Name: an hs-mrm assay for the quantification of host-cell proteins in protein biopharmaceuticals by liquid chromatography ion mobility qtof mass spectrometry
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry at JoV

著者は、図 6 の原稿を準備するためレスリー Malouin と水株式会社からトニー カトリンを感謝したいです。

1. インフリキシマブ ダイジェスト (〜 24 時間手続き) の準備
<ol><li>重炭酸アンモニウム 50 ミリメートル、50 ミリメートル NH4HCO3, 500 mM ジチオトレイトール (DTT) 50 mM NH4HCO3と 50 mM NH4HCO3で 500 mM ヨードアセトアミド (IAM) の 1% アニオン界面活性剤の新鮮なソリューションを準備します。</li>
	<li>50 mM NH4HCO3750 μ L、インフリキシマブ mAb (10 mg/mL) 200 μ L と 1% アニオン界面活性剤溶液 50 μ L を追加し、0.05% アニオン界面活性剤の存在下で 60 ° C で 15 分のタンパク質を変性します。</li>
	<li>500 mM DTT の 40 μ L を追加し、20 mM DTT 存在下で 60 ° C で 60 分のサンプリングを軽減します。</li>
	<li>500 mM IAM の 20 μ L を追加し、アルキレート 〜 10 mM IAM の存在下で暗闇の中で部屋の温度で 30 分のサンプル。</li>
	<li>MS シーケンス グレード Lys C/トリプシンの 20 μ g を含むバイアルに遠心チューブの内容を追加し、37 ° C で 3 時間サンプルをダイジェスト</li>
	<li>MS シーケンス グレード Lys C/トリプシンのダイジェスト サンプル一晩 (12-15 h) 37 ° C で 20 μ g が含まれている別のバイアルに消化されたサンプルを転送することによって第二の酵素分注 (20 μ g) を追加します。</li>
	<li>夜通し分解後 100% ギ酸 (FA) の 5 μ l 添加し酸不安定なアニオン界面活性剤を分解する 37 ° C で 30 分間のダイジェストを孵化させなさい。</li>
	<li>アニオン界面活性剤の不溶性成分の沈殿物を遠心分離機で 4,000 x g で 15 分のダイジェストをスピンダウンします。</li>
	<li>インフリキシマブ ダイジェスト 〜 1,000 μ L を回復し、LC - オートサンプラー バイアル。ダイジェスト濃度は、〜 2 mg/mL をする必要があります。LC/MS システム解析の準備が整うまでは、-20 ° C で冷凍庫でダイジェストを格納します。</li>
</ol>2. スパイク ペプチド標準 (30 分程度)
<ol><li>室温でベンチにガラス瓶で冷凍のサンプルを置くことによってインフリキシマブ ダイジェストを解凍します。</li>
	<li>フォーからのすべての 6 ペプチド標準原液 1 μ M を準備する H2O 1 つウサギ ホスホリラーゼ b (フォー) ダイジェスト バイアルで FA (バイアルが含まれています各ペプチドの 1 nmol には) バイアルに含まれている 0.1 %1 mL を追加します。</li>
	<li>準備 4 x 1 mL 希釈溶液 0.1、1、10、および 100 nM ペプチド、0.1% を使用してを取得するフォー原液の希釈溶剤として FA。ガラス瓶 (LC 自動サンプラー バイアル) ですべての希釈を準備し、背景のマトリックスとしてすべてのバイアルにインフリキシマブ ダイジェストの 100 μ L を追加します。各 10 μ L 注入ダイジェスト背景に段の 2 μ g をロードします。希薄化後インフリキシマブ ダイジェストを含む空白のサンプルを準備 (、同じ 1:10 希釈)、ないスパイク ペプチド。</li>
</ol>3. LC/焦点電子データ取得方法のセットアップ
メモ: ワークフロー HS MRM 集録のセットアップに必要な手順をまとめた図 1 に描かれている、詳細セクション 3-6 に記載されています。各監視対象ペプチド、エレクトロ スプレー イオン化を次の最も豊富なペプチド イオンの親 m/z の保持時間を確立するデータに依存しない焦点Eデータセットの取得が必要し、対応する CCS (衝突クロスセクション) はイオン移動度の分離から派生します。さらに、データに依存しない dataset は、各ペプチド前駆体の 3 つの最も豊富なフラグメント イオンの m/z に関する情報を提供します。ワークフロー (CE 最適化) の 2 番目の手順では、アッセイの感度は各フラグメント イオンの高いイオン強度を得るために衝突細胞エネルギーをチューニングすることによって増加します。最後に、最後の手順で上記のすべてのパラメーターは監視各ペプチド HS MRM メソッド エディターを紹介します。
<ol><li>四重極飛行時間 (QTOF) 質量分析計データに依存しない取得法 (焦点E) を用いた超高性能液体クロマトグラフィー システムを結合の LC/MS 測定実験を行います。 注: 楽器の構成に関する詳細については、材料のセクションに含まれます。この楽器は、ペプチド前駆体10の分離のための旅行波イオンのモビリティのデバイスを使用します。</li>
	<li>準備 0.1% 水 (溶媒) で FA および 0.1% を含む 2 つの移動相アセトニ トリル (溶剤 B) で FA。 注: は、スパイク mAb ダイジェストの分離の荷電表面ハイブリッド (CSH) C18 カラム (2.1 × 150 mm、充填 1.7 μ m 粒子) を使用します。</li>
	<li>データ集録ソフトウェア「作成/分析法」をクリックしてし「買収の生成と処理方法」を選択メソッド名を入力、メソッド フォルダー (ディレクトリ) を参照し、「次へ」をクリックしてください</li>
	<li>「分析型」の「ペプチド マップ (IMS)、"を選択し、"楽器システム"タブで「第四紀溶剤マネージャー」計測器を選択します。200 μ L/分使用溶剤 B 30 分は続く 2 分列洗浄 40 %1 からグラジエントの流量でペプチドの分離を達成するためにグラデーションの設定を編集し、50 分の総ランタイムでの 9 分平衡をこれらの実験的導入LC メソッド エディターのパラメーター。</li>
	<li>「楽器システム」タブで「サンプル マネージャー」計測器を選択します。カラム温度 60 ° c と 10 ° C にサンプル温度を設定します。</li>
	<li>正イオン ESI 感度モード、30,000 の半値幅の典型的な解像力 QTOF 質量分析計を動作します。 注: LC/焦点Eは急速に (衝突の細胞) に衝突エネルギーを交互にスキャンを集めることによって動作するデータ集録 (DIA) モード (MS チャネル 1 スキャンの 6 V) の低エネルギーと高エネルギー (15-40 V ランプにMS チャネル 2 の前駆体選択なし断片化スペクトルを生成します)。<ol>
<li>データ集録ソフトウェアのデフォルト ソース関連 MS パラメーターを入力:「私の仕事/楽器システム、」"ヴィオン IMS Qtof"タブを選択「ツール」メニューでこれらのパラメーターを入力から: 3.0 kV キャピラリー電圧、100 ° C ソース温度、100 V のソースオフセット、50 L/h 円錐コーン電圧 40 V と流れ。脱溶媒温度を 250 ° C、500 L/h、脱溶媒ガス流量および 3.0 にキャピラリー電圧に設定 kV。</li>
		<li>データ集録ソフトウェア「作成/分析法」をクリックしてし「買収の生成と処理方法」を選択メソッド名を入力メソッド フォルダー (ディレクトリ) を参照し、「次へ」をクリックしてください</li>
		<li>「分析型」の「ペプチド マップ (IMS)、"を選択し、"楽器システム"タブで"ヴィオン IMS QTof"計測器を選択します。「完了」をクリック 注: 新しく作成された LC/焦点Eメソッドは「楽器法の構成」画面自動的に開きます。</li>
		<li>「設定」タブでこれらのパラメーターを入力: 3.0 kV キャピラリー電圧、100 ° C ソースの温度溶媒温度を 250 ° C、50 L/h 円錐形ガス フロー、および 500 L/h 脱溶媒ガスの流れ。</li>
		<li>「実験」タブの設定で「高精細 MSE」を選択し「分析法ランタイム」を選択「スキャン設定」タブでこれらパラメーターを入力: 質量 100;高質量、2,000;スキャン時間、400 さん「CE」タブで、「6 V」の省エネ設定を入力し「無効データ縮小」チェックがあることを確認 (動) 40 15 から高エネルギー ランプを選択します。</li>
		<li>50 ng/mL ロイシン エンケファリン (ル) 0.1% と 50% アセトニ トリルで準備のソリューションを吹き込むデータ集録中にロック質量校正用 10 μ L/分の流量で FA。 注: 同じ質量範囲にわたって同じレートを使用して 5 分ごとロック-大量のデータを取得します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(読み込まれている量の列は各ペプチド標準 100 fmol) サンプルの 10 μ L 注入によって上記 LC/焦点Eアッセイを用いた 10 nM、フォー スパイク サンプルを分析します。</li>
</ol>4. 衝突エネルギー (CE) 最適化法 Tof MRM のセットアップ
<ol><li>LC/焦点Eデータセットから各フォー ペプチド フラグメント イオン m/z、前駆体、リテンション時間を取得します。M/z との最も豊富な充電状態を保持フラグメント イオンを前駆イオンと対応する 3 つの最も豊富な。 注: 通常 LC/焦点Eアッセイによって記録される低エネルギーと高エネルギーのスペクトルの例は図 2 の表示です。</li>
	<li>SRM/MRM 実験で衝突エネルギー (CE) の最適化を使用して、各ペプチド23の最高の信号を取得します。<ol>
<li>データ集録ソフトウェア「作成/分析法」をクリックしてし「買収の生成と処理方法」を選択メソッド名を入力、メソッド フォルダー (ディレクトリ) を参照し、「次へ」をクリックしてください</li>
		<li>「分析型」の「数量」を選択「数量アッセイ Tof 2次元クロマトグラフィー"を選択し、"次へ"をクリックしてください「楽器システム」タブで「ヴィオン IMS QTof」を選択し、「完了」をクリック 注: 新しく作成された Tof MRM メソッドは「楽器法の構成」画面自動的に開きます。</li>
		<li>「設定」タブでこれらのパラメーターを入力: 3.0 kV キャピラリー電圧、100 ° C ソースの温度溶媒温度を 250 ° C、50 L/h 円錐形ガス フロー、および 500 L/h 脱溶媒ガスの流れ。</li>
		<li>「実験」タブの設定で「関数テーブル」を選択し、「1 つまたは複数 MS、MSM、MRM 関数」各ペプチド「Tof MRM」機能を設定する 3「切り替え効果」(最も豊富な前駆体とその最も豊富なフラグメント イオンの 3 つの組み合わせ) を入力して下向きの矢印を使用して。 注: Tof MRM では、最高感度が得られますスケジュールされた MRM アプローチ。</li>
		<li>「Tof MRM」関数エディターでペプチドの溶出順序に従って整理される各ペプチド (少なくとも 1 分)、1 つの保持時間ウィンドウを選択します。「Tof MRM」関数エディターで挿入ペプチド前駆体 m/z と製品 m/z;ペプチド前駆体; の「低」(4 Da ウィンドウ) としてクワッド分離ウィンドウを選択します。100 ms; 固定スキャン時間を選択します。14-36 V の範囲で 12 の異なる衝突エネルギー値を次のように選択と: 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、および 36、図 3 の例で示すように。 注: 上記 Tof MRM 法、クロマトグラフィーのピークあたり少なくとも 10 のデータ ポイントは指定各 CE の各遷移に対して収集されます。データ ファイルのサイズを減らすためには、フラグメント イオンの信号 (6 Da ウィンドウ) の「ワイド」のオプションを選択します。CE 最適化値の例を表 2 に示します。</li>
		<li>(読み込まれている量の列は各ペプチド標準 100 fmol) サンプルの 10 μ L 注入によって上記 Tof MRM アッセイを用いた 10 nM、フォー スパイク サンプルを分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 最終 HS MRM 買収ペプチド前駆体のイオン移動度の分離を使用したペプチドの定量化法のセットアップ
<ol><li>データ集録ソフトウェアの「調査」メニューのすべてのペプチドの各 CE 用に生成されたすべての 11 ガスクロマト グラフ トレースを表示し、「処理オプション/操作」ツールバーから「統合」ボタンを使用してピークを統合最高のピーク領域は、各遷移に対して最高の CE を示されます。</li>
	<li>3 各ペプチド断片の最高のピーク面積を比較し、保持は最高の「移行」(フラグメント イオン最も強烈な信号を生成する);表 2 には、最高 4 つのフォー ペプチドから得られる「切り替え効果」が表示されます。</li>
	<li>ペプチドあたり 1 つだけのフラグメント イオンを含む HS MRM メソッドをセットアップします。LC/焦点Eデータセットから各ペプチド前駆体の CCS の値を使用します。<ol>
<li>前のセクション (セクション 4) で作成した Tof MRM メソッドを修正するには、「Tof MRM」関数ではなく「HS MRM」関数を選択します。</li>
		<li>「HS MRM」関数エディターで次の前駆体関連パラメーターを入力: m/z、四重極の解像度: (4 Da) を低、充電状態、前駆体 CCS 値および前駆体 CCS 解像度: 低。製品イオンその m/z、最適な衝突エネルギーを入力、0.4 s の選択スキャン時間を選択に含めるすべての同位体の「ワイド」スペクトル設定 (6 Da)。すべての 4 つのペプチド最終 HS MRM 獲得手法の例である図 4. します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルの分析すべて空白の mAb のダイジェストから始まる HS MRM メソッドを使用して (非スパイク サンプル)、4 複製注射 (各 10 μ L) 以下の濃度の続く: 0.1、1、10、および 100 nM フォー ペプチド。</li>
</ol>6. HS MRM データセットの解析処理手法の作成
<ol><li>HS MRM データセットの分析のための処理メソッドを作成します。<ol>
<li>「HS MRM」データ取得メソッドは、分析法、「目的」タブをクリックして「コンポーネントを管理」を選択、</li>
		<li>下「実験型」ドロップ ダウン メニューから「HS MS/MS/HS MRM」オプションを選択します。</li>
		<li>「作成/新規エントリ」をクリックしてし、処理メソッド エディターで以下パラメーターを紹介: ペプチド保持時間 (RT) 前駆体充電状態、前駆体 m/z、および前駆体ドリフト時間 (DT).フラグメント イオンの質量と電荷の状態を入力し、抽出モードとして"XIC"トレースを指定します。</li>
		<li>同じ「HS MRM」獲得法「目的」タブ、「初期設定額」をクリックしてし下記の濃度を入力: 0.1、1、10、および 100 nM フォー ペプチド。</li>
		<li>「処理/抽出設定」で以下のパラメーターを入力してください: デフォルトの質量許容値、10 ppm (すべてのフラグメント イオンの m/z) の時、5% のドリフトの既定フォー ペプチドの処理方法の例については、図 5 に示すです。</li>
		<li>校正型線形カーブ フィット 1/2加重 X を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HS MRM データすべてのクロマト グラムを統合し、各フォー ペプチドの検量線を作成するプロセス。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutic+proteins+by+comprehensive+online+two-dimensional+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry.</a> MAbs. 4, 24-44 (2012).</li><li>Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+host-cell+protein+impurities+in+biotherapeutics+using+mass+spectrometry.">Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry.</a> Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+tracking+of+host-cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry.">Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6, 659-670 (2014).</li><li>Farrell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+host-cell+protein+analysis+using+two-dimensional+data+independent+LC-MS(E).">Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E).</a> Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).</li><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography.">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).</li><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+identification+and+quantification+of+host+cell+proteins+(HCPs)+in+biotherapeutics+using+liquid+chromatography+mass+spectrometry.">Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry.</a> Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques. , 357-393 (2015).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+co-elution+of+host-cell+proteins+with+monoclonal+antibodies+during+protein+A+purification.">Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification.</a> Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).</li><li>Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometry+based+approach+to+host+cell+protein+identification+and+its+application+in+a+comparatibility+exercise.">A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise.</a> Anal Biochem. , 1-6 (2014).</li><li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+characterization+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions,+LC/MS/MS+and+multivariate+analysis.">Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis.</a> MAbs. 7, 1128-1137 (2015).</li><li>Giles, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+trevelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide.">Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).</li><li>Anderson, V., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins.">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).</li><li>Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+for+quantitative+proteomics:+a+tutorial.">Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).</li><li>Picotti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+generation+of+selected+reaction-monitoring+assays+for+proteins+and+proteomes.">High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes.</a> Nat Methods. 7, 43-46 (2010).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+using+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+with+mass+spectrometry.">Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+quantitation+of+proteins+by+mass+spectrometry.">Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry.</a> Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).</li><li>Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+absolute+protein+quantification.">Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification.</a> J Vis Exp. (102), (2015).</li><li>Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Range+of+protein+detection+by+selected/multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+in+an+unfractioned+human+cell+culture+lysate.">Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate.</a> Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).</li><li>Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+dynamic+range+proteome+analysis+of+S.+cerevisiae+by+targetted+proteomics.">Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics.</a> Cell. 138, 795-806 (2009).</li><li>Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+specific+is+my+SRM:+the+issue+of+precursor+and+product+ion+reductancy.">How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy.</a> Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).</li><li>Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+innacurate+and+imprecise+transitions+in+peptide+quantification+by+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry.">Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry.</a> Clin Chem. 56, 291-305 (2010).</li><li>Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+to+detect+and+avoid+redundancy+in+selected+reaction+monitoring.">A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).</li><li>Bao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+interference+in+SRM+analysis.">Detection and correction of interference in SRM analysis.</a> Methods. 61, 299-303 (2013).</li><li>Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+collision+energy+optimization+on+the+measurement+of+peptides+by+selected+reaction+monitoring+(SRM)+mass+spectrometry.">Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).</li><li>Mbasu, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+quadrupole+and+time-of-flight+mass+spectrometry+for+peptide+MRM+based+translational+reserch+analysis.">Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis.</a> Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).</li></ol>

すべての著者は、いくつかの試薬とこの記事で使われている楽器のプロデューサーである水株式会社の従業員です。

高解像度 (Rs > 20,000) 質量分析法は各種計測器プラットフォームに治療用タンパク質の構造解析に使用します。対照的に、MS を用いたタンパク質定量は通常に対して SRM/MRM によって低解像度 (Rs 〜 1,000) タンデム四重極質量分析計署名ペプチッド蛋白質11,12の酵素の開裂によって生成されたを使用して,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. 一つ次元のクロマトグラフィー分離は完全に酵素消化によって生成される複雑なペプチド混合物を解決できない、ペプチド共溶出は単一タンパク質ダイジェストの場合でも、頻繁に発生します。非常に複雑なタンパク質ダイジェスト (例えば、治療用タンパク質によって生成されるペプチドが豊富な背景の存在下で釣り合いの 1-100 ppm の定量化のため)、感度、精度、または SRM/MRM の直線性の試験を受けます干渉。
SRM/MRM アッセイ前駆体/フラグメント大衆の「ユニークな」組み合わせにのみ依存する 1 次元的な選択があります。ペプチド背景が予期せずに変更されたときの状況でこれらの試このため、失敗 (例えば、バイオ医薬品サンプルの別の精製の手順から得られた)。これらの制限を克服するために提案するここで、イオンの移動が有効な高分解能四重極飛行時間 (QTOF) ハイブリッド質量分析計に実装されている選択度の高い (HS) MRM アッセイ (楽器図、図 6 を参照してください)。
楽器その他共同溶出 (干渉) ペプチド前駆体からイオン移動性細胞の興味のペプチッドの前駆体を分離、四重極の前駆体の完全同位体の封筒を分離、固定 ce の断片、衝突のセルです。その最も豊富なペプチド フラグメントによって生成される信号は、フル スキャンと同様全てのイオンよりもむしろ飛行管に質量領域を選択的にプッシュ プッシャー周波数 (ターゲット強化) を調整することによってさらに強化されます。このフラグメント イオンによって生成される高 MS 分解能 (Rs 〜 30,000) 信号を用いたペプチドの定量化を行い。SRM/MRM アッセイと比べると、HS MRM アッセイは、2 つの選択性の追加レベルを提供しています: 中 2 番目は、TOF アナライザーの増加質量分解能によって提供される前駆体レベルのイオン移動度分離によって提供されます。これらの選択性の改善によってもたらされる結果は、HS MRM クロマト グラム、図 7 に表示される 3 桁間干渉の自由であるに表示されます。
SRM/MRM アッセイとは異なり HS MRM アッセイを最適化するために調整することができますいくつかのパラメーターがあります: ペプチド前駆体 (通常は 0.2 分に設定)、四重極分離ウィンドウ (4 Da)、漂流期間 RT ウィンドウ周辺、前駆体 (対応するイオン mobilogram から前駆体のピークの半値幅 ±)、およびフラグメント イオン (20,000-40,000) の MS の解像度。HS MRM アッセイは非常に敏感な: 各フォー ペプチッドのための最低の検出量が 1 フェムトモル カラム (または 0.1 nM ペプチド濃度の観点から)。ペプチド MW を考慮した場合 (正確な MWs の表 1 を参照)、量検出柱には 1-2 pg 程度 mAb ダイジェストから背景ペプチドの有意に高い量 (2 μ g) 列が読み込まれます。
スパイクのペプチドが由来した実物大のフォー蛋白質 (97.2 kDa) の分子量を考えると、アッセイ高豊富な背景イオン存在下におけるタンパク質不純物の 50 ppm を検出することができます。(5-10 ppm) の検出下限は低分子量釣り合い (10-20 kDa) ため達成されます。アッセイは、1 〜 1,000 ppm の範囲で釣り合いを測定することができますを意味する 3 桁 (図 8 から検量線で示すように) をカバーしています。また、表 3 に示す HS MRM アッセイの再現性は小分子の SRM/MRM アッセイ、ピーク面積よりも 15 %rsds の再現性と非常によくマッチします。
モノクローナル抗体 (mAb) ダイジェストでスパイク ペプチド標準の定量化のための新規アッセイの機能を探検し、感度と広いダイナミック レンジ (少なくとも 3 つの桁) を通常カバーするためのユーティリティを実証HCP 解析で発生しました。すべての六つのペプチド基準 0.1 の低濃度で検出された高い豊富なペプチド背景 (mAb ロード ダイジェストの柱の 2 μ g) の存在下で nM (1 フェムトモル 2.1 ミリメートル ID ガスクロマト グラフ列に読み込まれて)。対象となる人事とイオン移動性前駆体分離により、HS MRM アッセイ バイオ医薬品の複数のバッチにわたって複数 HCPs の高速、高スループットの監視測定になるための素晴らしい可能性があります。

工業用の巨大生体分子 (タンパク質) の定量化 (例えばElisa)、イムノアッセイにいくつかの利点のために主に在住: 感度、高スループット、使いやすさ、サンプルあたりの低コスト。これらの生物学的アッセイは、通常彼らが HCP 濃度 (通常 ppm または ng HCP/mg mAb で表されます) を提供低豊富な蛋白質の不純物 (宿主細胞蛋白質 (HCPs) の 1 ~ 100 ppm) タンパク質医薬品の存在を分析に適用する場合個々 の HCP 汚染物質の測定し、識別できません。Elisa を補完するためにまたは Elisa 失敗1,2,3,4,5,6を提供する情報を提供するために、いくつか MS に基づく試金が最近開発されました。,7,8,9. サンプルの複雑さと濃度 (少なくとも 3 桁の衝突) の広いダイナミック レンジで、HCP ペプチドを検出するための要件のため広範なサンプル分別を入札多次元クロマトグラフィー法が従来低豊富な釣り合い1,2,3,4,5,6,7を識別するために雇われています。
自然なステップ次の HCP 識別と検証は HCP 追跡 (監視) バイオ医薬品の複数のバッチにわたって。このような状況で一つ次元 LC/MS メソッドはサンプル スループット8,9を改善するために提案されている.ただし、精度および HCP の動的範囲測定可能性があります受けます 1 D の液体クロマトグラフィー/質量分析でバイオ医薬品ペプチドの圧倒的な存在感。多次元分離と比較して、信号干渉19,20,21,22の可能性が増加一つ次元のクロマト グラフ分離のための確率前駆体ペプチドより共同溶出するが増加します。クロマト グラフ分離時間を延長することがなくペプチド前駆体を分離する直交という定款明確に有利でしょう。旅行波イオン移動度 (TWIM)10ミリ秒単位で輻輳の MS スペクトルを解決する機能があります。約 500 のモビリティの色分解を実行できる日中の 10 の完全クロマト ピーク幅と仮定して単一ペプチドの溶出 s とイオン移動度計測器の IM 分離のランタイムは 20 ms であることを考えます。
プロテインの定量のための質量分析法によるアッセイ開発しました過去 10 年間広く受け入れられて使用して選択 (複数の) 反応アプローチ (SRM/MRM 法) タンデム質量分析計11、実装を監視 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,,2223。この低解像度の質量分析の制約の 1 つは干渉現象19,20,21,22興味のペプチッドが「同じ」を観察前駆体とフラグメント質量その他共同溶出ペプチド存在 (1 Da ウィンドウ) 内でサンプル。SRM/MRM メソッドの精度を向上させる 2 つの方法があります: 1 つのオプションは、他のオプションに前駆体/フラグメント検出の MS の解像度を上げるには干渉の前駆イオンを削除する前駆体レベルで余分な分離ステップMS 信号の重複を避けるため。説明、選択度の高い (HS) MRM アクイジション ・ モードはここで高解像度 (Rs 〜 30,000) とペプチド前駆体のイオン移動度分離を結合することによりこれらのアプローチの両方の利点を取りますペプチド フラグメントの MS 検出。アッセイは、SRM/MRM プロテオミクス実験17,18,24で観測されたダイナミック レンジは、通常、少なくとも 3 つの注文の大きさのカバーを紹介します。
HS MRM アッセイ HCP 定量化のためのユーティリティは、モノクローナル抗体ダイジェストで異なる濃度 (0.1-100 nM の範囲) でスパイク 6 ペプチド基準によって生成された信号の直線性を監視することによって示されました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vion IMS Qtof mass spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186009214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186015041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186015040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity H-Class Column Manager (CM)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186015043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>40867-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 &#181;m particles</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186005298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, eluent additive for LC/MS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56302-10X1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I-1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vials (12x32 mm glass vials, screw neck)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000327c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine Enkephalin acetate salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9133-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind 2.0 mL tubes (2x50)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 &#181;g)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39253-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an hs-mrm assay for the quantification of host-cell proteins in protein biopharmaceuticals by liquid chromatography ion mobility qtof mass spectrometry

低レベル (1-100 ppm) タンパク質中の不純物 (例えば、宿主細胞蛋白質 (HCPs)) タンパク質バイオ分析は高感度・広ダイナミック レンジを必要とする挑戦的な試金。一般にタンパク質の質量分析を用いた定量アッセイ (SRM/MRM) 低解像度 (Rs 〜 1,000) タンデムを使用してペプチッドの定量化を監視選択的反応モニタリング/複数反応に続いて蛋白質消化四重極質量分析計。このアプローチの限界の 1 つは興味のペプチッドはサンプル (1 Da ウィンドウ) 内で現在他の共同溶出ペプチドとして (m/z 値) の面で「同じ」前駆体フラグメントよぶに、時観察干渉現象です。この現象を避けるためには、別の質量分析によるアプローチ、ペプチド前駆体のイオン移動度分離を兼ね備えた高解像度 (Rs 〜 30,000) 高選択性 (HS) MRM アッセイを提案するペプチド フラグメントの MS 検出。モノクローナル抗体 (mAb) ダイジェストでスパイク、感度やダイナミック レンジ (少なくとも 3 桁の衝突) 通常、医療従事者で実現した低豊富なペプチド基準を定量化するこのアプローチの機能を調べた。解析。すべての六つのペプチド基準 0.1 の低濃度で検出された高い豊富なペプチド背景 (mAb ロード ダイジェストの柱の 2 μ g) の存在下で nM (1 フェムトモル 2.1 ミリメートル ID ガスクロマト グラフ列に読み込まれて)。スパイクのペプチドを抽出したウサギ ホスホリラーゼ (97.2 kDa) の MW を検討する際、このアッセイの LOQ は 50 ppm より低い。ピーク面積の相対標準偏差 (RSD) (n = 4 の複製) 調査全体の濃度範囲にわたって 15% 未満であった (0.1-100 nM または 1 〜 1,000 ppm) 本研究で。

フォー ペプチド混合物に含まれる 6 ホスホリラーゼ b ペプチド基準の個々 のシーケンス テーブル 1、その保持時間と共に表示され、焦点Eにみられる彼らの最も豊富な前駆体の実験します。高選択性 (HS) MRM アッセイの開発の最初のステップは、その対応のほとんどと一緒に各フォー ペプチドの溶出時間を確立焦点Eデータセットの取得豊富な前駆体および 3 つの最も豊富な断片。図 2 は、インフリキシマブ ダイジェストでスパイク フォー ペプチド (Pep 6) のいずれかの取得焦点電子スペクトルを表示します。3 位各ペプチドの「切り替え効果」(前駆体とフラグメント大衆の組み合わせ) を確立した後、Tof MRM 実験各ペプチド生成された信号最大にする最適な衝突エネルギーが見つけるされます。CE 最適化の実験の結果を表 2 にまとめます。最終 HS MRM アッセイ (図 4 を参照) のみベスト各ペプチドの「転移」を保持し、、すべての試料の分析に使用。すべての濃度を調査対象 4 フォー ペプチドに対して生成された HS MRM クロマト グラムの例は、図 7 に掲載されています。図 8 図 7 HS MRM ピークの統合が表示されます各ペプチド次の 4 つの較正曲線が得られます。さらに、ピーク面積相対標準偏差、計算に基づいて 4 複製注射は、表 3 に示すように 4 つのテーブルのとおりです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ペプチド</td>
			<td colspan="2">ペプチド</td>
			<td>保持</td>
			<td colspan="4">充電状態</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">シーケンス</td>
			<td>時間 (分)</td>
			<td>+ 1</td>
			<td>+ 2</td>
			<td>+ 3</td>
			<td>+ 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 1</td>
			<td colspan="2">VLYPNDNFFEGK</td>
			<td>19.4</td>
			<td>1442.6951</td>
			<td>721.8512</td>
			<td>481.5699</td>
			<td>361.4292</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>1874.9065</td>
			<td>937.9569</td>
			<td>625.6404</td>
			<td>469.4821</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 3</td>
			<td colspan="2">IGEEYISDLDQLRK</td>
			<td>18.9</td>
			<td>1678.8646</td>
			<td>839.9360</td>
			<td>560.2931</td>
			<td>420.4716</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>1440.7369</td>
			<td>720.8721</td>
			<td>480.9172</td>
			<td>360.9397</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>1890.0080</td>
			<td>945.5076</td>
			<td>630.6742</td>
			<td>473.2574</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17.7</td>
			<td>1262.5939</td>
			<td>631.8006</td>
			<td>421.5362</td>
			<td>316.4039</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1。フォー インフリキシマブ ダイジェストでスパイク量産準備ミックスに含まれるペプチド基準。ペプチド保持時間および彼らの最も豊富な前駆体 (太字で強調表示) を表形式で表示します。
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ペプチド</td>
			<td colspan="2">ペプチド</td>
			<td>保持</td>
			<td colspan="2">ペプチド前駆体</td>
			<td colspan="3">最も豊富なフラグメント イオン/料金</td>
			<td>最適</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">シーケンス</td>
			<td>時間 (分)</td>
			<td>m/z & 料金</td>
			<td>ドリフト時間 (ミリ秒)</td>
			<td>私</td>
			<td>II</td>
			<td>III</td>
			<td>CE (V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>625.6404 (+3)</td>
			<td>6.2</td>
			<td>714.3781 (+1)</td>
			<td>807.4177 (+2)</td>
			<td>827.4621 (+1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>720.8721 (+2)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>865.4050 (+1)</td>
			<td>964.4734 (+1)</td>
			<td>1214.5688 (+1)</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>630.6742 (+3)</td>
			<td>6.3</td>
			<td>642.3570 (+1)</td>
			<td>689.8391 (+2)</td>
			<td>832.4236 (+2)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17.7</td>
			<td>631.8006 (+2)</td>
			<td>7.0</td>
			<td>830.3931 (+1)</td>
			<td>945.4200 (+2)</td>
			<td>1016.4571 (+1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。Tof MRM 最適化実験結果: 本研究で定量化各フォー ペプチドの 3 つの最も豊富な断片が示され、対応する最適化された衝突エネルギー。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンク</td>
			<td>量</td>
			<td colspan="6">Pep 2 ピーク面積 (表 3 a)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>柱に (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>意味</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>439</td>
			<td>462</td>
			<td>431</td>
			<td>456</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>5121</td>
			<td>4842</td>
			<td>5198</td>
			<td>4842</td>
			<td>5001</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>63853</td>
			<td>64279</td>
			<td>66111</td>
			<td>62509</td>
			<td>64188</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>612392</td>
			<td>605553</td>
			<td>613229</td>
			<td>611004</td>
			<td>610545</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コンク</td>
			<td>量</td>
			<td colspan="6">Pep 4 ピーク面積 (表 3 b)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>柱に (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>意味</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>275</td>
			<td>359</td>
			<td>325</td>
			<td>288</td>
			<td>312</td>
			<td>12.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>3559</td>
			<td>3694</td>
			<td>3287</td>
			<td>3754</td>
			<td>3574</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>45259</td>
			<td>45775</td>
			<td>42976</td>
			<td>45548</td>
			<td>44890</td>
			<td>2.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>459374</td>
			<td>467927</td>
			<td>436272</td>
			<td>458994</td>
			<td>455642</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コンク</td>
			<td>量</td>
			<td colspan="6">Pep 5 ピーク面積 (表 3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>柱に (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>意味</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>3194</td>
			<td>3243</td>
			<td>3202</td>
			<td>3257</td>
			<td>3224</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>31464</td>
			<td>31150</td>
			<td>31464</td>
			<td>31433</td>
			<td>31378</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>313638</td>
			<td>320712</td>
			<td>311943</td>
			<td>311943</td>
			<td>314559</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>2845736</td>
			<td>2840031</td>
			<td>2882006</td>
			<td>2864052</td>
			<td>2857956</td>
			<td>0.7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コンク</td>
			<td>量</td>
			<td colspan="6">Pep 6 ピーク面積 (表 3 D)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>柱に (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>意味</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>583</td>
			<td>440</td>
			<td>440</td>
			<td>488</td>
			<td>13.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>6429</td>
			<td>6429</td>
			<td>6848</td>
			<td>6623</td>
			<td>6582</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>71295</td>
			<td>70400</td>
			<td>71563</td>
			<td>70400</td>
			<td>70915</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>707640</td>
			<td>707640</td>
			<td>694461</td>
			<td>729490</td>
			<td>709808</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3。HS MRM クロマト グラムのピーク面積を含むテーブルは各 LC/MS 射出 (16 LC/MS 実行およびテスト 4 濃度) 4 フォー ペプチド (Pep 2、4、5、および 6) の記録。 相対標準偏差は調査全体の濃度範囲ですべてのペプチドよりも 15% だった。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig1.jpg"> 図 1。HS MRM の獲得方法を設定するために必要な 3 つのステップを要約するワークフロー ダイアグラム。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig2.jpg"> 図 2。HDMSE データの例: (A) 低エネルギー スペクトル Pep 6 前駆イオンを示します。(B) 高エネルギーの断片化、トップ 3 の最も豊富なフラグメント イオン (円内) Tof MRM 衝突エネルギー最適化のための選択を表示する、同じペプチドのスペクトル。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig3.jpg"> 図 3。Tof MRM 最適化を設定するために使用されるパラメーターの実験します。 各遷移に対して (16 に 36 V の範囲) の 11 の衝突エネルギーがテストされました。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig4.jpg"> 図 4。最終 HS MRM メソッドの例です。 いくつかのパラメーターが各トランジション、ペプチド前駆体 m/z の電荷状態とイオン移動度ドリフト時間、最も豊富なフラグメント イオン、最適な衝突エネルギーと MS のアクイジション時間の m/z を含む必要です。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig5.jpg"> 図 5。HS MRM のデータセットを分析するための処理方法によって使用される設定。 各ペプチド「移行」ペプチド前駆体 m/z で記述された単一によって監視されて、充電状態、および最も豊富なフラグメントとその充電状態の m/z に沿って保持時間を予想します。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig6.jpg"> 図 6。イオン移動度質量分析計の図。 他共同溶出 (干渉) ペプチド前駆体からイオン移動度セル、四重極、別に分離し、固定衝突エネルギーと断片化された HS MRM アクイジション ・ モード定量化するペプチド前駆体が区切られて、衝突のセルです。ペプチド フラグメント イオンの生成する信号がプッシャー周波数を調整することによって向上し、高 MS 分解能を用いたペプチドの定量化を行い (> 30,000) 各ペプチドが最も強烈なフラグメント イオンによって生成される信号。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2.jpg"> 図 7。4 異なる濃度で 3 桁に及ぶ 4 フォー ペプチド HS MRM クロマト グラムを記録した (0.1、1、10、および 100 nM)。 (A) pep 2 クロマト グラム、Pep (B) 4 のクロマト グラム、(C) ペップ 5 クロマト グラム、および (D) ペップ 6 クロマト グラム。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2.jpg"> 図 8。4 異なる濃度で 4 フォー ペプチド較正曲線 (0.1、1、10、および 100 nM)。 各曲線の下のテーブルは、各テーブルから 2 番目の列が予想される線形応答からの偏差率を示しています中に各注入の記録された個々 のピーク面積 (Y の値) を表示します。(A) pep 2 校正、(B) ペップ 4 校正、(C) ペップ 5 校正、および (D) ペップ 6 校正。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

ここでは、高解像度 (〜 30,000) の MS モノクローナル抗体のスパイク ペプチド水準の定量化のためのペプチド断片の検出続くペプチド前駆体のイオン移動度分離と相まってガスクロマト グラフ分析について述べるダイジェスト。

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

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超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

分取薄層クロマトグラフィーおよびMALDI-TOF質量分析によってバット外皮脂質中トリアシルグリセリドの内容をプロファイリング

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Analyzing the Photo-oxidation of 2-propanol at Indoor Air Level Concentrations Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry

フィールド非対称イオン移動度分析法を用いた室内空気レベルの濃度で 2-プロパノールの光酸化反応の分析

We demonstrate a versatile protocol to be used for determining the effectiveness of photocatalysts in degrading indoor air concentration (ppb) volatile ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

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Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

金属イオン認識の構造とメカニズムを決定するイオン移動質量分析技術と金属結合オリゴペプチドの酸化還元活性

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...