Name: defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2017-03-02T15:00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet med priser fra UK regenerativ medicin Platform (MRC MR / L022974 / 1 og MR / K026666 / 1) og en Kina Scholarship.

BEMÆRK: Sælger oplysninger for alle reagenser i denne protokol er blevet anført i tabel 1. Alle medier / plader skal være sterile og mindst ved stuetemperatur, når cellerne skal have direkte kontakt med dem. 1. Passage menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) onto laminin 521 BEMÆRK: Cellen passage beskrevet nedenfor er baseret på enkelte celler og er ideel til afledningen af ​​en homogen population af hepatocyt-lignende celler fra hPSCs. Colony plating gælder også og er blevet beskrevet tidligere 24. <ol><li> Forbered laminin-overtrukne plader efter behov. <ol><li> Optø 100 ug / ml stamopløsning af rekombinant laminin 521 (LN-521) ved 4 ° C. </li><li> Fortynd den optøede LN-521 i iskold 1x DPBS (med Ca2 + / Mg2 +) til fremstilling af en 5 ug / ml opløsning. </li><li> Tilsæt 1 ml 5 ug / ml LN-521-opløsning til at coate en brønd af en 6-brønds pladeog rock til at sprede det jævnt i brønden. </li><li> Inkubér pladerne i en 37 ° C / 5% CO2 cellekultur inkubator i 2 - 4 timer til akut brug eller i et 4 ° C køleskab natten over. </li><li> laminin-overtrukne plader opbevares i et 4 ° C køleskab efter behov. Hold pladerne på en flad overflade og forsegle dem til at undgå fordampning og forurening. BEMÆRK: Lad aldrig coatede brønde tørre ud; top dem op med ekstra 1x DPBS (med Ca2 + / Mg2 +), hvis det kræves. Brug pladerne inden for 2 uger. </li></ol></li><li> Skal det nødvendige antal af præcoatede plader til stuetemperatur før anvendelse eller Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 0,5 - 1 time. </li><li> aspireres forsigtigt belægningen LN-521-opløsning uden at beskadige den belagte overflade. Bemærk: Det er vigtigt ikke at beskadige den belagte overflade, før såning celler på den. </li><li> Tilføj straks 1 ml forvarmet-mTeSR1 medium suppleret med 10 pM Rho-associeret kinase (ROCK) inhibitor Y27632 til en brønd af en 6-brønds plade. Efterlad pladen i cellekultur inkubator til at modtage celler. BEMÆRK: Lad aldrig laminin brønde til tørre. </li><li> Aspirer medium fra velholdte hPSCs ved ca. 75% til 85% sammenflydning. Vask cellerne fra en brønd i en 6-brønds plade gang med 1 ml stuetemperatur 1x DPBS (ingen Ca2 + / Mg2 +). </li><li> Tilsæt 0,5 mL 1x Accutase til cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 6 - 8 minutter at dissociere cellerne. BEMÆRK: For at kontrollere, om fordøjelsen er lang nok, eller ikke, blidt tryk på pladen og kontrollere, om cellerne kan løsrive nemt. Hvis ja, så er det tid til at stoppe den enzymatiske reaktion; hvis ikke, forlænge fordøjelsen til en ekstra 1 - 2 ud min. </li><li> Afslut dissocieringen ved tilsætning af 2 ml frisk mTeSR1 medium suppleret med 10 pM Y27632 til cellerne. Pipette op og ned med en P1000 tip flere gange for at foretage en enkelt-cellesuspension. </li><li> Tæl levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer.Brug Trypan Blue til pletten og udelukke døde celler 14 </li><li> Beregn det samlede antal celler, der er nødvendige. Til rutinemæssig hPSC passage, frø 4 x 10 5 til 5 x 10 5 celler pr brønd i en 6-brønds plade (dvs. 4,21 x 10 4 til 5,26 x 10 4 pr cm2). For passage hPSCs for hepatocyt differentiering, frø 6.5 x 10 5 til 7,5 x 10 5 (dvs. 6,84 x 10 4 til 7,89 x 10 4 pr cm2) celler pr brønd i en 6-brønds plade. BEMÆRK: seeding tæthed for hver cellelinje måske brug mindre optimering baseret på det empiriske tæthed givet her hepatisk differentiering. </li><li> Overfør den nødvendige cellesuspension i en steril 15 ml eller 50 ml centrifugerør og centrifugeres ved 115 xg i 3 min ved stuetemperatur. </li><li> Aspirer supernatanten langsomt og derefter resuspender cellepelleten i frisk, varm mTeSR1 medium suppleret med 10 pM Rho-associeret kinase (ROCK) inhibitor Y27632, ved hjælp af en passende medium til at gøre den ønskede celletæthed. BEMÆRK: Brugen af ​​ROCK inhibitor er stærkt anbefales for at øge celle vedhæftning og overlevelsesrate. </li><li> Frø cellerne til de forberedte plader og rock dem frem og tilbage og fra side til side for at fordele cellerne. BEMÆRK: Det er vigtigt at sikre, at celler er jævnt fordelt i brøndene, om pladen er for rutinemæssig cellekultur eller hepatocyt differentiering eksperimenter. </li><li> Placer pladerne i celleinkubator og opretholde cellerne ved 37 ° C / 5% CO2 i 24 timer for at give dem mulighed for at vedhæfte og komme sig. </li><li> Undersøg cellerne den næste dag og trække ROCK inhibitor, hvis der er etableret celle-celle kontakt. Opretholde cellerne i mTeSR1 medium for rutinemæssig kultur eller skifte til differentiering medium efter behov. BEMÆRK: Hvis cellerne blev udsået med nævnte tæthed bør sammenflydning være ideel til rutinemæssig vedligeholdelse eller hepatocyt differentiation. </li></ol> 2. Differentiering hPSCs til hepatocyt-lignende celler på rekombinante lamininer <ol><li> Forbered differentiering medium. <ol><li> Foretag humant Activin En stamopløsning: Opløs human activin A pulver til at lave en 100 ug / ml stamopløsning i steril 0,2% bovint serumalbumin (BSA) / DPBS. Lav små portioner og opbevares ved -20 ° C. Anvendelse på 1: 1000. </li><li> Gør muse Wnt 3a stamopløsning: Opløs muse Wnt 3a pulver til at gøre en 10 ug / ml stamopløsning i steril 0,2% BSA / DPBS. Lav små portioner og opbevares ved -20 ° C. Anvendelse på 1: 200. </li><li> Gør human hepatocytvækstfaktor (HGF) stamopløsning: Opløs human HGF pulver til at gøre en 10 ug / ml stamopløsning i steril 0,2% BSA / DPBS. Lav små portioner og opbevares ved -20 ° C. Anvendelse på 1: 1000. </li><li> Gør Oncostatin M (OSM) stamopløsning: Opløs Oncostatin M (OSM) pulver til at gøre en 20 ug / ml stamopløsning i steril 0,2% BSA / DPBS. Lav små portioner og srev dem ved -20 ° C. Anvendelse på 1: 1000. </li><li> Gør 500 ml endoderm-priming lager medium: 2% B27 supplement (50x, minus vitamin A) og 1% penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer på 100 IU / ml og 100 ug / mL); top op til 500 ml ved hjælp af Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basalt medium. BEMÆRK: Opbevar lager ved 4 ° C og brug inden for to uger. Alikvot medium fra bestanden og tilføje friske aktivin A og Wnt-3a (slutkoncentrationer på 100 ng / ml og 50 ng / mL) ved hver udskiftning af mediet. </li><li> Gør 500 ml KSR / DMSO differentiering medium: 80% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% knockout serum udskiftning (KSR), 0,5% GlutaMAX, 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoethanol, 1% DMSO og 1% penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer på 100 IU / ml og 100 ug / mL). Filter under vakuum. Opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for to uger. </li><li> Lav 500 ml HepatoZYME modning medium: 1% GlutaMAX, 10 uM hydrocortison-21-hemisuccinat-natriumsalt (HCC) og 1% penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer på 100 IU / ml og 100 ug / mL); top op til 500 ml ved hjælp HepatoZYME basalt medium. BEMÆRK: Opbevar lager ved 4 ° C og brug inden for to uger. Alikvot medium fra bestanden og tilføje frisk HGF og OSM (slutkoncentrationer på 10 ng / ml og 20 ng / mL) for hvert medium ændring. </li></ol></li><li> Seed hPSCs for hepatocyt differentiering på LN-521, som beskrevet i afsnit 1. Hvis LN-521 / LN-111 skal anvendes som substrat, belægge pladerne med LN-521 og LN-111 (1: 3-forhold) på den endelige laminin koncentration på 5 ug / ml; resten behandling bør være den samme som rene LN-521-coatede plader. BEMÆRK: LN-521 / LN-111 er ikke ideel for rutinemæssig kultur hPSCs; Det bruges kun til differentiering eksperimenter. </li><li> Kontroller cellekonfluens 24 timer efter podning. Initiere cellulær differentiering, når cellekonfluens når ca. 40%. REFlyt det brugte mTeSR1 medium og tilsæt frisk endoderm-priming medium suppleret med 100 ng / ml activin A og 50 ng / mL Wnt 3a. Ring til denne differentiering dag 1. BEMÆRK: Det anbefales stærkt at initiere differentiering dagen efter podning af cellerne. </li><li> Skift endoderm-priming medium hver 24 timer i 3 dage for humane embryonale stamceller (hESCs). Hvad angår humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), forlænge denne fase i 2 dage mere til at prime cellerne til endelige endoderm-lignende celler, men bruge endoderm-priming medium alene suppleret med 100 ng / ml activin A for disse to dage 12 . BEMÆRK: For at sikre en vellykket endoderm specifikation, kan man undersøge ekspressionen af ​​endodermale markører, såsom FOXA2 og SOX17. Ifølge immunfluorescensfarvning, over 80% af de afledte celler er positive for begge markører i vores laboratorium. </li><li> Skift til KSR / DMSO differentiering medium på dag 4 (for hESCs) / dag 6 (for hiPSCs). Skift medium dAily for de første 3 dage og derefter på den femte dag i denne differentiering fase. BEMÆRK: Der kræves ingen fodring på den fjerde dag i denne differentiering fase. Brug ikke-suppleret KO-DMEM at vaske cellerne én gang før udskiftning af mediet, hvis der er mange døde celler. For at kontrollere, om differentiering for denne fase er vellykket eller ej, kan man teste udtryk for hepatiske stamceller markører, såsom AFP, CK19 og HNF4A. Næsten 90% af cellerne vil være positiv for disse markører baseret på vores erfaringer. </li><li> Efter 5 dage i KSR / DMSO differentiering fase, skifte til HepatoZYME modning scenen. Vask cellerne en gang med almindelig HepatoZYME basalt medium efter fjernelse af KSR / DMSO medium. Tilføj HepatoZYME modning medium suppleret med 10 ng / ml HGF og 20 ng / ml OSM. </li><li> Skift medium hver 48 timer i 7 - 10 dage, på hvilket tidspunkt cellerne er klar til standard karakterisering eller yderligere anvendelse. BEMÆRK: hepatocyt markør udtryk undersøgelser, metaboliskfunktionstests (såsom cytochrom P450-aktivitet), urinstof og albuminsekretion tests, glycogen storage tests, og indocyaningrøn (ICG) -optagelse test er typiske karakteriseringsmetoder. BEMÆRK: tidslinje for differentiering protokol er vist i figur 5. I vores laboratorium, vi rutinemæssigt kontrollere de afledte HLCs &#39;hepatocyt-specifik markør ekspressionsniveauerne, albumin sekretion og cytochrom P450 (CYP) 3A og 1A2 aktivitet. </li></ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1 Suppl), S157-S169 (2015).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+hepatocyte-like+cells+exhibiting+functional+activities.">Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities.</a> Cloning Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).</li><li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+high-fidelity+hepatotoxicity+models+from+pluripotent+stem+cells.">Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (7), 505-509 (2013).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+innate+immunity+improves+hepatitis+C+virus+infection+and+replication+in+stem+cell-derived+hepatocytes.">Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).</li><li>Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+modulation+of+hepatocyte-like+cell+function.">Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function.</a> Arch Toxicol. 90 (7), 1757-1761 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Wang, Y., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+stem+cell+derived+human+hepatocytes+for+experimental+medicine.">Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine.</a> Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 769-771 (2016).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li><li>Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+functional+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Touboul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+under+chemically+defined+conditions+that+recapitulate+liver+development.">Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development.</a> Hepatology. 51 (5), 1754-1765 (2010).</li><li>Touboul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+regulation+of+the+WNT/beta-catenin+pathway+enhances+differentiation+of+hESCs+into+hepatocytes.">Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes.</a> J Hepatol. 64 (6), 1315-1326 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+by+HNF4alpha+transduction.">Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction.</a> Mol Ther. 20 (1), 127-137 (2012).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28 (6), 611-615 (2010).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nat Commun. 5, 3195 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+ES/iPS-derived+hepatoblast-like+cells+on+human+laminin+111-coated+dishes.">Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cell+populations.">Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations.</a> J Vis Exp. (56), e2969 (2011).</li><li>Sales, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta1+modulates+extracellular+matrix+production,+proliferation,+and+apoptosis+of+endothelial+progenitor+cells+in+tissue-engineering+scaffolds.">Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds.</a> Circulation. 114 (1 Suppl), I193-I199 (2006).</li><li>Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+extracellular+matrix+components+are+necessary+for+definitive+endoderm+induction.">Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction.</a> Stem Cells. 31 (10), 2084-2094 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+hepatic+regeneration.+Localization+of+collagen+types+I,+III,+IV,+laminin,+and+fibronectin.">The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin.</a> Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).</li><li>Lorenzini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+stereotypical+cellular+and+extracellular+adult+liver+progenitor+cell+niche+in+rodents+and+diseased+human+liver.">Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver.</a> Gut. 59 (5), 645-654 (2010).</li></ol>

Dr. David C. Hay er medstifter og direktør for Stemnovate Limited.

For at fremme menneskelig pluripotente stamceller og translationel medicin, xeno-fri systemer, overholder kræves gældende retningslinjer for god fremstillingspraksis. Nøglen til enhver differentiering proces er den ekstracellulære matrix (ECM). ECM ikke kun understøtter celle vedhæftet fil, men giver også adgang til vigtige signalsystemer faktorer, der påvirker celle beslutsomhed og fænotype 25, 26. Lamininer er multifunktionelle ekstracellulære matrixproteiner in vivo. I leveren, laminin sekretion er afgørende for leverregenerering efter en partiel hepatektomi 27 og er nødvendig for hepatisk progenitorceller vedligeholdelse 28. Betydningen af ​​lamininer i lever vedligeholdelse og regenerering var grundlaget for afprøvning af kommercielt tilgængelige rekombinante humane lamininer i vores hepatocyt differentiering system. Superior hanpatocyte differentiering blev opnået på LN-521 og LN-521 / LN-111 substrater sammenlignet med Matrigel. Afledte HLCs var klart polariseret og organiseret i skålen, og deres cellulære funktion blev væsentligt forbedret i forhold til deres gelatinøse protein blanding modstykker. Bag disse forbedringer var nedreguleringen af kontaminerende colon-, fibroblast- og stamceller celleassocierede gener på de lamininer, samt et fald i celleproliferation og migration-associeret genekspression 10. Afslutningsvis den her beskrevne protokol genererer hepatocyt-lignende celler, der er tættere i naturen til voksne humane hepatocytter. Processen er reproducerbar, modtagelig for automatisering, og kan være omkostningseffektivt skaleret til anvendelse. Vigtigere, er batch-til-batch variation blevet væsentligt reduceret i forhold til teknikker, der bruger Matrigel, hvilket resulterer i en forbedret differentiering for forskere inden for dette område. </p&gt;

Primære humane væv og de afledte celletyper anvendes regelmæssigt, både for cellebaseret screening og i klinikken. Imidlertid er adgangen til disse celler alvorligt begrænset på grund af utilstrækkelig organdonation og tab af celle fænotyper post-isolation 1. hPSCs repræsenterer et lovende alternativ til primært væv og letter frembringelsen af ​​genetisk definerede og vedvarende humane somatiske celler. Hepatocyt-lignende celler (HLCs) afledt af hPSCs har allerede vist sig lovende på dette område. HLCs ligne primære humane hepatocytter i forskellige aspekter, herunder cellemorfologi, hepatocyt genekspression, metaboliske funktion, og følsomhed over for lægemidler og virus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Derudover ubegrænset proliferation ogselvfornyelse kapacitet af både forsknings- og GMP-grade hPSCs letter deres anvendelse 9, 10. Over et årti med forskning har produceret en række effektiv hepatocyt differentiering procedurer 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Men de fleste af disse systemer anvender udefinerede komponenter og / eller viral transduktion til drev hepatocellulær specifikation. For at forbedre pålideligheden af ​​teknologien på skalaen, er det vigtigt at udvikle en robust hepatocyt differentieringsystem, der er virkelig defineret, xenotransplantation-fri, og GMP-kompatible. Lamininer (LMS) er vigtige ekstracellulære matrixproteiner, der kan påvirke celleadhæsion, proliferation, migration og differentiering. Lamininer er heterotrimere glycoproteiner sammensat af en α, β én og én γ-kæde. For nylig har rekombinante humane lamininer blevet produceret og anvendt i cellebiologi. LN-511 har vist sig at støtte opretholdelsen af hPSCs 21, mens en blanding af LN-521 og E-cadherin tillader klonal afledning og udvidelse af humane embryonale stamceller 22. LN-111, på den anden side, støtter opretholdelsen af hepatoblast-lignende celler afledt af hPSCs 23. Men før vores rapport, lamininer 521, og 111 ikke var blevet udnyttet til at generere HLCs med modne egenskaber fra hPSCs 10. Her har vi detaljerede procedurer for dyrkning hPSCs på LN-521og differentiere dem på enten LN-521 eller en blanding af LN-521 og LN-111 (LN-521 / LN-111). Vi optimeret differentieringen protokol anvendes enkelt-celle podning til at generere en meget reproducerbar og ensartet monolag af HLCs i mange formater 14. Vi mener, at vores definerede differentiering systemet udgør en enkel og omkostningseffektiv metode til at fremstille aktive HLCs for ansøgning, der repræsenterer et vigtigt skridt fremad i feltet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 111</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN111-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05850</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17705</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) besidder stor værdi for biomedicinsk forskning. hPSCs kan skaleres og differentieret til alle celletyper fundet i menneskekroppen. Differentieringen af ​​hPSCs til human hepatocyt-lignende celler (HLCs) er blevet grundigt undersøgt, og effektive differentiering protokoller er blevet etableret. Kombinationen af ​​ekstracellulær matrix og biologiske stimuli, herunder vækstfaktorer, cytokiner og små molekyler, har gjort det muligt at generere HLCs der ligner primære humane hepatocytter. Men de fleste af procedurer stadig ansætte udefinerede komponenter, der giver anledning til batch-til-batch variation. Dette tjener som en væsentlig barriere for anvendelsen af ​​teknologien. For at løse dette problem, har vi udviklet et defineret system til hepatocyt differentiering ved hjælp af humane rekombinante lamininer som ekstracellulære matricer i kombination med et serum-frit differentiering proces. Meget effektiv hepatocyt specifikation blev opnået, med depaavist forbedringer i både HLC funktion og fænotype. Vigtigt er det, dette system er let at skalere op ved hjælp forsknings- og GMP-grade hPSC linjer lovende fremskridt i cellebaserede modellering og terapier.

Hepatocellulært Differentiering fra hPSCs En humane embryonale stamceller linje, H9, og en human induceret pluripotente stamcelle linje, 33D6, blev anvendt til hepatocyt differentiering. Resultaterne i figur 1-3 er fra H9-celler, mens de i figur 4 er fra 33D6 celler. Enkelte celler podedes på lamininer etableret celle-celle-kontakt efter 24 timer. Efter at cellerne nåede ca. 40% konfluens, blev differentieringen indledt (figur 1A og figur 4A). På lamininer (både LN-521 og LN-521 / LN-111), disse celler gennemgik sekventielle morfologiske ændringer og gav anledning til polariserede HLCs (figur 1 og figur 4A). Hepatocyt-lignende Cell Karakterisering day 18 HLCs blev indsamlet og vurderet til ekspression af repræsentative hepatocyt markører, HNF4A og ALB (figur 2A). Immunfarvning af day 18 HLCs viste, at næsten 90% af cellerne udtrykte HNF4α (figur 2B). Disse celler polariseret på lamininer og udviste en polygonal udseende, som angivet ved E-cadherin og F-actin-ekspression (figur 2B). Cytokrom P450 (CYP) aktivitet blev også vurderet. De CYP450-isoenzymer foretage en vigtig metabolisk funktion af hepatocytter. Dag 18 HLCs afledt på en gelatinøse protein blanding, såsom Matrigel, LN-521, eller LN-521 / LN-111, blev testet for CYP3A-aktivitet. HLCs demonstrerede signifikant højere CYP3A-aktivitet på laminin substrater end på matrigel (figur 3). Vigtigt er, når der sammenlignes med kommercielle humane primære hepatocytter (HU1339) re-udpladet på disse substrater, HLCs har næsten 10 gange højere niveaueraf CYP3A-aktivitet 10. Differentieringen af ​​hiPSCs var ligner hESCs. Cellerne udviste sekventielle ændringer i udseende (figur 4A). Afledte HLCs udtrykte en central hepatocyt transkriptionsfaktor, HNF4α (figur 4B), og besad CYP3A-aktivitet og udskilles albumin (figur 4C og D). Navnlig HLCs afledt af 33D6 de viste reduceret CYP3A i sammenligning med H9-celler afledt HLCs (figur 3), men det var stadig sammenlignelig med humane primære hepatocytter 10. Imidlertid albumin sekretion af disse HLCs var meget lavere end i primære hepatocytter 10. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig1.jpg" /> Figur 1: den sekventielle morfologiske ændringer i løbet Nedsat Differentiering. &lt;/ strong&gt; (A), ikke nærmere angivet hESCs seedet som enkelte celler nåede omkring 40% sammenflydning 24 timer efter podning. (B) Efter priming, celler udviste den typiske endodermal morfologi på dag 4. (C) Ved ankomsten til hepatoblast-lignende etape, viste de en klar polygonal form på dag 9. (D) Efter modning scenen, polariserede HLCs var klar til yderligere karakterisering vist her på dag 18. Scale bar = 200 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig2.jpg" /> Figur 2: Karakterisering af HLCs. (A), Gene ekspression af hepatocyt-markører, HNF4A (venstre) og ALB (til højre). Ekspressionsniveauet blev analyseret under anvendelse dag 18 HLCs afledtfra hESCs på både LN-521 og LN-521 / LN-111, og det var normaliseret til husholdning genet GAPDH og udtrykt i forhold til hESCs. Resultaterne repræsenterer tre biologiske gentagelser, og fejlen søjler repræsenterer standardafvigelse (SD). * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01; uparret t-test. (B) Protein ekspression af en nøgle hepatisk markering, HNF4α, og polarisering markører, E-cadherin og F-actin. Dag 18 HLCs på LN-521 og LN-521 / LN-111 blev farvet for de ovennævnte markører og modfarvet med Hoechst 33342. En negativ kontrol blev udført med det tilsvarende immunoglobulin G (IgG). Procentdelen af ​​HNF4α-positive celler og SD er vist. Dette blev beregnet ud fra fire tilfældige synsfelter. Billeder blev taget ved 20X forstørrelse. Scale bar = 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Figur 3: metaboliske funktion Karakterisering af HLCs. Cytochrom P450-aktivitet af CYP3A af celler dyrket på Matrigel (MG), LN-521, eller LN-521 / LN-111 blev testet. Dataene repræsenterer tre biologiske gentagelser, og fejlen søjler repræsenterer SD. ** P &lt;0,01; envejs ANOVA med Tukey post-hoc test. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig4.jpg" /> Figur 4: Standard karakterisering af HLCs. hiPSCs dyrket på LN-521 blev differentieret i HLCs. Standard karakterisering blev udført på dag 17 HLCs. (A) Den sekventielle morfologi af cellerne under hepatisk differentiering; den tidspunkter vist r<html> epresent celler på dag 1, 4, 9 og 17. (B) immunfarvning af HNF4α ekspression. Procentdelen af ​​positive celler og SD er vist baseret på fire tilfældige synsfelter. Billeder blev taget ved 20X forstørrelse. Scale bar = 100 um. (C) CYP3A aktivitet på dag 17 HLCs. Dataene repræsenterer seks biologiske replikater, og fejlen bar repræsenterer SD. (D) Albumin sekretion af afledte HLCs over 24 timer i kultur. Dataene repræsenterer fire biologiske gentagelser, og fejlen bar repræsenterer SD. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig5.jpg" /> Figur 5: Skematisk Tidslinje af Differentiering protokollen.t = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal.

Watch this Scientific Journal Video about Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Metoden præsenteres her beskriver en skalerbar og god fremstillingspraksis (GMP) også egnet differentiering system til at generere human hepatocyt-lignende celler fra pluripotente stamceller. Det tjener som en omkostningseffektiv og standardiseret system til at generere human hepatocyt-lignende celler til grundforskning og anvendt human lever forskning.

Defineret og skalerbar Generation af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering af induceret pluripotente stamceller fra humane perifere T-celler Brug af Sendai Virus i Feeder-fri Betingelser

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af melanocytter fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation af induceret pluripotente stamceller fra human melanoma Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation af Integration-fri induceret pluripotente stamceller fra humane perifere mononucleære blodceller Brug episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Ved hjælp af menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt hepatocyt-lignende celler for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Semi-automatiseret produktion af hepatocyt som celler fra pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar styret differentiering af klinisk kompatibel hornhinde Limbal epitelial stamceller fra humane pluripotente stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...