Name: defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2017-03-02T15:00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med utmerkelser fra britiske Regenerative Medicine Platform (MRC MR / L022974 / 1 og MR / K026666 / 1) og en Kina stipend.

MERK: Leverandør informasjon for alle reagenser som brukes i denne protokollen er oppført i tabell 1. Alle media / plater bør være sterile og i det minste ved romtemperatur når cellene skal ha direkte kontakt med dem. 1. aging Menneskelig Pluripotent stamceller (hPSCs) på Laminin 521 MERK: Celleaging prosedyren som er beskrevet nedenfor er basert på enkeltceller og er ideell for avledning av en homogen befolkning på hepatocytter-lignende celler fra hPSCs. Koloni plating er også anvendelig og har blitt beskrevet tidligere 24. <ol><li> Forbered laminin-belagte plater som trengs. <ol><li> Tine 100 mikrogram / ml lager av rekombinant laminin 521 (LN-521) ved 4 ° C. </li><li> Fortynn den tinte LN-521 i iskald 1x DPBS (med Ca2 + / Mg2 +) for å lage et 5 mikrogram / ml oppløsning. </li><li> Tilsett 1 ml av 5 ug / ml LN-521-løsning for å belegge en brønn i en 6-brønns plateog stein for å spre den jevnt i brønnen. </li><li> Inkuber platene i en 37 ° C / 5% CO2 cellekultur-inkubator i 2 - 4 timer for øyeblikkelig bruk eller i et 4 ° C kjøleskap over natten. </li><li> Oppbevar laminin-belagte plater i et 4 ° C kjøleskap etter behov. Hold platene på et flatt underlag og forsegle dem for å unngå fordampning og forurensning. MERK: Du må aldri la belagte brønnene tørke ut; toppen dem opp med ekstra 1x DPBS (med Ca 2+ / Mg 2+) hvis nødvendig. Bruk platene innen 2 uker. </li></ol></li><li> Tillat det nødvendige antall pre-belagte plater til romtemperatur før bruk eller inkuberes platene ved 37 ° C i 0,5 til 1 time. </li><li> Nøye suge belegget LN-521-løsning uten å skade den belagte overflate. Merk: Det er viktig ikke å skade den belagte overflaten før såing celler på den. </li><li> Umiddelbart tilsett 1 ml forvarmet-mTeSR1 medium supplert med 10 mm Rho-assosiert kinase (ROCK) hemmer Y27632 til en brønn i en 6-brønns plate. La platen i cellekulturinkubator til å motta celler. MERK: La aldri laminin-belagte brønner for å tørke. </li><li> Aspirer mediet fra velholdte hPSCs på ca 75% til 85% konfluens. Vask cellene fra en brønn i en 6-brønns plate en gang med 1 ml av rom-temperatur 1x DPBS (uten Ca2 + / Mg2 +). </li><li> Tilsett 0,5 ml 1x Accutase til cellene og inkuberes ved 37 ° C i 6 - 8 minutter for å skille cellene. MERK: For å sjekke om fordøyelsen er lang nok eller ikke, banke forsiktig på plate og sjekk om cellene kan løsne lett. Hvis ja, så det er på tide å stoppe den enzymatiske reaksjonen; hvis ikke, forlenge fordøyelse for en ekstra 1 - 2 min. </li><li> Avslutte dissosiasjon ved å tilsette 2 ml av frisk mTeSR1 medium supplert med 10 uM Y27632 til cellene. Pipetter opp og ned ved hjelp av en P1000 tips flere ganger for å lage en enkelt celle suspensjon. </li><li> Telle levedyktige celler ved hjelp av en hemocytometer.Bruk trypanblått til flekken og inkluderer alle døde celler 14 </li><li> Beregn det totale antall celler som trengs. For rutine hPSC aging, frø 4 x 10 5 til 5 x 10 5 celler per brønn av en seks-brønns plate (dvs. 4.21 x 10 4 til 5,26 x 10 4 per cm 2). For aging hPSCs for hepatocytter differensiering, frø 6,5 x 10 5 til 7,5 x 10 5 (dvs. 6,84 x 10 4 til 7,89 x 10 4 per cm 2) celler per brønn i en seks-brønns plate. MERK: seeding tetthet for hver cellelinje trenger mindre optimalisering basert på empiriske data tetthet gitt her for lever differensiering. </li><li> Overfør den nødvendige cellesuspensjonen inn i et sterilt 15 ml eller 50 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 115 xg i 3 min ved romtemperatur. </li><li> Aspirer supernatanten langsomt og deretter cellepelleten suspenderes i frisk, varm mTeSR1 medium supplert med 10 uM Rho-assosiert kinase (ROCK) inhibitor Y27632, ved hjelp av tilstrekkelig medium for å gjøre den ønskede celletetthet. MERK: Bruk av ROCK inhibitor er sterkt anbefalt for å øke cellebinding og overlevelse. </li><li> Seed cellene til de preparerte plater og rock dem frem og tilbake og fra side til side for å fordele cellene. MERK: Det er viktig å sikre at cellene er jevnt fordelt i brønnene om platen er for rutinecellekultur eller hepatocytter differensiering eksperimentering. </li><li> Plasserer platene i cellen inkubator og opprettholde cellene ved 37 ° C / 5% CO2 i 24 timer for å tillate dem å feste og gjenopprette. </li><li> Undersøke cellene neste dag og ta ROCK hemmer hvis det er etablert celle-celle kontakt. Opprettholde cellene i mTeSR1 medium for rutine kultur eller bytte til differensiering medium etter behov. MERK: Hvis cellene ble sådd med nevnte tetthet, bør confluency være ideelt for rutinemessig vedlikehold eller hepatocytter differentiation. </li></ol> 2. Skille hPSCs til hepatocytter lignende celler på Rekombinante Laminins <ol><li> Forbered differensiering medium. <ol><li> Lage humane aktivin En stamløsning: oppløse human aktivin Et pulver for å lage en 100 ug / ml stamløsning i steril 0,2% bovint serumalbumin (BSA) / DPBS. Lag små porsjoner og lagre dem ved -20 ° C. Bruk på 1: 1000. </li><li> Gjør musen Wnt 3a stamløsning: Løs opp muse Wnt 3a pulver for å lage en 10 mikrogram / ml stamløsning i steril 0,2% BSA / DPBS. Lag små porsjoner og lagre dem ved -20 ° C. Bruk på 1: 200. </li><li> Gjøre human hepatocytt-vekstfaktor (HGF) lagerløsning: oppløse human HGF pulver for å lage en 10 mikrogram / ml stamløsning i steril 0,2% BSA / DPBS. Lag små porsjoner og lagre dem ved -20 ° C. Bruk på 1: 1000. </li><li> Gjøre Oncostatin M (OSM) lagerløsning: oppløse Oncostatin M (OSM) pulver for å lage en 20 pg / mL stamløsning i steril 0,2% BSA / DPBS. Lag små porsjoner og store dem ved -20 ° C. Bruk på 1: 1000. </li><li> Gjør 500 ml endoderm sugende lager medium: 2% B27 supplement (50x, minus vitamin A) og 1% penicillin / streptomycin (endelige konsentrasjoner på 100 IU / ml og 100 ug / ml, henholdsvis); fylle opp til 500 ml ved hjelp Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basal medium. MERK: Oppbevar lager ved 4 ° C og bruk innen to uker. Delmengde medium fra lager og legge friske aktivin A og Wnt 3a (endelige konsentrasjoner på 100 ng / ml og 50 ng / ml, respektivt) ved hvert medium endring. </li><li> Gjør 500 ml KSR / DMSO differensieringsmedium: 80% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% knockout serum erstatning (KSR), 0,5% Glutamax, 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 0,1 mM beta-merkaptoetanol, 1% DMSO og 1% penicillin / streptomycin (endelige konsentrasjoner på 100 IU / ml og 100 ug / ml, henholdsvis). Filtrer under vakuum. Oppbevar ved 4 ° C og bruk innen to uker. </li><li> Lag 500 ml av HepatoZYME modning medium: 1% GlutaMAX, 10 uM hydrokortison 21-hemisuccinat-natriumsalt (HCC), og 1% penicillin / streptomycin (endelige konsentrasjoner på 100 IU / ml og 100 ug / ml, henholdsvis); fylle opp til 500 ml ved hjelp HepatoZYME basal medium. MERK: Oppbevar lager ved 4 ° C og bruk innen to uker. Delmengde medium fra lager og tilsett friskt HGF og OSM (endelig konsentrasjon på 10 ng / ml og 20 ng / ml, henholdsvis) for hvert medium endring. </li></ol></li><li> Frø hPSCs for hepatocytt differensiering på LN-521, som beskrevet i seksjon 1. Hvis LN-521 / LN-111 skal anvendes som substrat, belegge platene med LN-521 og LN-111 (1: 3-forhold) ved den endelige laminin konsentrasjon på 5 ug / ml; resten behandling bør være den samme som rene LN-521-belagte plater. MERK: LN-521 / LN-111 er ikke ideelt for rutine kultur hPSCs; det brukes kun for differensiering eksperimenter. </li><li> Kontroller mobil konfluens 24 timer etter seeding. Initiere cellulær differensiering når cellesammenflytning når omtrent 40%. REDra brukt mTeSR1 medium og tilsett frisk endoderm Sugende medium tilsatt 100 ng / ml activin A og 50 ng / ml Wnt 3a. Kall dette differensiering dag en. MERK: Det anbefales å starte differensiering dagen etter såing cellene. </li><li> Endre endoderm-priming medium hver 24. time i 3 dager for humane embryonale stamceller (hESCs). Når det gjelder menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs), strekker denne fasen i 2 dager for å prime cellene til definitive endoderm-lignende celler, men bruke endoderm fyllende medium supplert bare med 100 ng / mL aktivin A for disse to dager 12 . MERK: For å sikre en vellykket endoderm spesifikasjon, kan man undersøke uttrykket av endodermal markører som FOXA2 og SOX17. Ifølge immunfluorescens farging, over 80% av de avledet celler er positivt for begge merkene i vårt laboratorium. </li><li> Bytt til KSR / DMSO differensiering medium på dag 4 (for hESCs) / dag 6 (for hiPSCs). Endre medium dAily for de første 3 dagene og deretter på den femte dagen av denne differensiering scenen. MERK: Ingen fôring er nødvendig på den fjerde dagen av denne differensiering scenen. Bruk usupplerte KO-DMEM å vaske cellene gang før medium endring hvis det er mange døde celler. For å sjekke om differensiering for denne fasen er vellykket eller ikke, kan man teste uttrykk for leverstamcellemarkører, slik som AFP, CK19, og HNF4A. Nesten 90% av cellene vil være positivt for disse markørene basert på vår erfaring. </li><li> Etter 5 dager i KSR / DMSO differensiering scenen, bytte til HepatoZYME modning scenen. Vask cellene en gang med vanlig HepatoZYME basal medium etter fjerning av KSR / DMSO medium. Legg HepatoZYME modning medium supplert med 10 ng / ml HGF og 20 ng / ml OSM. </li><li> Endre medium hver 48. time i 7 - 10 dager, noe som medførte at cellene er klare for standard karakterisering eller videre bruk. MERK: hepatocytter markør uttrykk undersøkelser, metabolskfunksjonstester (for eksempel cytokrom P450 aktivitet), urea og albumin sekresjon tester, glykogen lagring tester, og indocyanine grønn (ICG) opptaksprøver er typiske karakterisering metoder. MERK: tidslinje av differensiering protokollen er vist i figur 5. I vårt laboratorium, vi rutinemessig sjekk avledet HLCS &#39;hepatocytter-spesifikk markør uttrykk nivåer, albumin sekresjon, og cytokrom P450 (CYP) 3A og 1A2 aktivitet. </li></ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1 Suppl), S157-S169 (2015).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+hepatocyte-like+cells+exhibiting+functional+activities.">Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities.</a> Cloning Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).</li><li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+high-fidelity+hepatotoxicity+models+from+pluripotent+stem+cells.">Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (7), 505-509 (2013).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+innate+immunity+improves+hepatitis+C+virus+infection+and+replication+in+stem+cell-derived+hepatocytes.">Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).</li><li>Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+modulation+of+hepatocyte-like+cell+function.">Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function.</a> Arch Toxicol. 90 (7), 1757-1761 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Wang, Y., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+stem+cell+derived+human+hepatocytes+for+experimental+medicine.">Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine.</a> Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 769-771 (2016).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li><li>Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+functional+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Touboul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+under+chemically+defined+conditions+that+recapitulate+liver+development.">Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development.</a> Hepatology. 51 (5), 1754-1765 (2010).</li><li>Touboul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+regulation+of+the+WNT/beta-catenin+pathway+enhances+differentiation+of+hESCs+into+hepatocytes.">Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes.</a> J Hepatol. 64 (6), 1315-1326 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+by+HNF4alpha+transduction.">Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction.</a> Mol Ther. 20 (1), 127-137 (2012).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28 (6), 611-615 (2010).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nat Commun. 5, 3195 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+ES/iPS-derived+hepatoblast-like+cells+on+human+laminin+111-coated+dishes.">Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cell+populations.">Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations.</a> J Vis Exp. (56), e2969 (2011).</li><li>Sales, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta1+modulates+extracellular+matrix+production,+proliferation,+and+apoptosis+of+endothelial+progenitor+cells+in+tissue-engineering+scaffolds.">Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds.</a> Circulation. 114 (1 Suppl), I193-I199 (2006).</li><li>Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+extracellular+matrix+components+are+necessary+for+definitive+endoderm+induction.">Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction.</a> Stem Cells. 31 (10), 2084-2094 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+hepatic+regeneration.+Localization+of+collagen+types+I,+III,+IV,+laminin,+and+fibronectin.">The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin.</a> Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).</li><li>Lorenzini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+stereotypical+cellular+and+extracellular+adult+liver+progenitor+cell+niche+in+rodents+and+diseased+human+liver.">Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver.</a> Gut. 59 (5), 645-654 (2010).</li></ol>

Dr. David C. Hay er en co-grunnlegger og direktør for Stemnovate Limited.

Å fremme menneskelig pluripotent stamcelleforskning og translasjonsforskning medisin, Xeno-free-systemer som i samsvar med gjeldende Good Manufacturing Practice retningslinjer er påkrevd. Nøkkelen til alle differensiering prosess er den ekstracellulære matriks (ECM). ECM ikke bare støtter celle vedlegg, men gir også tilgang til viktige signal faktorer, som påvirker celle besluttsomhet og fenotype 25, 26. Laminins er multifunksjonelle ekstracellulære matrix proteiner in vivo. I leveren, er laminin sekresjon avgjørende for leveren regenerering etter en delvis hepatectomy 27 og er nødvendig for leverstamcelle vedlikehold 28. Betydningen av laminins i leveren vedlikehold og fornyelse var grunnlag for å teste kommersielt tilgjengelige rekombinante humane laminins i vår hepatocytter differensiering system. Superior hanpatocyte differensiering ble oppnådd på LN-521 og LN-521 / LN-111 substrater sammenlignet med Matrigel. Avledet HLCS var tydelig polarisert og organisert i fatet, og deres cellulære funksjon ble betydelig forbedret i forhold til sine geleaktige proteinblanding kolleger. Underliggende disse forbedringene var den nedregulering av forurensende colon-, fibroblast- og stamcelleassosierte gener på laminins, så vel som en reduksjon i celleproliferasjon og migrasjon-assosierte genekspresjon 10. I konklusjonen, protokollen beskrevet her genererer hepatocytter-lignende celler som er nærmere i naturen til voksne humane hepatocytter. Fremgangsmåten er reproduserbar, mottagelig for automatisering, og kan være kostnadseffektivt skalert for anvendelse. Viktigere, har batch-til-batch-variasjon er betydelig redusert i forhold til teknikker som bruker Matrigel, noe som resulterer i et forbedret system for differensieringen forskere innen dette feltet. </p&gt;

Primære humane vev, og de avledede celletyper er regelmessig brukt, både for celle-basert screening og i klinikken. Imidlertid er tilgangen til disse cellene sterkt begrenset på grunn av utilstrekkelig organdonasjon og tap av celle fenotyper post-isolasjon 1. hPSCs representerer en lovende alternativ til primær vev og tilrettelegge for generering av genetisk definerte og fornybare humane somatiske celler. Hepatocytter lignende celler (HLCS) avledet fra hPSCs har allerede vist lovende i dette feltet. HLCS ligne primære humane hepatocytter i forskjellige aspekter, inkludert cellemorfologi, hepatocytter genekspresjon, metabolsk funksjon, og sensitivitet for medikamenter og virus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. I tillegg er den ubegrenset proliferasjon ogselvfornyelse kapasitet på både forsknings- og GMP-klasse hPSCs letter deres program 9, 10. Over et tiår med forskning har produsert en rekke effektiv hepatocytter differensiering prosedyrer 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Men de fleste av disse systemer benytter udefinerte komponenter og / eller viral transduksjon for å drive hepatocellulær spesifikasjonen. For å forbedre påliteligheten av teknologien i stor skala, er det viktig å utvikle en robust hepatocytt differensieringsystem som virkelig er definert, xeno-fri, og GMP-kompatibel. Laminins (LNS) er viktige ekstracellulære matrix proteiner som kan påvirke celle adhesjon, spredning, migrasjon og differensiering. Laminins er heterotrimeric glykoproteiner som består av en α, en β, og en γ kjede. Nylig har rekombinante humane laminins blitt fremstilt og brukt i cellebiologi. LN-511 har vist seg å understøtte opprettholdelse av hPSCs 21, mens en blanding av LN-521 og E-cadherin tillater klonal derivasjon og utvidelse av humane embryonale stamceller 22. LN-111, på den annen side støtter opprettholdelsen av hepatoblast-liknende celler avledet fra hPSCs 23. Men før vår rapport, laminins 521 og 111 hadde ikke vært benyttet til å generere HLCS med modne egenskaper fra hPSCs 10. Her har vi detalj prosedyrer for dyrking hPSCs på LN-521og skiller dem på hver sin LN-521 eller en blanding av LN-521 og LN-111 (LN-521 / LN-111). Vi optimalisert differensiering protokollen med encellede seeding til å generere en svært reproduserbar og homogen monolayer av HLCS i mange formater 14. Vi mener at vår definerte differensiering system representerer en enkel og kostnadseffektiv metode for å produsere aktive HLCS for søknaden, som representerer et betydelig skritt fremover i feltet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 111</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN111-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05850</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17705</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells

Menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) har stor verdi for biomedisinsk forskning. hPSCs kan skaleres og differensiert til alle celletyper som finnes i menneskekroppen. Differensieringen av hPSCs til menneske hepatocytter lignende celler (HLCS) har blitt grundig studert, og det er etablert effektive differensieringsprotokoller. Kombinasjonen av ekstracellulær matriks og biologiske stimuli, inkludert vekstfaktorer, cytokiner, og små molekyler, har gjort det mulig å generere HLCS som ligner primære humane hepatocytter. Men de fleste av fremgangsmåtene fremdeles benytter udefinerte komponenter, noe som gir opphav til batch-til-batch variasjon. Dette fungerer som en vesentlig barriere for anvendelsen av teknologien. For å takle dette problemet, utviklet vi et definert system for hepatocytter differensiering ved hjelp av humane rekombinante laminins som ekstracellulære matriser i kombinasjon med et serum-fritt differensieringsprosessen. Svært effektiv hepatocytter spesifikasjonen ble oppnådd, med demonstrated forbedringer i både HLC funksjon og fenotype. Viktigere, er dette systemet enkelt å skalere opp ved hjelp av forskning og GMP-klasse hPSC linjer lovende fremskritt i cellebasert modellering og terapier.

Hepatocellulær Differensiering fra hPSCs En human embryonisk stamcellelinje, H9, og en menneskeskapte pluripotent stamcelle linje, 33D6, ble anvendt for hepatocytt differensiering. Resultatene i figurene 1-3 er fra H9-celler, mens de i figur 4 er fra 33D6 celler. Enkeltceller seeded på laminins etablert celle-celle kontakt etter 24 timer. Etter at cellene nådde rundt 40% konfluens ble differensiering prosessen startet (figur 1A og 4A). På laminins (begge LN-521 og LN-521 / LN-111), er disse cellene gikk gjennom sekvensielle morfologiske endringer og ga opphav til polariserte HLCS (figur 1 og figur 4A). Hepatocytter lignende Cell Karakterisering day 18 HLCS ble samlet og vurdert for uttrykket av representant hepatocytter markører, HNF4A og ALB (figur 2A). Farging av dag 18 HLCS viste at nesten 90% av cellene uttrykte HNF4α (figur 2B). Disse cellene polarisert på laminins og viste en polygonal utseende, som preget av E-cadherin og F-aktin uttrykk (figur 2B). Cytokrom P450 (CYP) aktivitet ble også vurdert. De CYP450s gjennomføre en viktig metabolsk funksjon av hepatocytter. Dag 18 HLCS oppebåret på en geléproteinblanding, slik som Matrigel, LN-521, eller LN-521 / LN-111, ble testet for CYP3A aktivitet. HLCS viste signifikant høyere CYP3A aktivitet på laminin underlag enn på matrigel (figur 3). Viktigere, sammenlignet med kommersielle humane primære hepatocytter (HU1339) re-belagt på følgende underlag, HLCS har nesten 10 ganger høyere nivåerCYP3A aktivitet 10. Differensieringen av hiPSCs var lik som hESCs. Cellene viste sekvensielle forandringer i utseende (figur 4A). Avledet HLCS uttrykt en nøkkel hepatocytter transkripsjonsfaktor, HNF4α (figur 4B), og besatt CYP3A aktivitet og utskilles albumin (figur 4C og D). Spesielt HLCS avledet fra 33D6 vises redusert CYP3A i forhold til H9 celler avledet HLCS (figur 3), men det var fortsatt sammenlignbare med humane primære hepatocytter 10. Imidlertid albumin utskillelsen av disse HLCS var mye lavere enn i primære hepatocytter 10. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig1.jpg" /> Figur 1: Den sekvensielle Morfologiske Endringer i lever Differensiering. &lt;/ strong&gt; (A) Udifferensierte hESCs seedet som enkeltceller nådde rundt 40% konfluens 24 timer etter seeding. (B) Etter grunning, celler viste den typiske endodermal morfologi på dag 4. (C) Ved å nå hepatoblast lignende scenen, viste de en klar kantet form på dag 9. (D) Etter modning scenen, polariserte HLCS var klar for ytterligere karakterisering vist her på dag 18. Scale bar = 200 mikrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig2.jpg" /> Figur 2: Karakterisering av HLCS. (A) Gene uttrykk for hepatocytter-spesifikke markører, HNF4A (til venstre) og ALB (til høyre). Ekspresjonsnivået ble analysert ved hjelp av dag 18 HLCS avledetfra hESCs på både LN-521 og LN-521 / LN-111, og det var normalisert til husholdningsgenet GAPDH og uttrykt i forhold til hESCs. Resultatene representerer tre biologiske replikater, og feilfelt representerer standardavvik (SD). * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01; uparet t-test. (B) Protein uttrykk for en viktig lever markør, HNF4α, og polariserings markører, E-cadherin og F-aktin. Dag 18 HLCS på LN-521 og LN-521 / LN-111 ble farget for de ovennevnte markører og kontra med Hoechst 33342. En negativ kontroll ble utført med tilsvarende immunglobulin G (IgG). Prosentandelen av HNF4α-positive celler og SD er vist. Dette ble beregnet ut fra fire tilfeldige synsfelt. Bilder ble tatt på 20X forstørrelse. Scale bar = 100 mikrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Figur 3: Metabolsk Funksjon Karakterisering av HLCS. Cytokrom P450 aktivitet CYP3As av celler dyrket på Matrigel (MG), LN-521, eller LN-521 / LN-111 ble testet. Dataene representerer tre biologiske replikater, og feilfelt representerer SD. ** P &lt;0,01; enveis ANOVA med Tukey post-hoc test. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig4.jpg" /> Figur 4: Standard Karakterisering av HLCS. hiPSCs dyrket på LN-521 ble differensiert i HLCS. Standard karakterisering tester ble utført på dag 17 HLCS. (A) Den sekvensielle morfologien av cellene i løpet av hepatisk differensiering; den tidspunkter vist r<html> epresent celler på dag 1, 4, 9 og 17. (B) Farging av HNF4α uttrykk. Prosentandelen av positive celler og SD er vist basert på fire tilfeldige synsfelt. Bilder ble tatt på 20X forstørrelse. Scale bar = 100 mikrometer. (C) CYP3A aktivitet på dag 17 HLCS. Dataene representerer seks biologiske replikater, og feilen bar representerer SD. (D) Albumin utskillelsen av avledet HLCS over 24 timer i kultur. Dataene representerer fire biologiske replikater, og feilen linjen representerer SD. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig5.jpg" /> Figur 5: Skjematisk Tidslinje av Differensiering protokollen.t = &quot;_ blank&quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Watch this Scientific Journal Video about Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Metoden som presenteres her beskriver en skalerbar og Good Manufacturing Practice (GMP) -Klar differensiering system for å generere menneskelige hepatocytter-lignende celler fra pluripotente stamceller. Det fungerer som en kostnadseffektiv og standardisert system for å generere menneskelige hepatocytter lignende celler for grunnforskning og anvendt human lever forskning.

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra menneske perifere T-celler Bruke Sendai Virus i Feeder-free betingelser

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Utledning av Melanocytter fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra humane melanom Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generasjon Integrerings--frie Utførte Pluripotent stamceller fra menneskelige perifere mononukleære blodceller Bruke episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av standardiserte og reproduserbar Forebrain-type Cerebral Organoids fra menneske indusert Pluripotent stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Bruker Human indusert Pluripotent Stamcelle-avledet Hepatocyte-lignende celler for medisiner

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Semi-automatisert produksjon av Hepatocyte som celler fra Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar rettet differensiering av klinisk kompatibel hornhinnen Limbal epitel stamceller fra menneskelige Pluripotent stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...