Name: initial evaluation of antibody-conjugates modified with viral-derived peptides for increasing cellular accumulation and improving tumor targeting
Uploaded: 2018-03-08T12:30:00
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Diese Arbeit wurde von der Cancer Research Society (Kanada) und die CIMS finanziert. Die Autoren danken Dr. Samia Ait-Mohand und Jean-Francois Beaudoin um Unterstützung zu erhalten. Dr. Angel Lopez (University of South Australia) für mAb A14.

Die in Vivo Tierversuche beschrieben wurden nach einem genehmigten Prüfplan und nach den ethischen Richtlinien des Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke Ethikkommission für Tierversuche durchgeführt.
(1) Antikörper Peptid Konjugation
Hinweis: ChAcNLS können zu jeder kommerziellen Peptid Hersteller und Universität angeschlossenen Peptid-Synthese-Service-Plattform synthetisiert werden. Die Synthese von ChAcNLS finden Sie im Referenz- <sup class="...

Hauptziele der systemischen Lieferung von Anti-Krebs-Wirkstoffe sind Ansammlung am Tumor Standort und Aufnahme innerhalb von Krebszellen zu erhöhen und unerwünschte Nebenwirkungen bei gesunden Gewebe zu verringern. AC gezielte Bereitstellung von molekularen Nutzlasten für Tumorzellen ist ein sehr vielversprechender Ansatz zur Behandlung und Tumoren zu erkennen. Jedoch die mangelnde Wirksamkeit durch Endosom Einklemmung und down Stream lysosomalen Abbau bleibt eine wichtige Herausforderung. Während dieses Protokoll da...

Antikörper-Konjugate (ACs) sind Biopharmazeutika, die in eine transformative Klasse von wirksamen Medikamenten zur Verbesserung der Krebs-Behandlungen sowie zur Erkennung von Tumoren fällig sind. Bestehend aus ein monoklonaler Antikörper (mAb) konjugiert, molekulare Nutzlasten wie Radioisotope, kleine Moleküle und biologische Toxine, ACs sind in der Lage, diese Nutzlasten an Krebszellen mit exquisiten Ziel Antigen Affinität und Spezifität zu liefern. Damit ACs haben das Potenzial, deutlich reduzieren unspezifische Toxizität und Nutzlast Aktivität bei der Tumor-Website zu erhöhen. Therapeutisch, wurden ACs Transport von zytotoxischen kleinen Molekülen (gemeinhin als Antikörper-Wirkstoff-Konjugate) zugelassen für die Behandlung von Patienten mit Brustkrebs und Hodgkin Lymphom, die konventionelle Behandlungen 1, gescheitert 2. ACs Transport von Radioisotopen (allgemein als Radioimmunoconjugates bezeichnet) sind darüber hinaus auch in der Entwicklung. Eine AC Transport von Radioisotopen für die Bildgebung ist zur Identifizierung von Prostatakrebs Metastasen 3zugelassen. Mit vielen mehr therapeutische ACs Zulassung 4beantragt ist Optimismus für die Zukunft des ACs zu Krebs Pflege 5hoch.
Dennoch, bei der Chemotherapeutika oder Radioisotope ACs haben Schwierigkeiten, die effektiv sammeln diese Nutzlasten in Zielzellen. Dieser Aspekt trägt wesentlich in vielen Fällen in der Unfähigkeit des ACs zu lang andauernde krankheitsfreien Überlebens oder kontrastreiche Tumor imaging- 6,7. In der Regel sobald ACs binden ihre Ziel-Antigen sind sie durch einen Prozeß bekannt als Rezeptor-vermittelte Endozytose internalisiert. ACs sind dann in Endosomen gefangen und verschleppt, Lysosomen für Abbau und Nutzlast release 8. Die intrazelluläre Menschenhandel Prozess stellt Herausforderungen an ACs eine hohe Nutzlast Spezifität und Wirksamkeit gegen Krebszellen zu erreichen. Zum Beispiel viele Antigene wie Her2 (Ziel für therapeutische AC Trastuzumab-Emtansin) kann bis zu 85 % der gebundenen Antikörper in den ersten 30 min 9recyceln. Darüber hinaus nach Verschlechterung auftritt, können freigegebene Chemotherapeutika und Radioisotopen aktiv durch erhöhte Expression/Aktivität der Membran verbundenen Transport Proteine 10,11oder exportiert werden. Lysosomen Abbau hemmt auch die Lieferung der neuartige biologische Nutzlasten wie therapeutischer Enzyme und Oligonukleotide, die sein können deaktiviert 12,13. Im Wesentlichen ist die Krebszelle sehr effektiv bei der Aufhebung der notwendigen intrazellulären Akkumulation von Nutzlasten von ACs geliefert.
Dieses Protokoll beschreibt die Umsetzung des Konzepts der ACs-gekoppelt an Virus-abgeleitete Peptide, speziell für Endosom Verlockende Falle zu entkommen und Lokalisierung in den Zellkern. Mit solcher Raffinesse, Host Zellsysteme zu manipulieren ist es nicht verwunderlich, dass die Entwicklung des Virus abgeleitet Proteine und Peptide als potenzielle Biopharmazeutika lange tief in therapeutische Forschung 14 verwurzelt hat. Seit Millionen von Jahren haben Viren entwickelt, um eine außergewöhnliche Sammlung von Proteinen in der Lage, normale physiologische Säugerzelle Systeme nutzen, um effektiv Wirtszellen geben erwerben. Für Viren, die über Rezeptor-vermittelte Endozytose internalisiert werden, stehen sie auch vor der Herausforderung mit Flucht vor Menschenhandel zu den Lysosomen wo kann der Ansturm der eine lokalisierte Konzentration von Proteasen problematisch für das Überleben sein. Eine gut charakterisierten virale abgeleitet Peptid genutzt bei der Medikamentenabgabe zu entkommen Endosom Einklemmung ist das Humane Immundefizienz-Virus Transaktivator Transkription (Tat) Protein 15. Tat ist in der Lage, Endosom Einklemmung durch Sensierung niedrigen pH-Wert an welcher Stelle auftreten, Protein-Konformationsänderungen förderliches Tat sich einfügen und stören die Endosomal Membrane 16zu entkommen. Dies führt zu Tat-Nutzlast Konjugate Zytoplasma zugreifen. Das zweite virale Manipulation Element im Zusammenhang mit diesem Protokoll ist der Ansatz verwendet, um therapeutische Gene und Drogen zum Kern 17liefern. Viren haben entwickelt, um Host Cell Maschinen für voran durch die Kernpore Komplex (NPC) auf der Durchreise vorbei die Kernmembran erfolgreich zu manipulieren. Zelluläre Makromoleküle enthalten (oder binden an Proteine, die enthalten) nukleare Lokalisierung Signale (NLSs) notwendig für die Bindung zu nuklearen transportieren Proteine (z. B. Karyopherins α und β), die die erforderlichen Bewegungen durch den NPC zu bieten. Viren haben Proteine um NLS-Sequenzen enthalten, die ihnen die Fähigkeit, Host Zelle Transportproteine für pendelt in der Kern- 18Nutzen bieten entwickelt.
Zahlreiche ACs haben zuvor mit Tat und NLS-abgeleitete Peptide funktionalisiert und getestet für ihre Fähigkeit, Krebszellen zu sammeln und gezielt Tumoren 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (Tabelle 1). Studien, die Bereitstellung von zytotoxischen Nutzlasten haben gezeigt, dass ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide sind zellulären Akkumulation, Zytotoxizität und Tumor töten über unveränderte ACs 22,26deutlich erhöhen. Ein gemeinsames Merkmal für diese neuartige Klasse von AC ist konstruktionsbedingt. Peptide enthalten in der Regel ein terminal Cystein bietet eine kostenlose Sulfhydryl-Gruppe. MAbs wird zuerst mit einem Noncleavable bifunktionelle Vernetzer mit N- Hydroxysuccinimide (NHS) und Maleimide Gruppen an den entgegengesetzten Enden reagiert. Die NHS-Ester reagieren mit primären Aminen auf die mAb, Amid-Bindungen zu bilden. Reagierte mAb mit frei Maleimide Gruppen wird dann mit den Sulfhydryl-Gruppen auf die Peptide bilden eine Thioester-Bindung und damit verknüpfen das Peptid und mAb reagiert. Obwohl Homobifunctional Vernetzer verwendet 28gewesen, Heterobifunctional Vernetzer werden häufiger verwendet, in den Bau des Virus abgeleitet Peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Dieses Protokoll verwendet speziell der Vernetzer Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC) für seine Benutzerfreundlichkeit und da es in der zugelassenen Antikörper-Wirkstoff-Konjugat Trastuzumab-Emtansin und in vielen verwendet wird Virus-abgeleitete Peptid-ACs 8,22,23,26,31,32. Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist die primäre Methode zur Bestimmung zunächst Konjugation Effizienz und für semi-Quantifizierung der Anzahl der Peptide pro mAb. Konfokale Mikroskopie mit einer Fluoreszent-markierten Sekundärantikörper spezifisch für die mAb ist in der Regel die Methode zur Bewertung der zunächst intrazelluläre Verteilung Eigenschaften des Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs. Radioisotope sind bisher, die primäre Nutzlasten von Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs geliefert. Radioisotope sind vorteilhaft, weil die Radioaktivität in den Zellen leicht durch Gamma zählen quantifiziert ist. Darüber hinaus bieten die ACs, die Maus-Modellen der menschlichen Krebserkrankungen übersetzt werden Forscher mit der Fähigkeit zur Bewertung Tumor gezielt mit molekularen Bildgebungsverfahren wie single Photonenemission Computertomographie und Positronen-Emissions-Tomographie (PET) berechnet 23 , 32 , 33. die Konstruktion und Validierung Testmethoden, die hauptsächlich von Forschern bietet im Allgemeinen eine sehr gute Bewertung des ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide während der ersten Entwicklungsphase effektiv eingeben und liefern die Nutzlast in Zielzellen und Ziel Tumoren.
Tat - und NLS-modifizierte ACs haben beleuchtete Schlüsselbereichen Nutzlast Lieferung innerhalb Krebszellen und Tumoren weiter zu verbessern. In Bezug auf ACs NLS geändert kann die Effizienz in der intrazellulären Akkumulation bescheidene 23,31,34. Ineffiziente intrazelluläre Ansammlung verursacht durch fortgesetzte Endosomal Einklemmung. Ausrichtung in Vivo Tumor kann auch mit beiden Tat und NLS-modifizierte ACs vermindert werden. Die aktiven Sequenzen von Tat und NLS enthalten mehrere positiv geladene Rückstände. Wenn mAbs angeschlossen, kann die insgesamt kationische Ladung deutlich erhöhte 35sein. Als Folge haben der Tat - und NLS-modifizierte ACs erhöhte Aufnahme in gesundes Gewebe und schnelle Blut Abstand erhöht.
Unsere Gruppe entwickelt eine zusammengesetzte Verbindung bestehend aus Cholsäure verbunden mit NLS (ChAcNLS; ( Abbildung 1). ChAcNLS-modifizierte ACs sind in der Lage zu erhöhen intrazelluläre Akkumulation von gelieferten Radioisotopen und Tumor targeting im Vergleich zu NLS modifiziert und traditionellen ACs 33,34. Der Mechanismus hinter Cholsäure ist inspiriert von der Fähigkeit des ausgewählten nonenveloped Viren, die auf Membranfusion Cholsäure Endosom Flucht durch die Bildung von Ceramid auslösen nutzen nicht verlassen kann. Z. B. Rekruten porcinen enterischen Viren Cholsäure, die Sphingomyelinase, aktiviert die katalysiert die Hydrolyse von Sphingomyelin in Ceramid 36,37,38. Dies destabilisiert Endosomal Membrane und Virus Flucht ermöglicht. Cholsäure ist also ein anderes Virus abgeleitete Komponente, die NLS ergänzt.
Als dieses Feld bewegt sich vorwärts und zukünftige treten Weiterentwicklungen in Nutzlast Lieferung von ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide, es ist ein guter Zeitpunkt, um visuelle Vorführungen ihrer biochemische und funktionelle Eigenschaften während der Anfangsphase der Entwicklung bieten. Hier beschreiben wir unsere Protokoll für die ursprüngliche Bewertung des Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs für die effiziente und doch einfache Bestimmung der intrazellulären Akkumulation und Tumor gezielt während der frühen Phase der Entwicklung. Wir verwenden die im Handel erhältlichen mAbs 7 3 und A14 als Beispiel Modellsysteme. Verfahren 1 beschreibt die Verwendung von SDS-PAGE als eine Methode, die für "Go/No go" Entscheidungen konstruierten ACs ermöglicht. Verfahren 2 beschreibt eine Methode, mit Trypsinization für verbesserte Visualisierung von AC intrazelluläre Verteilung und Akkumulation. Verfahren 3 beschreibt ein Verfahren zur verbesserten intrazellulären Fraktionierung, nukleare Lokalisation genau zu bestimmen. In diesem Verfahren nutzen wir die Nutzlast 64Cu (t1/2 = 12,7 h) weil es anfällig für zelluläre Ausfluss ist und ein Positronen-Emitter- 10 ist. So beschreibt Verfahren 4 in Vivo Tumor targeting Charakterisierung von PET imaging zu visualisieren Tumor Aufnahme relativ zum Hintergrund (d.h. Energiesubventionen gesundes Gewebe) und bestimmen, ob das Beispiel AC gezielt und effektiv kann Ziel Tumoren. Diese Methoden sind ausreichend für die Ermittler, die Entwicklung von ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide, Kandidaten für die Weiterentwicklung zu identifizieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22122</td>
			<td>There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td>There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375EDU</td>
			<td>Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 or 500 mL volumes to choose from.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>1-10 &#956;g/mL recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOTA-NHS</td>
			<td>CheMatech</td>
			<td>C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin A/C antibody (N-18)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-376362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A14 mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TF-1a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIDE medical imaging software</td>
			<td>available at amide.sourceforge.net</td>
			<td></td>
			<td>Completely free download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView FV1000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>www.olympus-lifescience.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITLC strips</td>
			<td>Biodex</td>
			<td>150-771</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial evaluation of antibody-conjugates modified with viral-derived peptides for increasing cellular accumulation and improving tumor targeting

Antikörper-Konjugate (ACs) modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide sind eine potentiell mächtige Klasse von Tumor Zelle Zusteller für molekulare Nutzlasten verwendet in der Krebsbehandlung und Bildgebung durch erhöhten zellulären Akkumulation über aktuelle ACs. Während des frühen AC in Vitro sind Entwicklung, Fluoreszenztechniken und Radioimmunoassays ausreichend zur Bestimmung intrazelluläre Lokalisation, Anhäufung Effizienz und Ziel Zelle Spezifität. Derzeit gibt es keinen Konsens über standardisierte Verfahren zur Herstellung von Zellen für die Bewertung der AC intrazelluläre Akkumulation und Lokalisierung. Die ersten Tests der ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide ist kritisch, vor allem, wenn mehrere Kandidaten gebaut wurden. Bestimmung von intrazellulären Akkumulation durch Fluoreszenz Hintergrundsignal von ACs an der Zelloberfläche betroffen Sie sein können und erschweren Sie die Interpretation der Akkumulation. Für Radioimmunoassays in der Regel behandelte Zellen fraktioniert und die Radioaktivität in andere Zelle Fächer gemessen. Jedoch Zelle Lysis variiert von Zelle zu Zelle und oft Kern- und zytoplasmatischen Kompartimente sind nicht ausreichend isoliert. Dies kann irreführende Daten über Nutzlast Lieferung Eigenschaften führen. Die intravenöse Injektion des radioaktiven Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs im Tumor mit Mäusen gefolgt von Radionuklid Bildgebung ist eine leistungsfähige Methode für die Bestimmung der Tumoreigenschaften targeting und Nutzlast Lieferung während der in-Vivo -Phase des Entwicklung. Aber dies ist eine relativ neue Zuführung und einige Gruppen haben Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs auf diese Weise ausgewertet. Wir beschreiben die Verarbeitung der behandelten Zellen genauer bewerten Virus abgeleitet Peptid-modifizierte AC Akkumulation bei der konfokalen Mikroskopie und Radioimmunoassays Verwendung. Eine Methode zur trypsinizing Zellen, Zellenoberfläche entfernen gebunden insbesondere ACs. Wir bieten auch eine Methode zur Verbesserung der zellulären Fraktionierung. Dieses Protokoll sieht schließlich eine in-Vivo -Methode mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) für die Bewertung der ersten Tumor gezielt Eigenschaften in Tumor-tragenden Mäusen. Wir verwenden das Radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) als ein Beispiel Nutzlast in diesem Protokoll.

Für Verfahren 1 modifiziert der Bau von 7 3 mit ChAcNLS mit Sulfo-SMCC wie ein Vernetzer sehr zuverlässig ist. In der Regel, wenn ein 12 %-Gel verladen und von SDS-PAGE analysiert, dadurch unterscheidbar schrittweise Erhöhung der MW proportional zur steigenden Sulfo-SMCC-bis - 7 3 Verhältnisse verwendet und ermöglicht für die schweren und leichten Ketten für ChAcNLS individuell beurteilt werden Konjugation (Abbildung 3). 7G 3 reagiert auf 10, 20, 25 und 50-zu-1-Sul...

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Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Viral-abgeleitete Peptide gekoppelt an Antikörper-Konjugate (ACs) ist ein Ansatz, der Schwung durch das Potenzial der molekularen Nutzlasten mit erhöhten Tumor Zelle Ansammlung zu liefern. Gängige Methoden zur Bewertung Peptid Konjugation, AC und Nutzlast intrazelluläre Akkumulation und Tumor gezielt nutzen, unterstützt dieses Protokoll Forscher während der wichtigen ersten Entwicklungsphasen.

Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

The overall goal of these procedures is to evaluate the specificity and effectiveness of antibody conjugates for accumulating inside target cells and tumors during the initial development stages so that they can ultimately be used in the clinic. This method can help answer key question on the answer the conjugate fields, such as the efficiency of nuclear localization and the overall intercellular accumulation. An advantage of this technique is that via PET imaging researchers can assess the effectiveness and selectivity of candidate antibody conjugates.The implications of these techniques extend towards therapy and diagnosis of cancer, because ineffective tumor-cell accumulation is a major limitation with these applications for antibody conjugates. After synthesizing a colic-acid nuclear localization sequence antibody conjugate according to the text protocol, treat target TF1A cells with 200 nanomolar 7G3 colic-acid MLS antibody conjugate. Include cells treated with modified control monoclonal antibodies.Incubate five times 10 to the sixth antigen-positive cells with the conjugates at 37 degrees Celsius for one hour. Then remove the supernatant, and use one milliliter of ice-cold PBS to wash the cells three times. Add fresh medium, and incubate the cells at 37 degrees Celsius for an additional hour.Next, add 0.5 milliliters of PBS, containing 0.25%trypsin and EDTA, and incubate the cells at 37 degrees Celsius for up to 30 minutes. Then use 1.5 milliliters of RPMI1640 medium with 10%FBS to neutralize the trypsin. Centrifuge the cells at 500 times G for five minutes, remove the supernatant, and use 0.5 milliliters of ice-cold PBS to wash the cells three times again.Add 0.5 milliliters of 1%PFA and 1%sucrose and PBS to the cells, and place them on ice for 30 minutes to fix them. Then use 0.5 milliliters of ice-cold PBS to wash the cells three times, and centrifuge the samples at 250 times G for five minutes. Next, add 0.15%Triton X-100 and PBS to the cells, and permeablize them on ice for five minutes.Then, with ice-cold PBS, wash the cells, and repeat the centrifugation. Suspend the cells in 0.1 milliliters of PBS, containing two micrograms per milliliter of an antimirroring FC secondary polyclonal antibody conjugated to Alexa Fluor 647, and incubate the samples in the dark at room temperature for one hour. Centrifuge the cells at 250 times G for five minutes, and use 0.5 milliliters of ice-cold PBS to wash the cells three times.Then suspend the cells in 0.5 milliliters of PBS. Add 10 micrograms per milliliter of propidium iodide to the cells. Then use mounting medium to mount one times 10 to the fifth cells onto glass slides before covering the sample with a glass cover slip.Examine the cells with a Plan APO 60X oil-immersion objective, numerical aperture 1.42, on an inverted laser-scanning confocal microscope. Detect PI fluorescence using the 488-nanometer argon laser and the spectral-scanning prism set for 600 to 650 nanometers. For AF 647 fluorescence, use the 633-nanometer helium-neon laser and the spectral-scanning prism set for 650 to 700 nanometers.Collect images from PI and AF 647 sequentially, 1024 by 1024 pixels, with 2X line averaging, taken at 0.5-micron intervals through the entire cell thickness. Present images as Z projections. To analyze the cells, evaluate and record whether intracellular fluorescence in the cytoplasm is grouped and near the cell surface or diffuse and homogeneous.Also evaluate the relative fluorescence intensity per cell. After preparing and concentrating radiolabeled colic-acid NLS antibody conjugate according to the text protocol, determine the radiolabeling efficiency by applying 0.5 microliters of 0.1-molar PH5.5 sodium citrate, or ITLC eluent, to an ITLC strip. Form an autoradiograph of the strip, and obtain a digital image.Carry out densitometry to obtain the proportion of bound and free Copper-64. If free Copper-64 content is greater than 5%concentrate the sample further. For Copper-64 cellular accumulation studies, treat cells with 100 nanomolar of Copper-64-labeled A14 conjugates at 37 degrees Celsius for one, six, and 24 hours, as previously described.Treat the cells with unmodified A14 to block IL5R alphacytes and at four degrees Celsius to block receptor-mediated internalization. After washing the cells and incubating with fresh medium, as demonstrated earlier in this video, add 0.5 milliliters of PBS containing 0.25%trypsin and EDTA, and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Then, after neutralizing and washing the cells as before, add plasma-membrane lysis buffer to the cells, and incubate them on ice for 10 minutes.Centrifuge the plasma-membrane-lysed cells at 90 times G for five minutes. Remove the supernatant, and transfer it to a fresh tube. This represents the cytoplasmic fraction.Then use ice-cold PBS to wash the nuclei three times, and add the washes to the cytoplasmic fraction. Ensure vials containing the nuclear and cytoplasmic fractions are sealed, then place them in a gamma counter calibrated for Copper-64 in order to convert raw counts to megabecaril. Determine the quality of nuclei isolation by performing Western-Blot analysis for lamin AC, a restricted nuclear protein;and Rab-7, an abundant cytoplasmic protein, on wholesale lysate, nuclear, and cytoplasmic fractions.Treat five times 10 to the six cells with 500 microliters of radio-amino-precipitation assay, or RIPA buffer, and plasma-membrane lysis buffer containing 1%2%and 4%NP-40. Furthermore, treat the isolated nuclei with 500 microliters of RIPA buffer to obtain isolated nuclear proteins. Add four times the sample volume of cold acetone to the isolated nuclear, cytoplasmic, and wholesale proteins, and incubate for 60 minutes at minus 20 degrees Celsius.Centrifuge the samples at 13, 000 times G for 10 minutes. Decant the supernatant, being careful not to dislodge the protein pellet. Then add 100 microliters of PBS to dissolve the proteins.After performing Western Blotting as previously described, cut the membrane in half at the 40-kilodalton molecular-weight marker. Use lamin-AC-specific antibodies to probe the blot containing the higher-molecular-weight proteins, and use Rab-7-specific antibodies to probe the lower half of the membrane. In groups containing four nodskit mice, inject into the tail vein 20 to 30 micrograms of radiolabeled A14 colic-acid NLS antibody conjugate, radiolabeled A14 NLS, and radiolabeled A14.On the same day, place a cylindrical phantom containing five megabecaril of Copper-64 into the PET scanner to convert the radioactive counts per second into injected dose per gram of tissue. 48 hours later, after anesthetizing the mice according to the text protocol, rapidly transfer a mouse to a PET scanner table in the headfirst prone position with a nosecone for isoflurane. Start the PET data acquisition using a regular sampling-mode setting and an energy window of 250 to 650 kiloelectron volts.After the scan, remove the mouse from the scanner, and place it back in the cage. As shown in this figure, the arrows show the difference when evaluating antibody conjugate accumulation with and without trypsinization. In cells that are not trypsinized, intracellular accumulation and distribution is difficult to evaluate due to the over expression of the target cell's surface receptors.The arrows show the difference in intracellular accumulation and distribution of two antibody conjugate candidates when cells are properly trypsinized. Radiolabeled A14 colic-acid NLS antibody conjugate shows nanomolar affinity for IL5R alpha. With increasing concentrations of radiolabeled A14 colic-acid NLS antibody conjugate, specific binding of A14 colic-acid NLS antibody conjugate approached saturation at concentrations of 3.5 nanomolar in both HT-1376 and HT-B9 cells.Gamma counting reveals that the increase of radioactivity in the nucleus and in the cytoplasm from radiolabeled A14 colic-acid NLS antibody conjugate is specific and increases over time. HT-1376 and HT-B9 cells were incubated with plasma-membrane lysis buffer containing 1%2%or 4%NP-40. For HT-1376 and HT-B9 cells, the lysis buffer containing one or 2%NP-40 Rap-7 was not detected in the nuclear fraction, and lamin AC was not detected in the cytoplasmic fraction.PET imaging allows for the evaluation of candidate antibody conjugates for their ability to target antigen-positive tumors, red and blue arrows, and their associated biodistribution properties in comparison to the parental non-peptide-modified antibody. One can see the signal accumulation in the tumor to help select on the potential for a developed antibody conjugate. PET imaging also allows for the evaluation of candidate antibody conjugate uptake in healthy tissues such as the liver.After mastering these techniques, researchers in the field of targeted tumor delivery of molecular payloads will be able to explore additional agents where tumor-cell accumulation is hindered due to endosome entrapment.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Steigende cDNA Erträge aus Einzel-Zell-Mengen von mRNA in Standard Laboratory Reverse-Transkriptase-Reaktionen mit Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Forschung

Biotechnik

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Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion und Targeting von Monovalenter Quantenpunkte

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

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Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

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Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel

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Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

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Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

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Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

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