Name: an hs-mrm assay for the quantification of host-cell proteins in protein biopharmaceuticals by liquid chromatography ion mobility qtof mass spectrometry
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry at JoV

लेखक Lesley Malouin और टोनी Catlin जल निगम से पांडुलिपि का आंकड़ा 6 तैयार करने के लिए धंयवाद देना चाहूंगा ।

<ol>
	<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutic+proteins+by+comprehensive+online+two-dimensional+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry.</a> MAbs. 4, 24-44 (2012).</li><li>Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+host-cell+protein+impurities+in+biotherapeutics+using+mass+spectrometry.">Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry.</a> Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+tracking+of+host-cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry.">Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6, 659-670 (2014).</li><li>Farrell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+host-cell+protein+analysis+using+two-dimensional+data+independent+LC-MS(E).">Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E).</a> Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).</li><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography.">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).</li><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+identification+and+quantification+of+host+cell+proteins+(HCPs)+in+biotherapeutics+using+liquid+chromatography+mass+spectrometry.">Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry.</a> Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques. , 357-393 (2015).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+co-elution+of+host-cell+proteins+with+monoclonal+antibodies+during+protein+A+purification.">Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification.</a> Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).</li><li>Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometry+based+approach+to+host+cell+protein+identification+and+its+application+in+a+comparatibility+exercise.">A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise.</a> Anal Biochem. , 1-6 (2014).</li><li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+characterization+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions,+LC/MS/MS+and+multivariate+analysis.">Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis.</a> MAbs. 7, 1128-1137 (2015).</li><li>Giles, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+trevelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide.">Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).</li><li>Anderson, V., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins.">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).</li><li>Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+for+quantitative+proteomics:+a+tutorial.">Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).</li><li>Picotti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+generation+of+selected+reaction-monitoring+assays+for+proteins+and+proteomes.">High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes.</a> Nat Methods. 7, 43-46 (2010).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+using+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+with+mass+spectrometry.">Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+quantitation+of+proteins+by+mass+spectrometry.">Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry.</a> Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).</li><li>Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+absolute+protein+quantification.">Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification.</a> J Vis Exp. (102), (2015).</li><li>Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Range+of+protein+detection+by+selected/multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+in+an+unfractioned+human+cell+culture+lysate.">Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate.</a> Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).</li><li>Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+dynamic+range+proteome+analysis+of+S.+cerevisiae+by+targetted+proteomics.">Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics.</a> Cell. 138, 795-806 (2009).</li><li>Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+specific+is+my+SRM:+the+issue+of+precursor+and+product+ion+reductancy.">How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy.</a> Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).</li><li>Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+innacurate+and+imprecise+transitions+in+peptide+quantification+by+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry.">Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry.</a> Clin Chem. 56, 291-305 (2010).</li><li>Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+to+detect+and+avoid+redundancy+in+selected+reaction+monitoring.">A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).</li><li>Bao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+interference+in+SRM+analysis.">Detection and correction of interference in SRM analysis.</a> Methods. 61, 299-303 (2013).</li><li>Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+collision+energy+optimization+on+the+measurement+of+peptides+by+selected+reaction+monitoring+(SRM)+mass+spectrometry.">Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).</li><li>Mbasu, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+quadrupole+and+time-of-flight+mass+spectrometry+for+peptide+MRM+based+translational+reserch+analysis.">Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis.</a> Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).</li></ol>

सभी लेखक जल निगम के कर्मचारी हैं, जो इस लेख में प्रयुक्त कई रिएजेंट और उपकरणों के निर्माता हैं.

उच्च संकल्प (रुपये > 20, 000) मास स्पेक्ट्रोमेट्री नियमित रूप से साधन प्लेटफार्मों की एक किस्म पर चिकित्सकीय प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके विपरीत, MS-आधारित प्रोटीन ठहराव को आम तौर पर टेक्सटाइल्स/MRM द्वारा कम-रिज़ॉल्यूशन (Rs ~ १,०००) पर निष्पादित किया जाता है quadrupole जन स्पेक्ट्रोमीटर प्रोटीन के एंजाइमी दरार द्वारा उत्पन्न हस्ताक्षर पेप्टाइड्स का उपयोग करते हुए11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. के रूप में एकल आयाम क्रोमेटोग्राफिक जुदाई पूरी तरह से जटिल पेप्टाइड एंजाइमी पाचन द्वारा उत्पादित मिश्रण को हल नहीं कर सकते, पेप्टाइड सह-रेफरेंस एक आम घटना है, यहां तक कि एक एकल प्रोटीन डाइजेस्ट के मामले में । बहुत जटिल प्रोटीन डाइजेस्ट के लिए (जैसे, चिकित्सीय प्रोटीन द्वारा उत्पादित पेप्टाइड-युक्त पृष्ठभूमि की उपस्थिति में HCPs के 1-100 ppms के ठहराव के लिए), संवेदनशीलता, सटीकता, या इस टेक्सटाइल्स की रैखिकता/MRM परख से प्रभावित हो सकते हैं हस्तक्षेप.
टेक्सटाइल्स/MRM परख संकते selectivity है, केवल एक "अद्वितीय" अग्रदूत के संयोजन के पर निर्भर/ इस कारण से, इन परख स्थितियों में विफल जब पेप्टाइड पृष्ठभूमि अप्रत्याशित रूप से बदलताहै (उदा, विभिंन शोधन प्रक्रियाओं से प्राप्त करने के लिए, अंय दवाओं के नमूनों के लिए) । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम यहां एक उच्च selectivity (एच एस) MRM परख एक आयन गतिशीलता पर लागू-सक्षम उच्च संकल्प quadrupole समय के उड़ान (QTOF) संकर जन स्पेक्ट्रोमीटर (साधन आरेख के लिए, चित्र 6 देखें) ।
साधन अंय सह eluting से ब्याज की पेप्टाइड के अग्रदूतों को अलग करता है (हस्तक्षेप) आयन गतिशीलता सेल में पेप्टाइड अग्रदूत, quadrupole में अग्रदूत साबित की पूरी isotopic लिफाफा अलग, और यह एक निश्चित CE के साथ टुकड़ों में... टक्कर सेल । इसके सबसे प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड टुकड़ा द्वारा उत्पादित संकेत आगे एक पूर्ण स्कैन के साथ के रूप में, बजाय सभी आयनों, उड़ान ट्यूब में ब्याज की बड़े पैमाने पर क्षेत्रों धक्का है जो, पुश आवृत्ति (लक्ष्य वृद्धि) का समायोजन करके बढ़ाया है. पेप्टाइड ठहराव उच्च-MS-संकल्प का उपयोग किया जाता है (Rs ~ ३०,०००) इस टुकड़े आयन द्वारा उत्पादित संकेत । टेक्सटाइल्स के साथ तुलना/MRM परख, एच एस-MRM परख selectivity के दो अतिरिक्त स्तर प्रदान करता है: एक प्रणेता स्तर आयन गतिशीलता जुदाई द्वारा प्रदान की जाती है, जबकि दूसरी तोफ विश्लेषक की वृद्धि हुई जन संकल्प द्वारा की पेशकश की है । इन selectivity सुधार द्वारा लाया परिणाम एच एस-MRM chromatograms में प्रदर्शित चित्र 7 में दिखाई दे रहे हैं, जो परिमाण के तीन आदेशों में हस्तक्षेप से मुक्त हैं ।
टेक्सटाइल्स के विपरीत/MRM परख, वहां कई पैरामीटर है कि एच एस-MRM परख का अनुकूलन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है: पेप्टाइड अग्रदूत के आसपास आरटी खिड़की (आमतौर पर ०.२ मिनट में सेट), quadrupole अलगाव विंडो (4 डीए), बहाव-समय खिड़की के आसपास प्रणेता (इसी आयन mobilogram से प्रणेता शिखर का ± FWHM), और अंश आयन (20000-40000) का एमएस रेजोल्यूशन । एच एस-MRM परख बहुत संवेदनशील होते हैं: प्रत्येक फोटो पेप्टाइड्स के लिए सबसे कम पहचान की गई राशि है 1 femtomole पर-स्तंभ (या ०.१ एनएम के संदर्भ में पेप्टाइड एकाग्रता). जब पेप्टाइड मेगावाट पर विचार (सटीक मेगावाट बिजली के लिए तालिका 1 देखें), पर पता चला राशि कॉलम 1-2 स्नातकोत्तर के आदेश पर है, जबकि कॉलम एक काफी अधिक राशि (2 µ जी) मॉब डाइजेस्ट से पृष्ठभूमि पेप्टाइड्स के साथ भरी हुई है ।
पूर्ण लंबाई फोटो प्रोटीन के आणविक वजन (९७.२ केडीए), जहां से नुकीला पेप्टाइड्स व्युत्पंन थे पर विचार करके, परख के लिए उच्च बहुतायत पृष्ठभूमि आयनों की उपस्थिति में एक प्रोटीन नापाक की ५० पीपीएम का पता लगाने में सक्षम है । पता लगाने की निचली सीमाएं (5-10 पीपीएम) कम आणविक भार HCPs (10-20 केडीए) के लिए प्राप्त कर रहे हैं । परख परिमाण के तीन आदेश शामिल है (जैसा कि 8 चित्रा से अंशांकन curves में दिखाया गया है), जिसका अर्थ है कि यह 1 में HCPs उपाय कर सकते है-1000 पीपीएम रेंज । इसके अलावा, एच एस के reproducibility-MRM परख, 3 तालिका में सचित्र, छोटे अणु टेक्सटाइल्स के reproducibility के साथ बहुत अच्छी तरह से मेल खाता है/MRM परख, चोटी क्षेत्र RSDs 15% से बेहतर है ।
हम एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में नुकीला पेप्टाइड मानकों के ठहराव के लिए एक उपंयास परख की क्षमताओं का पता लगाया (मॉब) डाइजेस्ट और अपनी संवेदनशीलता और उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए व्यापक गतिशील रेंज कवर (परिमाण के ंयूनतम तीन आदेश) आम तौर पर HCP विश्लेषण में सामने आया । सभी छह पेप्टाइड मानकों सांद्रता पर पाया गया के रूप में कम के रूप में ०.१ एनएम (एक २.१-mm आईडी क्रोमेटोग्राफिक कॉलम पर लोड 1 femtomole) एक उच्च बहुतायत पेप्टाइड पृष्ठभूमि की उपस्थिति में (एक मॉब डाइजेस्ट के 2 µ जी पर लोड-कॉलम) । दोनों लक्षित HRMS और आयन गतिशीलता प्रणेता जुदाई को शामिल करके, एच एस-MRM परख एक तेजी से बनने के लिए महान क्षमता है, उच्च प्रवाह कई HCPs के लिए निगरानी परख के कई बैचों में ।

औद्योगिक सेटिंग्स में बड़े ठहराव अणुओं (प्रोटीन) की वर्तमान में immunoassays (जैसे, एलिसा), मुख्य रूप से कई फायदों के कारण: संवेदनशीलता, उच्च प्रवाह, आसानी से उपयोग करते हैं, और प्रति नमूना कम लागत पर आधारित है । जब कम बहुतायत प्रोटीन अशुद्धियों का विश्लेषण करने के लिए लागू (1-100 पीपीएम के मेजबान सेल प्रोटीन (HCPs)) प्रोटीन चिकित्सकीय में मौजूद, इन जैविक परख आमतौर पर कुल HCP एकाग्रता प्रदान (आमतौर पर पीपीएम या एनजी HCP में व्यक्त/मॉब), लेकिन वे व्यक्तिगत HCP संदूषणों की पहचान और माप नहीं सकता । कई एमएस आधारित परख हाल ही में एलिसा पूरक या जानकारी है कि एलिसा1,2,3,4,5,6 की पेशकश करने में विफल प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है , 7 , 8 , 9. क्योंकि नमूना जटिलता और एकाग्रता में एक व्यापक गतिशील रेंज भर HCP पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए आवश्यकता की (परिमाण के ंयूनतम 3 आदेश), बहुआयामी क्रोमेटोग्राफिक तरीकों व्यापक नमूना भिन्नीकरण टेण्डर है पारंपरिक रूप से कम बहुतायत HCPs1,2,3,4,5,6,7की पहचान करने में मदद करने के लिए नियोजित किया गया है ।
HCP पहचान और सत्यापन के बाद एक प्राकृतिक कदम HCP ट्रैकिंग (निगरानी) के कई बैचों में है । इस स्थिति में, एकल-आयाम नियंत्रण रेखा/MS विधियों का नमूना प्रवाह8,9में सुधार करने के लिए प्रस्तावित किया गया है । हालांकि, सटीकता और HCP माप की गतिशील रेंज एक डी सी नियंत्रण रेखा/एमएस परख में प्रभावित हो सकता है की भारी उपस्थिति द्वारा-फार्मास्युटिकल पेप्टाइड्स । एक बहुआयामी जुदाई की तुलना में, संकेत हस्तक्षेप के लिए संभावित19,20,21,22 एक एकल आयाम क्रोमेटोग्राफिक जुदाई में वृद्धि हुई है क्योंकि के लिए संभावना अधिक पेप्टाइड पुरोगामी सह होने के लिए eluting वृद्धि हुई है । ओर्थोगोनल का निगमन क्रोमेटोग्राफिक जुदाई समय विस्तार के बिना पेप्टाइड अग्रदूतों को अलग करने के लिए मतलब स्पष्ट रूप से लाभप्रद होगा । यात्रा लहर आयन गतिशीलता (TWIM)10 मिलीसेकंड में भीड़भाड़ एमएस स्पेक्ट्रा को हल करने की क्षमता है । लगभग ५०० गतिशीलता जुदाई एक पेप्टाइड के रेफरेंस के दौरान प्रदर्शन किया जा सकता है, एक पूर्ण क्रोमेटोग्राफिक चोटी की चौड़ाई संभालने 10 एस और विचार है कि आयन गतिशीलता साधन पर एक IM जुदाई के रनटाइम 20 ms.
प्रोटीन ठहराव के लिए मास spectrometric परख सफलतापूर्वक पिछले एक दशक से अधिक विकसित किया गया है अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है चयनित (एकाधिक) प्रतिक्रिया निगरानी दृष्टिकोण (टेक्सटाइल्स/MRM विधि) मिलकर जन स्पेक्ट्रोमीटर11पर कार्यांवित का उपयोग कर, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. इस कम संकल्प जन spectrometric परख की सीमाओं में से एक हस्तक्षेप घटना19,20,21,22 मनाया जब ब्याज की पेप्टाइड "एक ही है" नमूने में मौजूद अन्य सह-eluting पेप्टाइड्स के रूप में प्रणेता और टुकड़ा द्रव्यमान (एक 1-Da विंडो के भीतर). टेक्सटाइल्स/MRM तरीकों की सटीकता को बेहतर बनाने के दो तरीके हैं: एक विकल्प पूर्ववर्ती आयनों हस्तक्षेप को दूर करने के लिए अग्रदूत के स्तर पर एक अतिरिक्त जुदाई कदम शामिल है, जबकि अन्य विकल्प के लिए अग्रदूत/टुकड़ा का पता लगाने के एमएस संकल्प को बढ़ाने के लिए है अतिव्यापी एमएस संकेतों से बचें । उच्च-selectivity (एच एस) MRM अधिग्रहण मोड यहां वर्णित उच्च संकल्प के साथ पेप्टाइड पुरोगामी की आयन गतिशीलता जुदाई युग्मन द्वारा इन तरीकों के दोनों का लाभ लेता है (Rs ~ ३०,०००) पेप्टाइड अंशों का पता लगाने के एमएस । परख यहां वर्णित परिमाण, जो गतिशील रेंज आमतौर पर टेक्सटाइल्स में मनाया/MRM प्रोटियोमिक् प्रयोगों17,18,24के कम से तीन आदेश शामिल हैं ।
HCP ठहराव के लिए एच एस-MRM परख की उपयोगिता छह पेप्टाइड मानकों द्वारा उत्पादित संकेत की रैखिकता की निगरानी द्वारा प्रदर्शन किया गया था (०.१-१००-एनएम रेंज के लिए) एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी डाइजेस्ट में अलग सांद्रता पर नुकीला ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vion IMS Qtof mass spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186009214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186015041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186015040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity H-Class Column Manager (CM)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186015043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>40867-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 &#181;m particles</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186005298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, eluent additive for LC/MS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56302-10X1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I-1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vials (12x32 mm glass vials, screw neck)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000327c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine Enkephalin acetate salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9133-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind 2.0 mL tubes (2x50)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 &#181;g)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39253-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an hs-mrm assay for the quantification of host-cell proteins in protein biopharmaceuticals by liquid chromatography ion mobility qtof mass spectrometry

कम स्तर के विश्लेषण (1-100 पीपीएम) प्रोटीन अशुद्धियों (जैसे, मेजबान सेल प्रोटीन (HCPs)) में प्रोटीन है एक चुनौतीपूर्ण उच्च संवेदनशीलता और एक व्यापक गतिशील रेंज की आवश्यकता परख है । बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटीन के लिए ठहराव परख आम तौर पर शामिल प्रोटीन पाचन चयनात्मक प्रतिक्रिया की निगरानी के द्वारा पीछा किया/मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (टेक्सटाइल्स/MRM) ठहराव का उपयोग कर पेप्टाइड्स के एक कम संकल्प (रु ~ १,०००) मिलकर quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर । इस दृष्टिकोण की सीमाओं में से एक है जब ब्याज की पेप्टाइड "एक ही" प्रणेता और टुकड़ा द्रव्यमान (m/z मूल्यों के संदर्भ में) के रूप में अंय सह eluting पेप्टाइड्स नमूना में मौजूद है (एक 1-Da विंडो के भीतर) मनाया हस्तक्षेप घटना है । इस घटना से बचने के लिए, हम एक वैकल्पिक जन spectrometric दृष्टिकोण, एक उच्च selectivity (एच एस) MRM परख है कि उच्च संकल्प के साथ पेप्टाइड पुरोगामी के आयन गतिशीलता जुदाई को जोड़ती है प्रस्ताव (Rs ~ ३०,०००) पेप्टाइड अंशों का पता लगाने MS । हम कम मात्रा में एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) में नुकीला मानकों को पचाने के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमताओं का पता लगाया और यह दर्शाता है कि यह संवेदनशीलता और गतिशील रेंज है (परिमाण के ंयूनतम 3 आदेश) आम तौर पर HCP में प्राप्त विश्लेषण. सभी छह पेप्टाइड मानकों सांद्रता पर पाया गया के रूप में कम के रूप में ०.१ एनएम (एक २.१-mm आईडी क्रोमेटोग्राफिक कॉलम पर लोड 1 femtomole) एक उच्च बहुतायत पेप्टाइड पृष्ठभूमि की उपस्थिति में (एक मॉब डाइजेस्ट के 2 µ जी पर लोड-कॉलम) । जब इस मेगावाट के खरगोश phosphorylase (९७.२ केडीए), जहां से नुकीला पेप्टाइड्स प्राप्त किया गया था पर विचार, इस परख के LOQ से कम है ५० पीपीएम । सापेक्ष मानक विचलन (RSD) पीक क्षेत्रों (n = 4 प्रतिकृति) इस अध्ययन में (0.1-100 एनएम या 1-1000 पीपीएम) की जांच की पूरी एकाग्रता सीमा पार 15% से कम थे ।

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An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

यहां, हम एक क्रोमेटोग्राफिक एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में नुकीला पेप्टाइड मानकों के ठहराव के लिए पेप्टाइड टुकड़े का पता लगाने के बाद उच्च संकल्प (~ ३०,०००) एमएस-के बाद आयन गतिशीलता जुदाई के साथ मिलकर परख का वर्णन डाइजेस्ट.

एक एच एस-MRM परख के ठहराव के लिए मेजबान कोशिका प्रोटीन में प्रोटीन क्रोमैटोग्राफी आयन गतिशीलता द्वारा QTOF जन स्पेक्ट्रोमेट्री

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

बड़े पैमाने पर गैर - लक्षित अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-एमएस) द्वारा सीरम की metabolomic प्रोफाइलिंग

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ultraperformance लिक्विड क्रोमैटोग्राफी उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) का उपयोग जैविक स्रोतों से अलक्षित Metabolomics

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

प्रारंभिक पतली परत क्रोमैटोग्राफी और MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा चमगादड़ कोल लिपिड में Triacylglyceride सामग्री रूपरेखा

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर प्रवाह जगमगाहट से radiolabeling और Phosphoinositides की सेलुलर स्तर की मात्रा

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Analyzing the Photo-oxidation of 2-propanol at Indoor Air Level Concentrations Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry

तस्वीर-2 के ऑक्सीकरण-propanol इनडोर वायु स्तर सांद्रता क्षेत्र असममित आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर का विश्लेषण

We demonstrate a versatile protocol to be used for determining the effectiveness of photocatalysts in degrading indoor air concentration (ppb) volatile ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

एकीकृत संरचनात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन आर्किटेक्चर और प्रोटीन-Ligand परिसरों का विश्लेषण

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

धातु आयन मान्यता और धातु बंधन Oligopeptides के Redox गतिविधि की संरचना और तंत्र का निर्धारण करने के लिए आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

नैनोमैटेरियल्स द्वारा अधिग्रहीत प्रोटीन और मेटाबोलाइट कोरोना के लक्षण वर्णन के लिए केपिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन उच्च-आदेश संरचना का अध्ययन करने के लिए डायथिलपाइरोकार्बोनेट के साथ सहसंयोजक लेबलिंग

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...