Name: defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2017-03-02T15:00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes med utmärkelser från Storbritannien regenerativ medicin Platform (MRC MR / L022974 / 1 och MR / K026666 / 1) och ett Kina stipendium.

OBS: Vendor information för alla reagenser som används i detta protokoll har tagits upp i tabell 1. All media / plattor bör vara steril och åtminstone vid rumstemperatur när celler är att ha direktkontakt med dem. 1. Passaging Human pluripotenta stamceller (hPSCs) på laminin 521 OBS: Cell passage förfarande som beskrivs nedan bygger på enskilda celler och är idealisk för härledning av en homogen population av levercell-liknande celler från hPSCs. Koloni plätering är också tillämpbar och har beskrivits tidigare 24. <ol><li> Förbered laminin-belagda plattor som behövs. <ol><li> Tina 100 mikrogram / ml lager av rekombinant laminin 521 (LN-521) vid 4 ° C. </li><li> Späd tinade LN-521 i iskall 1x DPBS (med Ca2 + / Mg2 +) för att göra en 5 mikrogram / ml lösning. </li><li> Tillsätt 1 ml av 5 mikrogram / ml LN-521 lösning för att belägga en brunn i en 6-brunnars plattaoch rock för att sprida det jämnt i brunnen. </li><li> Inkubera plattorna i en 37 ° C / 5% CO2 cellodlingsinkubator för 2 - 4 h för akut användning eller i en 4 ° C kylskåp över natten. </li><li> Lagra laminin-belagda plattor i en 4 ° C kylskåp efter behov. Hålla plattorna på en plan yta och försegla dem för att undvika avdunstning och förorening. OBS: Låt aldrig de belagda brunnarna torka ut; fylla dem med extra 1x DPBS (med Ca2 + / Mg2 +) om det behövs. Använd plattorna inom 2 veckor. </li></ol></li><li> Låt erforderligt antal förbelagda plattor uppnå rumstemperatur före användning eller Inkubera plattorna vid 37 ° C under 0,5-1 h. </li><li> aspirera noggrant beläggnings LN-521 lösning utan att skada den belagda ytan. Obs: Det är viktigt att inte skada den belagda ytan innan sådd celler på det. </li><li> Omedelbart lägga ett mL förvärmda-mTeSR1-medium kompletterat med 10 | iM Rho-associerat kinas (ROCK) inhibitor Y27632 till en brunn i en 6-brunnsplatta. Lämnar plattan i cellodlingsinkubator för att ta emot celler. OBS: Låt aldrig laminin-belagda brunnar för att torka. </li><li> Aspirera mediet från välskötta hPSCs vid ca 75% till 85% konfluens. Tvätta cellerna från en brunn i en 6-brunnars platta en gång med 1 mL rumstempererat 1x DPBS (inga Ca2 + / Mg2 +). </li><li> Tillsätt 0,5 ml 1x Accutase till cellerna och inkubera vid 37 ° C under 6-8 min för att dissociera cellerna. OBS: För att kontrollera om matsmältningen är tillräckligt lång eller inte, knacka försiktigt på plattan och kontrollera om cellerna kan lossna lätt. Om ja, då är det dags att stoppa den enzymatiska reaktionen; om inte förlänga matsmältningen för en extra 1-2 min. </li><li> Avsluta dissociationen genom att tillsätta 2 ml av färskt mTeSR1-medium som kompletterats med 10 | iM Y27632 till cellerna. Pipettera upp och ned med hjälp av en P1000 spets flera gånger för att göra en enkel-cellsuspension. </li><li> Räkna livskraftiga celler med användning av en hemocytometer.Använd trypanblått till fläcken och utesluta döda celler 14 </li><li> Beräkna det totala antalet celler som behövs. För rutinmässig hPSC passaging, utsäde 4 x 10 5 till 5 x 10 5 celler per brunn i en 6-brunnsplatta (dvs 4,21 x 10 4-5,26 x 10 4 per cm 2). För passage hPSCs för hepatocyte differentiering, utsäde 6,5 x 10 5 till 7,5 x 10 5 (dvs, 6,84 x 10 4 till 7,89 x 10 4 per cm 2) celler per brunn i en 6-brunnar. OBS! Såddtäthet för varje cellinje kan behöva mindre optimering baserad på empiriska täthet som anges här för lever differentiering. </li><li> Överföra den nödvändiga cellsuspension i en steril 15-ml eller 50-ml centrifugrör och centrifugera vid 115 xg under 3 min vid rumstemperatur. </li><li> Aspirera supernatanten långsamt och sedan återsuspendera cellpelleten i färskt, varmt mTeSR1 medium kompletterat med 10 | iM Rho-associerat kinas (ROCK) inhibitor Y27632, med adekvat medel för att göra den önskade celltätheten. OBS: Användning av ROCK-inhibitor rekommenderas starkt för att förbättra cellvidhäftning och överlevnad. </li><li> Seed cellerna till de preparerade plattorna och rock dem fram och tillbaka och från sida till sida för att fördela cellerna. OBS: Det är viktigt att se till att celler fördelas jämnt i brunnarna om plattan är för rutin cellodling eller hepatocyte differentiering experiment. </li><li> Placera plattorna i cellen inkubatorn och bibehålla cellerna vid 37 ° C / 5% CO2 under 24 h för att ge dem möjlighet att fästa och återhämta sig. </li><li> Undersök cellerna nästa dag och dra ROCK-hämmare om cell-cell kontakt har etablerats. Behåll cellerna i mTeSR1 medium för rutinmässig kultur eller byta till differentieringsmedium som behövs. OBS: Om celler såddes med nämnda densitet bör konfluens vara perfekt för rutinmässigt underhåll eller hepatocyte differentiation. </li></ol> 2. Skilja hPSCs till hepatocyte-liknande celler på rekombinanta Lamininer <ol><li> Förbereda differentieringsmedium. <ol><li> Göra humant Aktivin A stamlösning: Lös humant Aktivin A pulver för att göra en 100 | j, g / ml förrådslösning i steril 0,2% bovint serumalbumin (BSA) / DPBS. Göra små alikvoter och lagra dem vid -20 ° C. Använd på 1: 1000. </li><li> Göra mus Wnt 3a stamlösning: lös mus Wnt 3a pulver för att göra en 10 | j, g / ml förrådslösning i steril 0,2% BSA / DPBS. Göra små alikvoter och lagra dem vid -20 ° C. Använd på 1: 200. </li><li> Göra human hepatocyt tillväxtfaktor (HGF) stamlösning: Lös human HGF-pulver för att göra en 10 | j, g / ml förrådslösning i steril 0,2% BSA / DPBS. Göra små alikvoter och lagra dem vid -20 ° C. Använd på 1: 1000. </li><li> Gör Oncostatin M (OSM) stamlösning: Lös Oncostatin M (OSM) pulver för att göra en 20 mikrogram / ml stamlösning i steril 0,2% BSA / DPBS. Gör små portioner och srev sönder dem vid -20 ° C. Använd på 1: 1000. </li><li> Gör 500 ml endoderm sugande lager medium: 2% B27 supplement (50x, minus vitamin A) och 1% penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer på 100 IU / ml och 100 mikrogram / ml, respektive); top upp till 500 ml med hjälp av Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basalt medium. OBS: Förvara lager vid 4 ° C och använd inom två veckor. Alikvotera mediet från lager och lägg färska Activin A och Wnt 3a (slutkoncentrationer på 100 ng / ml och 50 ng / ml, respektive) vid varje medium förändring. </li><li> Göra 500 ml KSR / DMSO differentieringsmedium: 80% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% knockout serumersättning (KSR), 0,5% GlutaMAX, 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 0,1 mM beta-merkaptoetanol, 1% DMSO, och 1% penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer på 100 lE / ml och 100 pg / ml, respektive). Filtrera under vakuum. Förvaras vid 4 ° C och använd inom två veckor. </li><li> Gör 500 ml HepatoZYME mognadsmedium: 1% GlutaMAX, 10 ^ M hydrokortison 21-hemisuccinat-natriumsalt (HCC), och 1% penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer på 100 lE / ml och 100 pg / ml, respektive); top upp till 500 ml med hjälp av HepatoZYME basalmedium. OBS: Förvara lager vid 4 ° C och använd inom två veckor. Alikvotera mediet från lager och lägga till färsk HGF och OSM (slutliga koncentrationer på 10 ng / ml och 20 ng / ml, respektive) för varje medium förändring. </li></ol></li><li> Seed hPSCs för hepatocyte differentiering på LN-521, som beskrivs i avsnitt 1. Om LN-521 / LN-111 ska användas som substrat, belägga plattorna med LN-521 och LN-111 (1: 3 förhållande) på den slutliga laminin koncentration av 5 | ig / ml; resten behandlingen ska vara densamma som rena LN-521-belagda plattor. OBS: LN-521 / LN-111 är inte idealisk för rutinkultur hPSCs; Det används endast för differentieringsexperiment. </li><li> Kontrollera cell confluency 24 timmar efter sådd. Initiera cellulär differentiering när cellen confluency når omkring 40%. REFlytta det använda mTeSR1 mediet och tillsätt färsk endoderm sugande medium kompletterat med 100 ng / ml Aktivin A och 50 ng / ml Wnt 3a. Kalla denna differentiering dag ett. OBS: Det rekommenderas att initiera differentiering dagen efter sådd av cellerna. </li><li> Ändra endoderm sugande medium var 24 h för 3 dagar för mänskliga embryonala stamceller (hESCs). När det gäller mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) förlänga detta skede ytterligare 2 dagar att prima cellerna slutgiltiga endoderm liknande celler, men använda endoderm sugande endast medium kompletterat med 100 ng / ml Activin A för dessa två dagar 12 . OBS: För att säkerställa ett framgångsrikt endoderm specifikation, kan man undersöka uttrycket av endodermala markörer, såsom FOXA2 och SOX17. Enligt immunofluorescensinfärgning, över 80% av de framställda cellerna är positiva för båda markörerna i vårt labb. </li><li> Växla till KSR / DMSO differentieringsmedium på dag 4 (för hESCs) / dag 6 (för hiPSCs). Ändra mediet dAily för de 3 första dagarna och sedan på den femte dagen av denna skillnad skede. OBS: Ingen matning behövs på den fjärde dagen av denna skillnad skede. Använda okompletterat KO-DMEM för att tvätta cellerna en gång innan mediumbyte om det finns många döda celler. För att kontrollera om differentieringen för detta steg är framgångsrik eller inte, kan man testa uttrycket av leverstamceller markörer, såsom AFP, CK19 och HNF4A. Nästan 90% av cellerna kommer att vara positivt för dessa markörer baserat på vår erfarenhet. </li><li> Efter 5 dagar i KSR / DMSO differentieringsstadiet, växla till HepatoZYME mognadsstadiet. Tvätta cellerna en gång med vanligt HepatoZYME basala mediet efter avlägsnande av KSR / DMSO medium. Lägga HepatoZYME mognadsmedium kompletterat med 10 ng / ml HGF och 20 ng / ml OSM. </li><li> Ändra mediet var 48 timmar för 7 - 10 dagar, vid vilken tidpunkt cellerna är redo för standard karakterisering eller vidare användning. OBS: hepatocyte markör uttryck undersökningar, metabolafunktionstester (t.ex. cytokrom P450-aktivitet), urea och albumin utsöndringstester, tester glykogen lagring och indocyaningrönt (ICG) upptagstester är typiska metoder för karakterisering. OBS: tidslinjen för differentiering protokoll visas i fig 5. I vårt labb, rutinmässigt kontrollerar vi de härledda HLCs &quot;hepatocyt-specifik markör uttrycksnivåer, albumin sekretion och cytokrom P450 (CYP) 3A och 1A2 aktivitet. </li></ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1 Suppl), S157-S169 (2015).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+hepatocyte-like+cells+exhibiting+functional+activities.">Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities.</a> Cloning Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).</li><li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+high-fidelity+hepatotoxicity+models+from+pluripotent+stem+cells.">Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (7), 505-509 (2013).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+innate+immunity+improves+hepatitis+C+virus+infection+and+replication+in+stem+cell-derived+hepatocytes.">Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).</li><li>Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+modulation+of+hepatocyte-like+cell+function.">Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function.</a> Arch Toxicol. 90 (7), 1757-1761 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Wang, Y., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+stem+cell+derived+human+hepatocytes+for+experimental+medicine.">Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine.</a> Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 769-771 (2016).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li><li>Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+functional+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Touboul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+under+chemically+defined+conditions+that+recapitulate+liver+development.">Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development.</a> Hepatology. 51 (5), 1754-1765 (2010).</li><li>Touboul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+regulation+of+the+WNT/beta-catenin+pathway+enhances+differentiation+of+hESCs+into+hepatocytes.">Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes.</a> J Hepatol. 64 (6), 1315-1326 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+by+HNF4alpha+transduction.">Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction.</a> Mol Ther. 20 (1), 127-137 (2012).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28 (6), 611-615 (2010).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nat Commun. 5, 3195 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+ES/iPS-derived+hepatoblast-like+cells+on+human+laminin+111-coated+dishes.">Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cell+populations.">Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations.</a> J Vis Exp. (56), e2969 (2011).</li><li>Sales, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta1+modulates+extracellular+matrix+production,+proliferation,+and+apoptosis+of+endothelial+progenitor+cells+in+tissue-engineering+scaffolds.">Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds.</a> Circulation. 114 (1 Suppl), I193-I199 (2006).</li><li>Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+extracellular+matrix+components+are+necessary+for+definitive+endoderm+induction.">Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction.</a> Stem Cells. 31 (10), 2084-2094 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+hepatic+regeneration.+Localization+of+collagen+types+I,+III,+IV,+laminin,+and+fibronectin.">The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin.</a> Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).</li><li>Lorenzini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+stereotypical+cellular+and+extracellular+adult+liver+progenitor+cell+niche+in+rodents+and+diseased+human+liver.">Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver.</a> Gut. 59 (5), 645-654 (2010).</li></ol>

Dr David C. Hay är en av grundarna och chef för Stemnovate Limited.

Att främja mänskliga pluripotenta stamceller och translationell medicin, Xeno fria system som uppfyller gällande riktlinjer för god tillverkningssed krävs. Nyckeln till alla differentieringsprocess är den extracellulära matrisen (ECM). ECM inte bara stödjer cellvidhäftning, men ger också tillgång till signalnyckelfaktorer, som påverkar cellbestämning och fenotyp 25, 26. Lamininer är multifunktionella extracellulära matrixproteiner in vivo. I levern, är avgörande för leverregenerering laminin utsöndring efter en partiell hepatektomi 27 och krävs för lever stamceller underhåll 28. Vikten av lamininer lever underhåll och förnyelse var grunden för att testa kommersiellt tillgängliga rekombinanta humana lamininer i vårt hepatocyte differentiering systemet. överlägsen hanpatocyte differentiering uppnåddes på LN-521 och LN-521 / LN-111 substrat jämfört med Matrigel. Härledda HLCs var klart polariserad och organiseras i skålen, och deras cellulära funktion förbättrades signifikant jämfört med deras gelatinösa proteinblandning motsvarigheter. Bakom dessa förbättringar var nedreglering av förorenande colon-, fibroblast- och stamcellsassocierade gener på lamininer, liksom en minskning i celltillväxt och migration associerade genuttryck 10. Sammanfattningsvis, det protokoll som beskrivs här genererar hepatocyt-liknande celler som är närmare sin natur vuxna humana hepatocyter. Processen är reproducerbar, mottaglig för automatisering, och kan vara ett kostnadseffektivt sätt skalas för ansökan. Viktigt har sats till sats variationer har minskat betydligt jämfört med tekniker som använder Matrigel, vilket resulterar i en förbättrad differentiering system för forskare inom detta område. </p&gt;

Primära mänskliga vävnader och derivatcelltyper används regelbundet, både för cellbaserad screening och i kliniken. Dock är tillgång till dessa celler starkt begränsad på grund av otillräcklig organdonation och förlust av cell fenotyper efter isolering ett. hPSCs utgör ett lovande alternativ till primär vävnad och underlätta bildandet av genetiskt definierade och förnybara humana somatiska celler. Hepatocyte-liknande celler (HLCs) härledda från hPSCs har redan visat lovande resultat i detta område. HLCs likna primära mänskliga hepatocyter i olika aspekter, inklusive cellmorfologi, hepatocyte genuttryck, metabolisk funktion och känslighet för läkemedel och virus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Dessutom den obegränsade proliferation ochsjälvförnyelse kapacitet både forsknings- och GMP-kvalitet hPSCs underlättar deras tillämpning 9, 10. Över ett decennium av forskning har producerat ett antal effektiv hepatocyt differentiering förfaranden 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Men de flesta av dessa system använder odefinierade komponenter och / eller viral transduktion för att driva hepatocellulär specifikation. För att förbättra tillförlitligheten i tekniken i stor skala, är det viktigt att utveckla en robust hepatocyte differentieringsystem som verkligen är definierad, xeno-fri, och GMP-kompatibla. Lamininer (LNS) är viktiga extracellulära matrisproteiner som kan påverka celladhesion, tillväxt, migration och differentiering. Lamininer är heterotrimera glykoproteiner som består av en α, β en och en γ kedja. På senare tid har rekombinanta humana lamininer tagits fram och används i cellbiologi. LN-511 har visat att stödja upprätthållandet av hPSCs 21, medan en blandning av LN-521 och E-cadherin kan klon härledning och utbyggnad av stamceller från mänskliga embryon 22. LN-111, å andra sidan, stöder upprätthållandet av hepatoblast liknande celler härledda från hPSCs 23. Men innan vår rapport, lamininer 521 och 111 hade inte använts för att generera HLCs med mogna egenskaper från hPSCs 10. Här, vi detalj förfaranden för odling hPSCs på LN-521och differentiera dem antingen LN-521 eller en blandning av LN-521 och LN-111 (LN-521 / LN-111). Vi optimerat differentieringsprotokoll med användning av single-cellsådd för att generera en mycket reproducerbar och homogen monoskikt av HLCs i många format 14. Vi anser att vår definierade differentieringssystem utgör en enkel och kostnadseffektiv metod för att tillverka aktiva HLCs för applicering, vilket innebär en betydande steg framåt när det gäller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 111</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN111-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05850</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17705</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells

Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) har stort värde för biomedicinsk forskning. hPSCs kan skalas och differentieras till alla celltyper som finns i människokroppen. Differentieringen av hPSCs till humana hepatocyt-liknande celler (HLCs) har studerats ingående, och effektiva differentieringsprotokoll har upprättats. Kombinationen av extracellulär matris och biologiska stimuli, inklusive tillväxtfaktorer, cytokiner, och små molekyler, har gjort det möjligt att generera HLCs som liknar primära mänskliga hepatocyter. Men de flesta av förfarandena fortfarande använder odefinierade komponenter, vilket ger upphov till sats till sats variationer. Detta fungerar som ett betydande hinder för tillämpning av tekniken. Att ta itu med detta problem har vi utvecklat ett utarbetat system för hepatocyte differentiering med användning av humana rekombinanta lamininer som extracellulära matriser i kombination med ett serumfritt differentieringsprocess. Högeffektiv hepatocyte specifikation uppnåddes med demonstrated förbättringar i både HLC funktion och fenotyp. Viktigare, är lätt att skala upp med hjälp av forskning och GMP-grade hPSC linjer lovande framsteg inom cellbaserad modellering och terapier detta system.

Hepatocellulär Differentiering från hPSCs En human embryonal stamcellslinje, H9, och en människa inducerade pluripotenta stamceller linje, 33D6, användes för hepatocyte differentiering. Resultaten i fig 1-3 är från H9-celler, medan de i fig 4 är från 33D6-celler. Enskilda celler ympas på lamininer etablerade cell-cellkontakt efter 24 h. Efter att cellerna nått cirka 40% konfluens, var differentieringsprocessen inletts (Figur 1A och Figur 4A). På lamininer (både LN-521 och LN-521 / LN-111), dessa celler genomgick sekventiella morfologiska förändringar och gav upphov till polarise HLCs (Figur 1 och Figur 4A). Hepatocyte-liknande Cell karakterisering day 18 HLCs samlades och bedömdes för att uttrycka representativa hepatocyt markörer, HNF4A och ALB (Figur 2A). Immunfärgning av dag 18 HLCs visade att nästan 90% av cellerna uttryckte HNF4α (Figur 2B). Dessa celler polaris på lamininer och uppvisade en polygonal utseende, som kännetecknas av E-cadherin och F-aktin uttryck (Figur 2B). Cytokrom P450 (CYP) -aktivitet bedömdes också. De CYP450 genomföra en viktig metabolisk funktion av hepatocyter. Dag 18 HLCs härletts en geléform proteinblandning, såsom Matrigel, LN-521, eller LN-521 / LN-111, testades för CYP3A aktivitet. HLCs uppvisade signifikant högre CYP3A aktivitet på laminin substrat än på Matrigel (Figur 3). Viktigt, jämfört med kommersiella humana primära hepatocyter (HU1339) åter pläterade på dessa substrat, HLCs har nästan 10 gånger högre nivåerav CYP3A aktivitet 10. Differentieringen av hiPSCs var liknande den för hESCs. Cellerna uppvisade sekventiella förändringar i utseende (Figur 4A). Härledda HLCs uttryckte en nyckel hepatocyt transkriptionsfaktor, HNF4α (Figur 4B), och besatt CYP3A-aktivitet och utsöndras albumin (figur 4C och D). Notably HLCs härledda från 33D6 som visas reducerat CYP3A i jämförelse med H9-celler härledda HLCs (figur 3), men det var fortfarande jämförbar med humana primära hepatocyter 10. Men albuminsekretion av dessa HLCs var mycket lägre än i primära hepatocyter 10. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig1.jpg" /> Figur 1: Den sekventiella morfologiska förändringarna under lever differentiering. &lt;/ strong&gt; (A) diverse hESCs seedade som enskilda celler nått cirka 40% konfluens 24 timmar efter sådd. (B) Efter priming, celler uppvisade typiska endodermalt morfologi på dag 4. (C) Vid ankomsten till den hepatoblast liknande stadium, visade de en klar polygonal form på dag 9. (D) Efter mognadsstadiet, polarise HLCs var redo för ytterligare karakterisering visas här på dag 18. Skala bar = 200 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig2.jpg" /> Figur 2: Karakterisering av HLCs. (A) Gene expression av hepatocyt-specifika markörer, HNF4A (till vänster) och ALB (höger). Expressionsnivån analyserades med användning dag 18 HLCs härleddafrån hESCs på både LN-521 och LN-521 / LN-111, och det normaliserades till housekeepinggen GAPDH och uttrycktes relativt till hESCs. Resultaten representerar tre biologiska replikat, och de felstaplarna representerar standardavvikelsen (SD). * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01; oparat t-test. (B) Proteinexpression av en nyckel levermarkör, HNF4α, och polariserings markörer, E-cadherin och F-aktin. Dag 18 HLCs på LN-521 och LN-521 / LN-111 färgades för ovanstående markörerna och motfärgades med Hoechst 33342. En negativ kontroll utfördes med motsvarande immunglobulin G (IgG). Den procentuella andelen av HNF4α-positiva celler och SD visas. Detta beräknades från fyra slump synfält. Bilder togs vid 20X förstoring. Skalstreck = 100 | j, m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Figur 3: metabolisk funktion Characterization of HLCs. Cytokrom P450-aktivitet av CYP3A av celler odlade på Matrigel (MG), LN-521, eller LN-521 / LN-111 testades. Data representerar tre biologiska replikat, och felstaplar representerar SD. ** P &lt;0,01; en-vägs ANOVA med Tukeys post hoc-test. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig4.jpg" /> Figur 4: Standard karakterisering av HLCs. hiPSCs odlade på LN-521 var differentierade i HLCs. Standardtester för karakterisering utfördes på dag 17 HLCs. (A) Den sekventiella morfologi hos cellerna under lever differentiering; tidpunkterna visas r<html> epresent celler på dag 1, 4, 9, och 17. (B) immunfärgning av HNF4α uttryck. Andelen positiva celler och SD visas baserat på fyra slump synfält. Bilder togs vid 20X förstoring. Skalstreck = 100 | j, m. (C) CYP3A aktivitet på dag 17 HLCs. Data representerar sex biologiska replikat, och felet stapel representerar SD. (D) Albumin utsöndring av härledda HLCs över 24 timmar i kultur. Data representerar fyra biologiska replikat, och felet stapel representerar SD. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig5.jpg" /> Figur 5: Schematisk Tidslinje för differentiering protokollet.t = &quot;_ blank&quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Watch this Scientific Journal Video about Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Den metod som presenteras här beskriver en skalbar och god tillverkningssed (GMP) -färdig differentiering system för att generera humana hepatocyt-liknande celler från pluripotenta stamceller. Den fungerar som en kostnadseffektiv och standardiserat system för att generera humana hepatocyt-liknande celler för grundforskning och tillämpad humanlever forskning.

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humana perifera T-celler med Sendai virus i Feeder fria förhållanden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fria Derivering av Melanocyter från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humant melanom tumörinfiltrerande lymfocyter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation Integrations-fria inducerade pluripotenta stamceller från humant perifert blod mononukleära celler med användning av episomala vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av standardiserade och reproducerbara framhjärnan-typ Cerebral Organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Använder mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived Hepatocyte-liknande celler för läkemedelsutveckling

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Halvautomatisk tillverkning av Hepatocyte liknande celler från pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv och skalbar riktad differentiering av kliniskt kompatibel korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...