Name: an hs-mrm assay for the quantification of host-cell proteins in protein biopharmaceuticals by liquid chromatography ion mobility qtof mass spectrometry
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry at JoV

Forfatterne vil gerne takke Lesley Malouin og Tony Catlin fra farvande Corporation for at forberede figur 6 af manuskriptet.

1. forberedelse af infliximab digest (~ 24 h procedure)
<ol><li>Forberede frisk løsninger af 50 mM ammoniumbicarbonat, 1% anioniske overfladeaktive stoffer i 50 mM NH4HCO3, 500 mM dithiothreitol (DTT) i 50 mM NH4HCO3og 500 mM iodoacetamide (IAM) i 50 mM NH4HCO3.</li>
	<li>750 µL af 50 mM NH4HCO3, tilføje 200 µL af infliximab mAb (10 mg/mL) og 50 µL af 1% anioniske overfladeaktive løsning og denaturerer proteiner i 15 min. ved 60 ° C i overværelse af 0,05% anioniske overfladeaktive.</li>
	<li>Tilføje 40 µL af 500 mM DTT og reducere prøve for 60 min. ved 60 ° C i 20 mM DTT.</li>
	<li>Tilføj 20 µL af 500 mM IAM og alkylatbenzin prøve i 30 min. ved stuetemperatur i mørke i overværelse af ~ 10 mM IAM.</li>
	<li>Tilsæt indholdet af microcentrifuge rør til et hætteglas indeholdende 20 µg af MS sekventering-grade Lys C/trypsin og fordøje prøven i 3 timer ved 37 ° C.</li>
	<li>Tilføje et andet enzym alikvot (20 µg) ved at overføre den fordøjede prøve til en anden hætteglas indeholdende 20 µg MS sekventering-grade Lys C/Trypsin og fordøje prøve natten over (12-15 h) ved 37 ° C.</li>
	<li>Efter de natten proteolyse, tilsættes 5 µL af 100% myresyre (FA) og der inkuberes digest i 30 minutter ved 37 ° C dekomponerer den syre labile anioniske overfladeaktive.</li>
	<li>Spin ned digest for 15 min på 4.000 x g i en centrifuge at udfælde den uopløselig bestanddel af de anioniske overfladeaktive.</li>
	<li>Genskab ~ 1.000 µL af infliximab digest og placere det i en LC auto-sampler hætteglas; digest-koncentration skal være ~ 2 mg/mL. Opbevar digest'en i en fryser ved-20 ° C, indtil LC/MS systemet er klar til analyse.</li>
</ol>2. spiking peptid standarder (~ 30 min)
<ol><li>Tø infliximab digest ved at placere den frosne prøve i hætteglasset på en bænk ved stuetemperatur.</li>
	<li>Der tilsættes 1 mL af 0,1% FA i H2O til en kanin phosphorylase b (PHO) digest hætteglas til at forberede 1 µM stamopløsninger til alle seks peptid standarder fra PHO indeholdt i hætteglasset (hætteglasset indeholder 1 nmol af hver peptid).</li>
	<li>Forbered 4 x 1 mL fortyndinger af PHO stamopløsningen at opnå opløsninger indeholdende 0.1, 1, 10 og 100 nM peptider, ved hjælp af 0,1% FA som fortynding opløsningsmiddel. Forberede alle fortyndinger i hætteglas (LC auto-sampler hætteglas) og tilsæt 100 µL af infliximab digest som baggrund matrix til alle hætteglas. Indlæse 2 µg af digest baggrund på kolonne med hver 10 µL injektion. Forberede en blindprøve, der indeholder den fortyndede infliximab digest (den samme 1:10 fortynding), med ingen spidse peptider.</li>
</ol>3. opsætning af LC/P550 E data erhvervelse metode
Bemærk: Arbejdsprocessen sammenfatter de trin, der kræves for at oprette en HS-MRM erhvervelse er afbildet i figur 1 og er beskrevet i detaljer i afsnit 3-6. Erhvervelse af en data-uafhængig P550E datasæt er forpligtet til at etablere retentionstiden for hver overvåget peptid, overordnede m/z af de mest udbredte peptid ion efter electrospray Ionisation, og de tilsvarende CCS (collisional cross afsnit) afledt af ion mobilitet adskillelse. Desuden indeholder data-uafhængig datasæt oplysninger om m/z af de tre mest udbredte fragmentioner for hver peptid forløber. I det andet trin i arbejdsprocessen (CE optimering) øges følsomheden af analysen af tuning kollision celle energi for at opnå den højeste ion intensitet for hvert fragment ion. Endelig, i det sidste trin, alle parametre beskrevet ovenfor er introduceret til HS-MRM Metodeeditor for hver peptid overvåges.
<ol><li>Udføre LC/MS eksperimenter på et Quadrupol time of flight (QTOF) massespektrometer koblet til en ultra-performance væskekromatografi system ved hjælp af en data-uafhængig erhvervelse metode (P550E). Bemærk: Flere detaljer om konfigurationen af instrument er inkluderet i afsnittet materiale. Dette instrument bruger en omrejsende bølge ion mobilitet enhed for adskillelse af peptid prækursorer10.</li>
	<li>Forbered to mobile faser som indeholder 0,1% FA i vand (opløsningsmiddel A) og 0,1% FA i acetonitril (opløsningsmiddel B). Bemærk: Brug en ladet overflade hybrid (CSH) C18 kolonne (2.1 x 150 mm, pakket med 1,7-µm partikler) til adskillelse af spidse mAb fordøjer.</li>
	<li>I data erhvervelse software, skal du klikke på "Opret/analysemetode" og vælge "Genererer anskaffelsen og forarbejdningsmetode." Angiv metodenavnet, til mappen metode (register), og klik på "Næste".</li>
	<li>For "Analysetype," vælge "peptid kort (IMS)" og vælg "Kvaternære opløsningsmiddel Manager" instrument i fanen "Instrument System". Redigere de gradient indstillinger for at opnå peptid adskillelse med en væskehastighed på 200 µL/min. Brug en gradient eluering fra 1 til 40% opløsningsmiddel B i 30 min. efterfulgt af en 2-min kolonne vask og en 9-min ækvilibrering, med en samlet længde på 50 min. indføre disse eksperimentelle parametre i LC Metodeeditor.</li>
	<li>Vælg "prøve Manager" instrument i fanen "Instrument System". Indstil eksempel temperaturen til 10 ° C og temperaturen i kolonne til 60 ° C.</li>
	<li>Betjene QTOF massespektrometer i positiv ion ESI følsomhed tilstand, med en typisk opløsningsevne 30.000 FWHM. Bemærk: LC/P550E er en data-uafhængig erhvervelse (DIA) tilstand, der fungerer ved at hurtigt indsamle scanninger med skiftevis kollisionen energi (i cellen kollision) mellem en lav energi (6 V for MS kanal 1 scanninger) og en forhøjet energi (15 - 40 V rampe til producere Fragmentering spectra uden forløber udvalg i MS kanal 2).<ol>
<li>Angiv standard kilde-relaterede MS parametre i data erhvervelse software: Vælg fanen "Vion IMS Qtof" "Mit arbejde/Instrument System,", og Angiv disse parametre i menuen "Funktioner": 3,0 kV kapillær spænding, 100 ° C kilde temperatur, 100 V kilde offset, kegle 50 L/h gasflow, og 40 V kegle spænding. Indstil desolvation temperaturen til 250 ° C, desolvation af gasstrømmen til 500 L/h og reference kapillær spændingen til 3,0 kV.</li>
		<li>I data erhvervelse software, skal du klikke på "Opret/analysemetode" og vælge "Genererer anskaffelsen og forarbejdningsmetode." Skriv metodenavnet, og til mappen metode (register) og klik derefter på "Næste".</li>
		<li>For "Analysetype," vælge "peptid kort (IMS)" og vælg "Vion IMS QTof" instrument i fanen "Instrument System". Klik på "Udfør". Bemærk: Den nyoprettede LC/P550E metode åbner automatisk i "Instrument metode konfigurationsskærmbilledet".</li>
		<li>Angiv disse parametre i fanen "Indstillinger": 3,0 kV kapillær spænding, 100 ° C kilde temperatur, 250 ° C desolvation temperatur, 50 L/h kegle gasflow og 500 L/t desolvation gasflow.</li>
		<li>Vælg "High Definition MSE"i "Eksperiment" fanen Indstillinger, og vælg "Analyse metode runtime." Angiv disse parametre i fanen "scanningsindstillinger": lav masse, 100; høj masse, 2.000; og scan tid, 400 ms. i fanen "CE" Skriv "6 V" indstillingen lav-energi og vælge en højenergi rampe fra 15 til 40 V. Sørg for at have "Deaktiver data reduktion" kontrolleret.</li>
		<li>Indgyde en løsning af 50 ng/mL leucin enkephalin (LE) udarbejdet i 50% acetonitril med 0,1% FA med en væskehastighed på 10 µL/min til lock-masse kalibrering under dataopsamling. Bemærk: Lås-masse data er erhvervet hvert 5 min ved hjælp af den samme erhvervelse sats over det samme masseinterval.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysere 10-nM, PHO-spiked prøven ved hjælp af LC/P550E analysen beskrevet ovenfor ved at indsprøjte 10 µL af prøven (beløb indlæst på kolonnen er 100 fmol for hver standard peptid).</li>
</ol>4. opsætning af metoden Tof-MRM for kollisionen energi (CE) optimering
<ol><li>Fra LC/P550E datasæt, få for retentionstid, forløber og fragment ion m/z for hver PHO peptid. Bevare m/z og tilstanden gebyr for de mest rigelige forløber ion og den tilsvarende tre mest rigelige fragment ioner. Bemærk: Et eksempel på lav-energi og højenergi spectra typisk optaget af LC/P550E assay er præsenteret i figur 2.</li>
	<li>Bruge kollisionen energi (CE) optimering i en SRM/MRM eksperiment for at få det bedste signal til hver peptid23.<ol>
<li>I data erhvervelse software, skal du klikke på "Opret/analysemetode" og vælge "Genererer anskaffelsen og forarbejdningsmetode." Angiv metodenavnet, til mappen metode (register), og klik på "Næste".</li>
		<li>For "Analysetype," vælge "Tal." Vælg "Tal Assay Tof 2D kromatografiske" og klik på "Næste". Vælg "Vion IMS QTof" i fanen "Instrument System" og klik på "Udfør". Bemærk: Den nyoprettede Tof-MRM metode åbner automatisk i "Instrument metode konfigurationsskærmbilledet".</li>
		<li>Angiv disse parametre i fanen "Indstillinger": 3,0 kV kapillær spænding, 100 ° C kilde temperatur, 250 ° C desolvation temperatur, 50 L/h kegle gasflow og 500 L/t desolvation gasflow.</li>
		<li>Vælg "Funktion tabel" i "Eksperiment" fanen Indstillinger, og vælg "et eller flere MS, MSMS eller MRM funktioner." Du bruger pile ned, opsat en "Tof-MRM" funktion for hver peptid ved at indtaste tre "overgange" (kombinationer af de mest udbredte forløber og tre af dens mest rigelige fragmentioner). Bemærk: I Tof-MRM tilstand, den højeste følsomhed er opnået ved hjælp af en planlagt MRM tilgang.</li>
		<li>I "Tof-MRM" funktion editor, vælge en fastholdelse tidsvindue for hver peptid (mindst 1 min lange), ordnet efter peptid eluering rækkefølge. I "Tof-MRM" funktion editor, Indsæt peptid forløber m/z og produkt m/z; Vælg vinduet quad isolation som "Lav" (4-Da vinduet) for peptid forløber; Vælg en fast scan tid af 100 ms; og vælge tolv forskellige kollisionen energi værdier i rækken af 14-36 V, som følger: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 og 36, som vist i eksemplet fra figur 3. Bemærk: Med Tof-MRM metode beskrevet ovenfor, er mindst 10 datapunkter pr. kromatografiske toppe opkræves for hver overgang på hver CE angivet. For at reducere filstørrelsen data, skal du vælge indstillingen "Bred" (6-Da vindue) for signalet fra fragment ion. Eksempler på de CE-optimeret værdier er vist i tabel 2.</li>
		<li>Analysere 10-nM, PHO-spiked prøven ved hjælp af Tof-MRM analysen beskrevet ovenfor ved at indsprøjte 10 µL af prøven (beløb indlæst på kolonnen er 100 fmol for hver standard peptid).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. installation af den endelige HS-MRM erhvervelse metode til peptid kvantificering ved hjælp af ion mobilitet adskillelse af peptid prækursorer
<ol><li>I menuen "Undersøge" data erhvervelse software vise alle 11 kromatografiske spor genereret for hver CE for hver peptid og integrere toppe ved hjælp af knappen "Integrer" fra værktøjslinjen "behandling muligheder/operationer"; den højeste topareal angiver den bedste CE for hver overgang.</li>
	<li>Visuelt sammenligne de bedste toparealer for 3 fragmenter af hver peptid og bevare kun bedst "overgang" (den fragment ion, der producerer de mest intense signal); Tabel 2 viser bedste "overgange" fremstillet af fire PHO peptider.</li>
	<li>Setup en HS-MRM metode indeholder kun et fragment ion pr. peptid. Brug CCS værdierne for hver peptid forløber fra LC/P550E datasæt.<ol>
<li>Ændre metoden Tof-MRM oprettet i forrige afsnit (afsnit 4) ved at vælge funktionen "HS-MRM" i stedet for funktionen "Tof-MRM".</li>
		<li>I "HS-MRM" funktion editor, Angiv følgende forløber-relaterede parametre: m/z, Quadrupol opløsning: lav (4 Da), opladning stat, forløber CCS værdi og forløber CCS opløsning: lav. For produkt ion, indtaste sin m/z, optimal kollisionen energi, vælge en scan tid på 0,4 s og vælge en "bredt" indstilling (6 Da) til at omfatte alle af dets isotoper. Et eksempel på den endelige HS-MRM erhvervelse metode for alle fire peptider er præsenteret i figur 4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysere alle prøverne ved hjælp af metoden HS-MRM, begyndende med mAb digest blank (ikke-spidse prøve), efterfulgt af 4 Repliker injektioner (10 µL) af følgende koncentrationer: 0.1, 1, 10 og 100 nM PHO peptider.</li>
</ol>6. oprettelse af en forarbejdningsmetode til analyse af HS-MRM datasæt
<ol><li>Oprette en forarbejdningsmetode til analyse af HS-MRM datasæt.<ol>
<li>Analysemetode, der er oprettet for "HS-MRM" data erhvervelse metode, klik på fanen "Formål" og vælg "Administrer komponenter."</li>
		<li>Fra dropdown menuen under "Eksperiment Type", skal du vælge indstillingen "HS MS/MS/HS-MRM".</li>
		<li>Klik på "Opret/New post" og indføre de følgende parametre i behandling Metodeeditor: peptid retentionstiden (RT), forløber afgift tilstand, forløber m/z og forløber drift tid (DT). For fragment ion, indtaste sin m/z og afgift tilstand og angive "XIC" trace som tilstanden udvinding.</li>
		<li>Klik på "Standard beløb" i fanen "Formål" af den samme "HS-MRM" erhvervelse metode og indtaste følgende koncentrationer: 0.1, 1, 10 og 100 nM PHO peptider.</li>
		<li>Angiv følgende parametre i "Behandling/ekstraktion indstillinger": massen Standardtolerancen, 10 ppm (for m/z af alle fragmentioner) og standard glider tid, 5%; et eksempel på PHO peptid forarbejdningsmetode er vist i figur 5.</li>
		<li>Vælg lineær kurve montering med 1 / X2 vægtning for typen kalibrering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Processen HS-MRM data at integrere alle kromatogrammer og konstruere kalibreringskurverne for hver PHO peptid.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutic+proteins+by+comprehensive+online+two-dimensional+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry.</a> MAbs. 4, 24-44 (2012).</li><li>Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+host-cell+protein+impurities+in+biotherapeutics+using+mass+spectrometry.">Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry.</a> Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+tracking+of+host-cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry.">Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6, 659-670 (2014).</li><li>Farrell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+host-cell+protein+analysis+using+two-dimensional+data+independent+LC-MS(E).">Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E).</a> Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).</li><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography.">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).</li><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+identification+and+quantification+of+host+cell+proteins+(HCPs)+in+biotherapeutics+using+liquid+chromatography+mass+spectrometry.">Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry.</a> Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques. , 357-393 (2015).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+co-elution+of+host-cell+proteins+with+monoclonal+antibodies+during+protein+A+purification.">Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification.</a> Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).</li><li>Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometry+based+approach+to+host+cell+protein+identification+and+its+application+in+a+comparatibility+exercise.">A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise.</a> Anal Biochem. , 1-6 (2014).</li><li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+characterization+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions,+LC/MS/MS+and+multivariate+analysis.">Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis.</a> MAbs. 7, 1128-1137 (2015).</li><li>Giles, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+trevelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide.">Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).</li><li>Anderson, V., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins.">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).</li><li>Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+for+quantitative+proteomics:+a+tutorial.">Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).</li><li>Picotti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+generation+of+selected+reaction-monitoring+assays+for+proteins+and+proteomes.">High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes.</a> Nat Methods. 7, 43-46 (2010).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+using+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+with+mass+spectrometry.">Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+quantitation+of+proteins+by+mass+spectrometry.">Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry.</a> Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).</li><li>Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+absolute+protein+quantification.">Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification.</a> J Vis Exp. (102), (2015).</li><li>Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Range+of+protein+detection+by+selected/multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+in+an+unfractioned+human+cell+culture+lysate.">Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate.</a> Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).</li><li>Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+dynamic+range+proteome+analysis+of+S.+cerevisiae+by+targetted+proteomics.">Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics.</a> Cell. 138, 795-806 (2009).</li><li>Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+specific+is+my+SRM:+the+issue+of+precursor+and+product+ion+reductancy.">How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy.</a> Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).</li><li>Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+innacurate+and+imprecise+transitions+in+peptide+quantification+by+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry.">Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry.</a> Clin Chem. 56, 291-305 (2010).</li><li>Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+to+detect+and+avoid+redundancy+in+selected+reaction+monitoring.">A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).</li><li>Bao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+interference+in+SRM+analysis.">Detection and correction of interference in SRM analysis.</a> Methods. 61, 299-303 (2013).</li><li>Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+collision+energy+optimization+on+the+measurement+of+peptides+by+selected+reaction+monitoring+(SRM)+mass+spectrometry.">Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).</li><li>Mbasu, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+quadrupole+and+time-of-flight+mass+spectrometry+for+peptide+MRM+based+translational+reserch+analysis.">Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis.</a> Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).</li></ol>

Alle forfattere er medarbejdere i farvande Corporation, som er producent af flere reagenser og instrumenter, der anvendes i denne artikel.

Høj opløsning (Rs > 20.000) massespektrometri bruges rutinemæssigt til strukturel karakterisering af terapeutiske proteiner på en række instrument platforme. Derimod er MS-baseret protein kvantificering typisk udføres af SRM/MRM om lav opløsning (Rs ~ 1.000) tandem Quadrupol massespektrometre ved hjælp af underskrift peptider genereret af enzymatisk kløvningen af proteiner11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. som single-dimension kromatografisk separation ikke kan fuldt løse komplekse peptid blandinger fremstillet af enzymatisk fordøjelse, peptid Co eluering er en fælles begivenhed, selv i tilfælde af en single-protein digest. Meget komplekse protein fordøjer (f.eks. til kvantificering af 1-100 ppm af HCPs i overværelse af et peptid-rige baggrunden produceret af den terapeutiske protein), følsomhed, nøjagtighed og linearitet SRM/MRM kan assay blive påvirket af interferens.
SRM/MRM assays har endimensional selektivitet, kun påberåbe sig en "unik" kombination af forløber/fragment masserne. Derfor, disse assays mislykkes i situationer når peptid baggrunden ændres uventet (f.eks. for biofarmaceutiske prøver fremstillet af forskellige rensning procedurer). For at overvinde disse begrænsninger, vi foreslår her en høj selektivitet (HS) MRM analysen gennemføres på en ion mobilitet-aktiveret høj opløsning Quadrupol time of flight (QTOF) hybrid mass spectrometer (for instrument-diagram se figur 6).
Instrumentet adskiller forløbere for peptid af interesse fra andre Co fremstilling (interfererende) peptid prækursorer i cellen ion mobilitet, isolerer forløber i Quadrupol fuld isotopiske konvolutten og fragmenter det med en fast CE i den kollision celle. Signalet produceret af dens mest rigelige peptid fragment er yderligere forbedret ved at justere en pusher frekvens (Target ekstraudstyr), der selektivt skubber masse regioner af interesse i flight røret i stedet for alle ioner, som med en fuld scanning. Peptid kvantificering udføres ved hjælp af high-MS-opløsning (Rs ~ 30.000) signaler produceret af dette fragment ion. Sammenlignet med SRM/MRM assays, HS-MRM assay tilbyder to yderligere niveauer af selektivitet: en tilbydes af forløber-niveau ion mobilitet adskillelse, mens andet er tilbudt af den øgede masse opløsning af TOF analyzer. Resultaterne af forbedringerne selektivitet er synlige i HS-MRM kromatogrammer vises i figur 7, som er fri for interferens på tværs af tre størrelsesordener.
I modsætning til SRM/MRM-assays, der er flere parametre, der kan justeres for at optimere HS-MRM assays: vinduet RT omkring peptid forløber (typisk fastsat til 0,2 min.), vinduet Quadrupol isolation (4 Da), vinduet drift-tid omkring den forløber (± FWHM af forløber peak fra den tilsvarende ion mobilogram), og MS opløsning af fragment ion (20.000-40.000). HS-MRM-assays er meget følsomme: de laveste fundne beløb for hver PHO peptider er 1 femtomole på-kolonne (eller 0,1 nM i form af peptid koncentration). Når man overvejer peptid MW (se tabel 1 for nøjagtig MWs), beløbet, der registreres på kolonnen er på rækkefølgen af 1-2 pg, mens kolonnen er fyldt med et betydeligt højere beløb (2 µg) af baggrunden peptider fra mAb digest.
Ved at betragte molekylvægt af fuld længde PHO protein (97.2 kDa) som blev fremstillet af de spidse peptider, er analysen købedygtig opdager 50 ppm af en protein urenhed i overværelse af høj-overflod baggrund ioner. Lavere påvisningsgrænser (5-10 ppm) er opnåelige for lavere molekylvægt HCPs (10-20 kDa). Analysen omfatter tre størrelsesordener (som vist i kalibreringskurverne fra figur 8), hvilket betyder, at det kan måle HCPs i området 1-1.000 ppm. Også, reproducerbarhed af HS-MRM assays, illustreret i tabel 3, svarer meget godt med reproducerbarhed af små-molekyle SRM/MRM assays, med topareal RSDs bedre end 15%.
Vi udforsket mulighederne i en roman analyse til kvantificering af spidse peptid standarder i en monoklonale antistof (mAb) digest og demonstreret sin følsomhed og værktøj til at dække bredt dynamikområde (mindst tre størrelsesordener) typisk stødt i HCP analyse. Alle seks peptid standarder blev fundet i koncentrationer, der er så lav som 0,1 nM (1 femtomole lastet på et 2.1-mm ID kromatografiske kolonne) under tilstedeværelse af en høj-overflod peptid baggrund (2 µg af en mAb digest indlæst på kolonne). Ved at inkorporere både målrettede HRMS og ion mobilitet forløber adskillelse, har HS-MRM analysen stort potentiale for at blive en hurtig, høj overførselshastighed overvågning assay for flere HCPs på tværs af flere partier af biofarmaceutiske.

Kvantificering af store biomolekyler (proteiner) i industrielle indstillinger er i øjeblikket baseret på immunassays (fx ringprøver), hovedsagelig på grund af flere fordele: følsomhed, høj overførselshastighed, lethed-i-brug og lave omkostninger pr. prøve. Når den anvendes til at analysere de lav-overflod protein urenheder (værts-celle proteiner (HCPs) 1-100 ppm) findes i protein therapeutics, give disse biologiske assays typisk den samlede HCP koncentration (normalt udtrykt i ppm eller ng HCP/mg mAb), men de ikke kan identificere og måle individuelle HCP forurenende stoffer. Flere MS-baserede assays er for nylig blevet udviklet til at supplere ringprøver eller levere oplysninger, ringprøver undlader at tilbyde1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. prøve kompleksitet og kravet om at afsløre HCP peptider på tværs af et bredt dynamikområde i koncentration (mindst 3 ordrer størrelsesorden), flerdimensionelle kromatografiske metoder udbud omfattende stikprøve fraktionering har traditionelt været ansat til at hjælpe med at identificere low-overflod HCPs1,2,3,4,5,6,7.
Et naturligt skridt efter HCP identifikation og validering er HCP tracking (overvågning) på tværs af flere partier af biofarmaceutiske. I denne situation, er single-dimension LC/MS metoder blevet foreslået at forbedre prøve overførselshastighed8,9. Men, nøjagtighed og dynamiske rækkevidde af HCP målinger kan blive påvirket i en 1D LC/MS analyse af den overvældende tilstedeværelse af biofarmaceutiske peptider. Sammenlignet med en multidimensional adskillelse, potentialet for signal interferens19,20,21,22 er øget i en enkelt dimension kromatografisk separation fordi sandsynligheden for flere peptid prækursorer skal Co fremstilling er steget. Indarbejdelse af ortogonale middel til at adskille peptid prækursorer uden at udvide den chromatografiske separation tid ville klart være en fordel. Rejser bølge ion mobilitet (TWIM)10 har kapacitet til at løse overbelastede MS spektre i millisekunder. Ca. 500 mobilitet separationer kan udføres under eluering af en enkelt peptid, forudsat at en fuld kromatografiske toppe bredde på 10 s og overvejer at runtime af en IM adskillelse på ion mobilitet instrument er 20 ms.
Massespektrometrisk assays til protein kvantificering er udviklet med held i løbet af sidste årti bruger det godt accepteret valgt (flere) reaktion overvågning tilgang (SRM/MRM metode) gennemført på tandem massespektrometre11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. En af begrænsningerne i denne opløsning massespektrometrisk assay er den indblanding fænomen19,20,21,22 observeret når peptid interesse har det "samme" forløber og fragment masse andre Co fremstilling peptider til stede i prøven (inden for en 1-Da vindue). Der er to måder at forbedre nøjagtigheden af SRM/MRM metoder: en mulighed omfatter et ekstra adskillelse skridt på niveauet forløber fjerne interfererende forløber ioner, mens anden muligheden er at øge MS opløsningen af forløber/fragment påvisning at undgå overlappende MS signaler. Høj selektivitet (HS) MRM erhvervelse mode beskrevet her tager fordel af begge disse tilgange ved at koble ion mobilitet adskillelse af peptid forstadier med høj opløsning (Rs ~ 30.000) MS påvisning af peptid fragmenter. Analysen beskrives her dækker mindst tre størrelsesordener, som er den dynamiske område typisk observeret i SRM/MRM proteomics eksperimenter17,18,24.
Nytte af HS-MRM analysen til HCP kvantificering blev demonstreret ved at overvåge lineariteten af signalet produceret af seks peptid standarder spiked ved forskellige koncentrationer (0,1 - 100 nM rækkevidde) i et monoklonalt antistof digest.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vion IMS Qtof mass spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186009214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186015041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186015040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity H-Class Column Manager (CM)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186015043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>40867-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 &#181;m particles</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186005298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, eluent additive for LC/MS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56302-10X1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I-1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vials (12x32 mm glass vials, screw neck)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000327c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine Enkephalin acetate salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9133-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind 2.0 mL tubes (2x50)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 &#181;g)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39253-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an hs-mrm assay for the quantification of host-cell proteins in protein biopharmaceuticals by liquid chromatography ion mobility qtof mass spectrometry

Analyse af low-level (1-100 ppm) protein urenheder (f.eks. vært-cellen proteiner (HCPs)) i protein biotherapeutics er en udfordrende assay, der kræver høj følsomhed og bredt dynamikområde. Massespektrometri-baseret kvantificering assays til proteiner typisk involverer protein fordøjelse efterfulgt af den selektive reaktion overvågning/flere reaktion overvågning (SRM/MRM) kvantificering af peptider ved hjælp af en lav opløsning (Rs ~ 1.000) tandem Quadrupol massespektrometer. En af begrænsningerne i denne tilgang er interferens fænomen observeret når peptid interesse har "samme" forløber og fragment masse (målt i m/z-værdier) som andre Co fremstilling peptider til stede i prøven (inden for en 1-Da vindue). For at undgå dette fænomen, foreslår vi en alternativ massespektrometrisk tilgang, en høj selektivitet (HS) MRM assay, der kombinerer ion mobilitet adskillelse af peptid forstadier med høj opløsning (Rs ~ 30.000) MS påvisning af peptid fragmenter. Vi udforsket mulighederne i denne tilgang til at kvantificere lav-overflod peptid standarder spidse i et monoklonalt antistof (mAb) digest og demonstreret, at det har den følsomhed og dynamikområde (mindst 3 ordrer størrelsesorden) typisk opnået i HCP analyse. Alle seks peptid standarder blev fundet i koncentrationer, der er så lav som 0,1 nM (1 femtomole lastet på et 2.1-mm ID kromatografiske kolonne) under tilstedeværelse af en høj-overflod peptid baggrund (2 µg af en mAb digest indlæst på kolonne). Når man overvejer MW af kanin phosphorylase (97.2 kDa), som de spidse peptider er fremstillet, er LOQ af denne analyse lavere end 50 ppm. Relative standardafvigelser (RSD) af toparealer (n = 4 replikater) var mindre end 15% på tværs af det hele koncentrationsområde undersøgt (0,1-100 nM eller 1-1.000 ppm) i denne undersøgelse.

De individuelle sekvenser af seks phosphorylase b peptid standarder indeholdt i PHO peptid blanding er vist i tabel 1, sammen med deres retentionstider og deres mest rigelige prækursorer observeret i P550E eksperimentere. Det første skridt i udviklingen af en høj-selektivitet (HS) MRM assay er erhvervelse af en P550E datasæt til at etablere eluering gange af hver PHO peptid, sammen med dens tilsvarende mest rigelige forløber og de tre mest udbredte fragmenter. Figur 2 viser P550E spectra erhvervet for en af PHO peptider (Pep 6) spidse i infliximab digest. Efter etablering af de 3 bedste "overgange" (kombinationer af forløber og fragment masserne) for hver peptid, udføres en Tof-MRM eksperiment for at finde optimale kollisionen energi til at maksimere de signaler, der er genereret for hver peptid. Resultaterne af optimeringseksperiment CE er sammenfattet i tabel 2. Den endelige HS-MRM assay (se fig. 4) bevarer kun bedste "overgang" til hver peptid og bruges til at analysere alle spidse prøver. Eksempler på HS-MRM kromatogrammer genereres for 4 PHO peptider på tværs af alle de undersøgte koncentrationer er præsenteret i figur 7. Fire kalibreringskurverne opnået for hver peptid følgende integration af HS-MRM toppene fremhævet i figur 7 vises i figur 8. Derudover er den peak område Relativ standardafvigelse beregnet ud fra 4 Repliker injektioner, opsummeret i 4 tabeller vist i tabel 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptid</td>
			<td colspan="2">Peptid</td>
			<td>Fastholdelse</td>
			<td colspan="4">Gebyr stater</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Sekvens</td>
			<td>tid (min)</td>
			<td>+ 1</td>
			<td>+ 2</td>
			<td>+ 3</td>
			<td>+ 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 1</td>
			<td colspan="2">VLYPNDNFFEGK</td>
			<td>19.4</td>
			<td>1442.6951</td>
			<td>721.8512</td>
			<td>481.5699</td>
			<td>361.4292</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16,0</td>
			<td>1874.9065</td>
			<td>937.9569</td>
			<td>625.6404</td>
			<td>469.4821</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 3</td>
			<td colspan="2">IGEEYISDLDQLRK</td>
			<td>18,9</td>
			<td>1678.8646</td>
			<td>839.9360</td>
			<td>560.2931</td>
			<td>420.4716</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>1440.7369</td>
			<td>720.8721</td>
			<td>480.9172</td>
			<td>360.9397</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>1890.0080</td>
			<td>945.5076</td>
			<td>630.6742</td>
			<td>473.2574</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17,7</td>
			<td>1262.5939</td>
			<td>631.8006</td>
			<td>421.5362</td>
			<td>316.4039</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. PHO peptid standarder indgår i massen PREP blandingen, spidse i infliximab digest. Peptid retentionstider og deres mest rigelige prækursorer (fremhævet i fed) vises i tabelformat.
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptid</td>
			<td colspan="2">Peptid</td>
			<td>Fastholdelse</td>
			<td colspan="2">Peptid forløber</td>
			<td colspan="3">Mest rigelige fragment ioner/opladning</td>
			<td>Optimal</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Sekvens</td>
			<td>tid (min)</td>
			<td>m/z & charge</td>
			<td>Drift tid (ms)</td>
			<td>Jeg</td>
			<td>II</td>
			<td>III</td>
			<td>CE (V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16,0</td>
			<td>625.6404 (+ 3)</td>
			<td>6.2</td>
			<td>714.3781 (+ 1)</td>
			<td>807.4177 (+ 2)</td>
			<td>827.4621 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>720.8721 (+ 2)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>865.4050 (+ 1)</td>
			<td>964.4734 (+ 1)</td>
			<td>1214.5688 (+ 1)</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>630.6742 (+ 3)</td>
			<td>6.3</td>
			<td>642.3570 (+ 1)</td>
			<td>689.8391 (+ 2)</td>
			<td>832.4236 (+ 2)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17,7</td>
			<td>631.8006 (+ 2)</td>
			<td>7.0</td>
			<td>830.3931 (+ 1)</td>
			<td>945.4200 (+ 2)</td>
			<td>1016.4571 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Resultaterne af Tof-MRM optimeringseksperiment: de tre mest udbredte fragmenter af hver PHO peptid kvantificeret i denne undersøgelse er angivet, sammen med den tilsvarende optimerede kollisionen energi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Konc</td>
			<td>Beløb</td>
			<td colspan="6">PEP 2 toparealer (tabel 3A)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>kolonne (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Middelværdi</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>439</td>
			<td>462</td>
			<td>431</td>
			<td>456</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>5121</td>
			<td>4842</td>
			<td>5198</td>
			<td>4842</td>
			<td>5001</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>63853</td>
			<td>64279</td>
			<td>66111</td>
			<td>62509</td>
			<td>64188</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>612392</td>
			<td>605553</td>
			<td>613229</td>
			<td>611004</td>
			<td>610545</td>
			<td>0,6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Konc</td>
			<td>Beløb</td>
			<td colspan="6">PEP 4 toparealer (tabel 3B)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>kolonne (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Middelværdi</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1</td>
			<td>1</td>
			<td>275</td>
			<td>359</td>
			<td>325</td>
			<td>288</td>
			<td>312</td>
			<td>12.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>3559</td>
			<td>3694</td>
			<td>3287</td>
			<td>3754</td>
			<td>3574</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>45259</td>
			<td>45775</td>
			<td>42976</td>
			<td>45548</td>
			<td>44890</td>
			<td>2.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>459374</td>
			<td>467927</td>
			<td>436272</td>
			<td>458994</td>
			<td>455642</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Konc</td>
			<td>Beløb</td>
			<td colspan="6">PEP 5 toparealer (tabel 3 c)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>kolonne (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Middelværdi</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1</td>
			<td>1</td>
			<td>3194</td>
			<td>3243</td>
			<td>3202</td>
			<td>3257</td>
			<td>3224</td>
			<td>1,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>31464</td>
			<td>31150</td>
			<td>31464</td>
			<td>31433</td>
			<td>31378</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>313638</td>
			<td>320712</td>
			<td>311943</td>
			<td>311943</td>
			<td>314559</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>2845736</td>
			<td>2840031</td>
			<td>2882006</td>
			<td>2864052</td>
			<td>2857956</td>
			<td>0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Konc</td>
			<td>Beløb</td>
			<td colspan="6">PEP 6 toparealer (tabel 3D)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>kolonne (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Middelværdi</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>583</td>
			<td>440</td>
			<td>440</td>
			<td>488</td>
			<td>13.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>6429</td>
			<td>6429</td>
			<td>6848</td>
			<td>6623</td>
			<td>6582</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>71295</td>
			<td>70400</td>
			<td>71563</td>
			<td>70400</td>
			<td>70915</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>707640</td>
			<td>707640</td>
			<td>694461</td>
			<td>729490</td>
			<td>709808</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3. Tabel, der indeholder toparealer af HS-MRM kromatogrammer indspillet til 4 PHO peptider (Pep 2, 4, 5 og 6) for hver LC/MS injektion (16 LC/MS runs og 4 koncentrationer testet). Den relative standardafvigelse var bedre end 15% for alle peptider over det hele koncentrationsområde undersøgt.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig1.jpg"> Figur 1. Arbejdsprocesdiagram sammenfatter de tre trin, der kræves for at oprette en HS-MRM erhvervelse metode. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig2.jpg"> Figur 2. Eksempel på HDMSE data: (A) lavenergi spektrum viser Pep 6 forløber ion. B højenergi fragmentering spektrum af den samme peptid, viser de top 3 mest rigelige fragmentioner (cirkel) udvalgt til Tof-MRM kollisionen energioptimering. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig3.jpg"> Figur 3. Parametre, der bruges til at konfigurere en Tof-MRM optimering eksperimentere. For hver overgang, blev elleve kollisionen energi (i rækken af 16-36 V) testet. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig4.jpg"> Figur 4. Eksempel på metoden endelige HS-MRM. Flere parametre er påkrævet for hver "overgang," herunder peptid forløber m/z, sin afgift tilstand og ion mobilitet drift tid, m/z af de mest udbredte fragment ion, den optimale kollision energi og MS erhvervelse tid. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig5.jpg"> Figur 5. Indstillingerne bruges af forarbejdningsmetode til at analysere HS-MRM datasæt. Hver peptid overvåges af en enkelt "overgang" beskrevet af peptid forløber m/z, opkræve stat og forventet retentionstid, sammen med m/z af de mest udbredte fragment og sin afgift tilstand. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig6.jpg"> Figur 6. Diagram af ion mobilitet massespektrometer. I HS-MRM erhvervelse mode, forløberen for den peptid, der er at være kvantificeret er adskilt fra andre Co fremstilling (interfererende) peptid prækursorer i cellen ion mobilitet, isoleret af Quadrupol, og fragmenteret med en fast kollisionen energi i den kollision celle. Signalet produceret af peptid fragmentioner forstærkes ved at justere pusher frekvens, og peptid kvantificering udføres ved hjælp af high-MS-opløsning (> 30.000) signaler produceret af den mest intense fragment ion af hver peptid. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2.jpg"> Figur 7. HS-MRM kromatogrammer indspillet for 4 PHO peptider på 4 forskellige koncentrationer der strækker sig over 3 størrelsesordener (0.1, 1, 10 og 100 nM). (A) pep 2 kromatogrammer, b Pep 4 kromatogrammer, c Pep 5 kromatogrammer og d Pep 6 kromatogrammer. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2.jpg"> Figur 8. Kalibreringskurverne for 4 PHO peptider på tværs af 4 forskellige koncentrationer (0.1, 1, 10 og 100 nM). Tabellerne under hver kurve viser de enkelte toparealer (Y-værdier) registreres for hver injektion, mens den anden kolonne i hver tabel viser den procentvise afvigelse fra den forventede lineær respons. (A) pep 2 kalibrering, b Pep 4 kalibrering, c Pep 5 kalibrering og d Pep 6 kalibrering. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry at JoV

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Her, beskriver vi et kromatografisk analyse kombineret med ion mobilitet adskillelse af peptid prækursorer efterfulgt af høj opløsning (~ 30.000) MS-påvisning af peptid fragmenter for kvantificering af spidse peptid standarder i et monoklonalt antistof Digest.

En HS-MRM analyse til kvantificering af værts-celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals af væskekromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Large Scale Ikke-målrettet metabolomisk profilering af Serum fra Ultra Performance Liquid Chromatography-massespektrometri (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Målrettede Metabolomics fra biologiske kilder Brug Ultraperformance væskekromatografi-højopløsningsmassespektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

Profilere triacylglycerid Indhold i Bat Integumentary Lipider ved præparativ tyndtlagskromatografi og MALDI-TOF-massespektrometri

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radioaktiv mærkning og kvantificering af cellulære niveauer af phosphoinositider af højtryksvæskekromatografi-koblede Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Analyzing the Photo-oxidation of 2-propanol at Indoor Air Level Concentrations Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry

Analysere foto-oxidation af 2-propanol på indendørs luft koncentrationer ved hjælp af feltet asymmetriske Ion mobilitet massespektrometri

We demonstrate a versatile protocol to be used for determining the effectiveness of photocatalysts in degrading indoor air concentration (ppb) volatile ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Analysere Protein arkitekturer og Protein-Ligand komplekser af Integrativ strukturelle massespektrometri

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ion Mobility-massespektrometri teknikker til bestemmelse af strukturen og mekanismerne for metal Iongenkendelse og Redoxaktivitet af metal bindende oligopeptider

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Kapillær elektroforese massespektrometri tilgange til karakterisering af protein og metabolit Corona erhvervet af nanomaterialer

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Kovalent mærkning med Diethylpyrocarbonat til at studere protein højere ordensstruktur ved massespektrometri

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...