להיכנס למים משטח הקרקע באמצעות מכון טיהור שפכים וקולחין בור ספיגה, בורות שופכין תוכנן או שבורה כהלכה, קווי ביוב שבורים, גלישות הביוב בשילוב, ומקורות נקודת והלא נקודה אחרת 1-4. זיהומים ומחלות אדם מפני וירוסי waterborne להתרחש באמצעות צריכת מים מזוהמים או לחטא כראוי או באמצעות מגע מים ופנאי. תסמיני המחלה עשויה להיות כרוכה קלה עד גסטרואנטריטיס חמור; דַלֶקֶת הַלַחמִית; קַדַחַת; מצוקת נשימת עליונות; מחלת הפה, הידיים והרגליים; דַלֶקֶת שְׁרִיר הַלֵב; דלקת קרום המוח; דַלֶקֶת הַמוֹחַ; שיתוק; אלח דם 5-8, ומוות 9,10. USEPA שיטה 1615 מספקת הליך למדוד חלקיקי נגיף מעיים זיהומיות במי סביבה ושתייה. מים אלה יכולים להכילתערובת של virions זיהומיות שאינם מדבק, אלא רק את חלקיקי זיהומיות להוות סיכון בריאותי פוטנציאלי. חלקיקי הנגיף מדבק לאבד infectivity לאורך זמן במים הסביבה ושתייה מאיבוד שלמות קפסיד חלבון, נזק חומצות גרעין בשל קרינת UV מפני השמש, ונזק עקב כל חומרי חיטוי שעשויים להיות נוכחים 11-13. הליך הווירוס culturable הכולל שנקבע השיטה מבוסס על הייצור של תופעות cytopathic (CPE) בכליות הקוף באפלו גרין (BGM) שורת התאים. שורת תא זו נבחרה בגלל השימוש הנרחב שלה בתחום וירולוגיה הסביבתי 14,15, למרות מגוון סוגי וירוס מדבקים שיאותרו מוגבלים בעיקר enteroviruses מסוים 15. מטרת מאמר זה היא לתאר לנהלי שיטת 1615 עבור elution של מסנני מחסנית electropositive חמש אינץ &#39;, ריכוז משני, ומדידה של וירוסי culturable הכולל. הערכה שלשיטה הכוללת מתוארת Cashdollar et al. 16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:149px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Beef extract, desiccated powder</td>
			<td style="width:120px;">BD Bacto</td>
			<td style="width:143px;">211520</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Cryogenic tubes</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">3775/945373</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hank&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">14170-112</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mechanical rocking platform</td>
			<td style="width:120px;">Daigger</td>
			<td style="width:143px;">EF4907G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">14-285-729</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing filter with prefilter</td>
			<td style="width:120px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">28143-295</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing syringe filter</td>
			<td style="width:120px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">431219</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">pH Standards</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">33643, 33646, 33648</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">M1018 or M4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Leibovitz L-15</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sodium bicarbonate, 7.5%</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">10082-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Trypsin, EDTA</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. ii. total culturable virus assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

וירוס התרכז מהמקור מי התהום של מתקני טיהור מי שלוש שתייה מסננת electropositive באמצעות היטב פרטי. שני סטים מדגמים, מורכבת מדגם שדה ובקרת LFSM, נאספו מתקני הטיהור בהזדמנויות נפרדות, וערכת דגימה אחת נאספה מן הבאר הפרטית. התאוששות וירוס בסך הכל נקבע באמצעות דגימות LFSM משני של צמחים ובעלי הבאר פרטית (שתי דגימות מצמח אחד מדגם אחד למשנהו לא נכללו בחישוב מפני ששווי MPN מזרע בשימוש עם כל דגימה לא ניתן לקבוע במדויק בשל לתוצאות CPE נורמליות בין צלוחיות לשכפל). Mean התאוששות poliovirus ממדגמים תהום בממוצע 58% עם מקדם השונה של 79% (איור 2) 16. אין וירוסי culturable זוהו באף אחד דגימות תחום מים הכפולות unseeded קרקע. ביצועי שיטה גם נמדדו באמצעות LFB samples שונה באמצעות שתי רמות זרע שונות. כייל &quot;נמוך&quot; של 300 MPN של poliovirus שמש להעריך את ביצועים ברמות פחות מאשר 500 MPN LFB הרמה &quot;הסטנדרטית&quot; המשמשת USEPA שיטת 1615. כייל &quot;גבוה&quot; של 1,000 MPN של poliovirus שמש כדי לבדוק ביצועים בבית רמת השליטה LFSM. בקרות אלה באופן דומה עם התאוששות ממוצעת של 111% וכן מקדם שונה של 100% (איור 2). כל LRB הדגימות היו שליליות וכל דגימות LFB בצעו בטווח הקבלה (S1 טבלת חומרים משלימים). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> איור 1. מסנן Elution. סכימטי לשימוש במיכל הלחץ elution מסנן מחסנית מוצג. לחץ אוויר חיובי משמש לדחוף פתרון תמצית בשר במיכל הלחץ דרך con דיור מחסניתtaining מסנן מחסנית electropositive. משאבת peristaltic ניתן להחליף עבור מיכל הלחץ, עם הכניסה של המשאבה שתוצב בתוך המכל מחזיק פתרון תמצית בשר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> איור 2. ממוצע poliovirus Recovery (%) מגראונד ו מגיב-כיתה מים. ההתאוששות אחוז ממוצע מוצג עבור שנגיף הפוליו מן הקרקע ( <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) ומים מגיבים כיתה ( <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) דגימות. שנים עשר דגימות מים כיתה מגיב כלל שישה זורעים עם 300 MPN ושישה זורעים עם 1,000 MPN של poliovirus. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן.

Watch this Scientific Journal Video about EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay at JoVE.com

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K Views.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Video: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; Spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, שיטת INEX משופרת<em&gt; באתרו</em&gt; מדידה של חלקיקים מומס תרכובות מעובד על ידי האכלת השעית Active

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

אופטימיזציה הליך לקביעת ספיחה של Phosphonates על גבי הידרוקסיד Ferric פרטנית באמצעות שיטה נחישות זרחן מיניאטורי

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

זיהוי של אמנון אגם וירוס באמצעות קונבנציונאלי RT-PCR ו SYBR ירוק RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

מיקרועלילה עיצוב וצמח הכנה לדגימת קרקע עבור 15ניתוח חנקן

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

שיטה אלקטרוסטטית להסרת חומר אורגני חלקיקי מאדמה

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The rhizosphere chemistry of wetland plants is particularly challenging to capture because of steep oxygen gradients from the roots to the bulk soil. Here a protocol is described that effectively preserves root structure and rhizosphere chemistry of wetland plants through slam-freezing and freeze drying. Slam-freezing, where the sample is frozen between copper blocks pre-cooled with liquid nitrogen, minimizes root damage and sample distortion that can occur with flash-freezing while still minimizing chemical speciation changes. While sample distortion is still possible, the ability to obtain multiple samples quickly and with minimal cost increases the potential to obtain satisfactory samples and optimizes imaging time. The data show that this method is successful in preserving reduced arsenic species in rice roots and rhizospheres associated with iron plaques. This method can be adopted for studies of plant-soil relationships in a wide variety of wetland environments that span concentration ranges from trace-element cycling to phytoremediation applications.

We describe a protocol to sample, preserve, and section intact roots and the surrounding rhizosphere soil from wetland environments using rice (Oryza sativa L.) as a model species. Once preserved, the sample can be analyzed using elemental imaging techniques, such as synchrotron X-ray fluorescence (XRF) chemical speciation imaging.

שיטה לשימור שורשי ביצות וריזוספרות להדמיה יסודית

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...