Name: initial evaluation of antibody-conjugates modified with viral-derived peptides for increasing cellular accumulation and improving tumor targeting
Uploaded: 2018-03-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting at JoVE.com

Detta arbete finansierades av den Cancer Research Society (Kanada) och CIMS. Författarna tackar Dr. Samia Ait-Willy och Jean-Francois Beaudoin för hjälp. Dr. Angel Lopez (University of South Australia) för mAb A14.

De i vivo djurförsök beskrivs utfördes enligt ett godkänt protokoll och de etiska riktlinjerna Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke etikkommitténs för djur experiment.
1. antikropp peptid konjugation
Obs: ChAcNLS kan syntetiseras på kommersiella peptid tillverkare eller universitet-anslutna peptid syntes serviceplattform. Syntesen av ChAcNLS kan hittas i referens 34. För förfaranden 1 och 2 använda mAb 7 g 3, som ä...

Stora målen systemisk leverans av anti-cancer är att öka ackumulering vid tumör webbplats och upptag inom cancerceller och minska oönskade biverkningar i friska vävnader. AC riktade leverans av molekylär nyttolaster till tumörceller är en mycket lovande metod att behandla och upptäcka tumörer. Men avsaknaden av effekt orsakas av endosome brottsprovokation och ner stream lysosomal nedbrytning förblir en viktig utmaning. Medan detta protokoll använder ChAcNLS peptiden som ett exempel för byggandet av nästa g...

Antikropp-konjugat (ACs) är biologiska läkemedel som mognar till en omvälvande klass av effektiva läkemedel för att förbättra cancerbehandlingar och för att upptäcka tumörer. Består av en monoklonal antikropp (mAb) konjugerat till molekylär nyttolaster som radioisotoper, små molekyler och biologiska gifter, ACs kan leverera dessa nyttolaster till cancerceller med utsökta mål antigen affinitet och specificitet. ACs har därmed potential att avsevärt minska ospecifik toxicitet och ökar nyttolasten aktivitet på webbplatsen tumören. Terapeutiskt, har ACs transporterar cytotoxiska små molekyler (vanligen kallat antikropp-drogen konjugat) godkänts för behandling av patienter med bröstcancer och Hodgkins lymfom som har misslyckats med konventionella behandlingar 1, 2. Dessutom ACs transporterar radioisotoper (ofta kallad radioimmunoconjugates) är också under utveckling. En AC som transporterar en radioisotoper för avbildning är godkänd för att identifiera prostatacancer metastaser 3. Med många mer terapeutiska ACs inskickad för godkännande 4, är optimismen hög för framtiden för ACs att förbättra cancer care 5.
Ändå när leverera kemoterapeutika eller radioisotoper, ACs har svårigheter att effektivt ackumulera dessa nyttolaster inuti målceller. Denna aspekt bidrar avsevärt i många fall i oförmågan av ACs att ge långvarig överlevnad eller hög kontrast tumör imaging 6,7. I allmänhet när ACs binda deras mål antigen är de internaliserat genom en process som kallas receptormedierad endocytos. ACs är sedan anhållna inuti endosomes och människohandel till lysosomer för nedbrytning och nyttolast release 8. Intracellulära människohandel processen innebär utmaningar för ACs att uppnå en hög nyttolast specificitet och effekten mot cancer målceller. Exempelvis många antigener såsom Her2 (mål för terapeutiska AC Trastuzumab-emtansin) kan återvinna upp till 85% av bundna antikroppar i första 30 min 9. Dessutom när nedbrytningen sker, kan släppt kemoterapeutika och radioisotoper aktivt exporteras genom ökat uttryck eller aktivitet av membran associerade transport proteiner 10,11. Lysosomen nedbrytning hindrar också leverans av romanen biologiska nyttolaster såsom terapeutiska enzymer och oligonukleotider som kan avaktiveras 12,13. I huvudsak är cancercellen mycket effektivt på om upphävande av nödvändiga intracellulära ackumuleringen av nyttolaster levereras av ACs.
Det här protokollet beskriver hur du implementerar begreppet ACs-kopplat till virus-derived peptider, speciellt för fly endosome brottsprovokation och lokalisera till cellkärnan. Med sådan finess att manipulera cell värdsystem, är det inte förvånande att utvecklingen av virus-derived proteiner och peptider som potentiella biologiska läkemedel har länge varit ingrodd i terapeutisk forskning 14. Under miljontals år utvecklats virus för att förvärva en enastående samling av proteiner kan utnyttja normala fysiologiska däggdjursceller system för att effektivt ange värdceller. För virus som är internaliserad via receptormedierad endocytos, ifrågasätts de också utströmmande människohandel till Lysosomen där angrepp av en lokaliserad koncentration av proteaser kan vara problematiskt för överlevnad. En väl karakteriserade viral-derived peptid som utnyttjas i drogen leverans för flyr endosome entrapment är humant immunbristvirus transactivator transkription (Tat) protein 15. Tat är kunna fly endosome entrapment av avkänning låg-pH då protein konfirmerande förändringar inträffar möjliggörande Tat för att sätta sig in och störa den endosomal membran 16. Detta resulterar i Tat-nyttolast konjugat komma åt cytoplasman. Elementet för andra virala manipulation som relaterade till detta protokoll är det synsätt som används för att leverera terapeutiska gener och droger till nucleus 17. Virus har utvecklats framgångsrikt manipulera värd cell maskiner för framåt förbi det nukleära membranet genom att passera genom kärnkraft pore komplexa (NPC). Cellulära makromolekyler innehåller (eller binda till proteiner som innehåller) cellkärnelokalisering signaler (NLSs) nödvändiga för att binda till nukleära transport proteiner (t.ex. karyopherins α och β), som ger de nödvändiga rörelserna genom NPC. Virus har utvecklat proteiner innehåller NLS sekvenser som ger dem möjlighet att utnyttja värd cell transportproteiner för shuttling i nucleus 18.
Många ACs har tidigare functionalized med Tat - och NLS-härledda peptider och testats för deras förmåga att ackumulera inuti cancerceller och inriktning tumörer 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabell 1). Studier att leverera cytotoxiska nyttolaster har visat att ACs modifierad med virus-derived peptider har möjlighet att avsevärt öka cellulära ackumulering, cytotoxicitet och tumör döda över omodifierade ACS- 22,26. Ett gemensamt drag för denna nya klass av AC är deras konstruktion. Normalt innehåller peptider en terminal cystein som tillhandahåller en gratis sulfhydryl-grupp. MAbs är först reagerade med en noncleavable bifunktionell crosslinker som innehåller N- hydroxysuccinimide (NHS) och maleimide grupper i motsatta ändar. NHS estrar reagerar med primära aminer i mAb att bilda amide obligationer. De reagerade mAb med gratis maleimide grupper är då reagerade med sulfhydryl grupper på peptiderna bilda en thioester bond och därmed länka peptid och mAb. Även om homobifunctional bindemedel används 28, heterobifunctional crosslinker är mer allmänt används i byggandet av virus-derived peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Detta protokoll speciellt använder den crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-bildas (sulfo-SMCC) för dess användarvänlighet och eftersom det används i den godkända antikropp-drogen konjugat Trastuzumab-emtansin och i många virus-derived peptid-ACS- 8,22,23,26,31,32. Sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) är den primära metoden för att inledningsvis fastställa konjugation effektivitet och semi kvantifiera antalet peptider per mAb. Konfokalmikroskopi använder en fluorescently-märkt sekundär antikropp specifik för mAb är vanligtvis metoden för att initialt bedöma intracellulär distribution egenskaperna för virus-derived peptid-modifierade ACs. Hittills har är radioisotoper de primära nyttolaster levereras av virus-derived peptid-modifierade ACs. Radioisotoper är fördelaktigt eftersom radioaktivitet i celler enkelt kvantifieras genom gamma räkning. Dessutom ACs som översätts till musmodeller av mänskliga cancerformer ger forskare möjlighet att utvärdera tumör inriktning med molekylär avbildningsmetoder såsom single photon emission beräknade datortomografi och positronemissionstomografi (PET) 23 , 32 , 33. I allmänhet konstruktion och validering testmetoder används främst av forskare ge en mycket bra bedömning av ACs modifierad med virus-derived peptider under inledande utvecklingsarbetet för att effektivt komma in och leverera den nyttolast inuti målceller och till målet tumörer.
Tat och NLS-modifierade ACs har belyst nyckelområden för att ytterligare förbättra nyttolast leverans inuti cancerceller och tumörer. När det gäller NLS-modifierade ACs, kan effektiviteten i intracellulär ansamling vara blygsamma 23,31,34. Ineffektiva intracellulär ansamling orsakas av fortsatt endosomal entrapment. In vivo tumör inriktning kan också minskas med båda Tat och NLS-modifierade ACs. Den aktiva sekvenser av Tat och NLS innehålla flera positivt laddade rester. När bifogas mAbs, vara övergripande katjoniska avgiften betydligt ökad 35. Som en följd har den Tat och NLS-modifierade ACs ökat upptag i friska vävnader och ökade snabbt blod clearance.
Vår grupp utvecklat en sammansatt förening bestående av cholsyra kopplade till NLS (ChAcNLS; (Se figur 1). ChAcNLS modifierade ACs kan öka intracellulära ackumuleringen av levererade radioisotoper och förbättra tumör inriktning jämfört med NLS-modifierat och traditionella ACs 33,34. Mekanismen bakom cholsyra är inspirerad av förmågan hos utvalda nonenveloped virus som inte kan åberopa membran fusion att utnyttja cholsyra för att utlösa endosome fly genom bildandet av ceramide. Exempelvis rekryterar svin enteriska virus cholsyra som aktiverar sphingomyelinase, katalyserar hydrolys av ceramidas in ceramide 36,37,38. Detta gör virus att fly och destabiliserar endosomal membran. Cholsyra är alltså en annan virus-derived komponent som kompletterar NLS.
När fältet rör sig framåt och framtida uppstår framsteg i nyttolast leverans av ACs modifierad med virus-derived peptider, är det ett lämpligt tillfälle att ge visuella demonstrationer av deras biokemiska och funktionella egenskaper under första utveckling. Här beskriver vi våra protokoll för den inledande utvärderingen av virus-derived peptid-modifierade ACs för effektiva och ändå enkel bestämning av intracellulär ackumulation och tumör inriktning under tidiga utvecklingsfaserna. Vi använder kommersiellt tillgängliga mAbs 7 g 3 och A14 som exempel modellsystem. Procedur 1 beskriver användningen av SDS-PAGE som en metod som möjliggör för ' go/no go' beslut för konstruerade ACs. 2 beskrivs en metod med trypsinization möjliggör förbättrad visualisering av AC intracellulär distribution och ackumulering. 3 beskrivs en metod för förbättrad intracellulära fraktionering att noggrant bestämma cellkärnelokalisering. I den här proceduren använder vi den payload 64Cu (t1/2 = 12,7 h) eftersom den är sårbara för cellulära efflux och är en positron emitter 10. Således, procedur 4 beskriver i vivo tumör inriktning karakterisering av PET imaging för att visualisera tumören upptag i förhållande till bakgrunden (dvs ickemålorganismer friska vävnader) och avgöra huruvida exemplet AC kan specifikt och effektivt målet tumörer. Dessa metoder är tillräckliga för utredarna utveckla ACs modifierad med virus-derived peptider för att identifiera kandidater för vidare avancemang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22122</td>
			<td>There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td>There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375EDU</td>
			<td>Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 or 500 mL volumes to choose from.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>1-10 &#956;g/mL recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOTA-NHS</td>
			<td>CheMatech</td>
			<td>C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin A/C antibody (N-18)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-376362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A14 mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TF-1a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIDE medical imaging software</td>
			<td>available at amide.sourceforge.net</td>
			<td></td>
			<td>Completely free download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView FV1000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>www.olympus-lifescience.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITLC strips</td>
			<td>Biodex</td>
			<td>150-771</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial evaluation of antibody-conjugates modified with viral-derived peptides for increasing cellular accumulation and improving tumor targeting

Antikropp-konjugat (ACs) modifierad med virus-derived peptider är en potentiellt kraftfulla klass av tumör cell leverans agenter för molekylär nyttolaster används vid cancerbehandling och imaging på grund av ökad cellulär ackumuleras över nuvarande ACs. Under tidiga AC in vitro- är utveckling, fluorescens tekniker och radioimmunoassays tillräckliga för att fastställa intracellulära lokalisering, ackumulering effektivitet och målet cellen specificitet. För närvarande finns det ingen konsensus om standardiserade metoder för att förbereda celler för att utvärdera AC intracellulär ackumulation och lokalisering. Den ursprungliga testning av ACs modifierad med virus-derived peptider är avgörande speciellt om flera kandidater har byggts. Att bestämma intracellulär ansamling av fluorescens kan påverkas av bakgrund signal från ACs på cellytan och komplicera tolkningen av ackumulering. För radioimmunoassays, vanligtvis behandlade cellerna är fractionated och radioaktiviteten i olika cell fack mätt. Dock cellys varierar från cell till cell och ofta kärnvapen och cytoplasmiska fack är inte tillräckligt isolerade. Detta kan ge missvisande uppgifter om nyttolast leverans egenskaper. Intravenös injektion av radiomärkt virus-derived peptid-modifierade ACs i tumör med möss följt av radionuklid imaging är en kraftfull metod för att bestämma tumör inriktning och nyttolast leverans egenskaper på den in-vivo -fasen av utveckling. Men detta är en relativt ny avancemang och några grupper har utvärderat virus-derived peptid-modifierade ACs på detta sätt. Vi beskriver behandlingen av behandlade cellerna att mer exakt bedöma virus-derived peptid-modifierade AC ackumulering när du använder konfokalmikroskopi och radioimmunoassays. Specifikt, bunden en metod för trypsinizing celler bort cellytan ACs. Vi ger också en metod för att förbättra cellulär fraktionering. Slutligen ger detta protokoll en in-vivo -Metod med hjälp av positronemissionstomografi (PET) för att utvärdera inledande tumör inriktning boenden i tumör-bärande möss. Vi använder den radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) som ett exempel nyttolast i detta protokoll.

För procedur 1 modifierad byggandet av 7 g 3 med ChAcNLS använda sulfo-SMCC som en crosslinker är mycket pålitlig. Vanligtvis när lastas en 12% gel och analyseras av SDS-PAGE, detta resulterar i en urskiljbar stegvis ökning MW proportionell mot ökande sulfo-SMCC-till - 7 g 3 nyckeltal används och möjliggör de tunga och lätta kedjorna bedömas individuellt för ChAcNLS konjugering (figur 3). 7G 3 reagerade på 10-, 20-, 25- och 50-till-1 sulfo-SMCC-till - 7 g 3 ...

Watch this Scientific Journal Video about Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting at JoVE.com

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Viral-derived peptider kopplade till antikropp-konjugat (ACs) är en metod att få fart på grund av potentialen för att leverera molekylär nyttolaster med ökad tumör cell ackumulering. Detta protokoll utnyttja gemensamma metoder för att utvärdera peptid konjugation, AC och nyttolast intracellulär ackumulation och tumör inriktning, och hjälper forskare under de viktiga första utvecklingsfaserna.

Första utvärdering av antikropp-konjugat modifierad med Viral-derived peptider för att öka cellulära ackumulering och förbättra tumör inriktning

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

The overall goal of these procedures is to evaluate the specificity and effectiveness of antibody conjugates for accumulating inside target cells and tumors during the initial development stages so that they can ultimately be used in the clinic. This method can help answer key question on the answer the conjugate fields, such as the efficiency of nuclear localization and the overall intercellular accumulation. An advantage of this technique is that via PET imaging researchers can assess the effectiveness and selectivity of candidate antibody conjugates.The implications of these techniques extend towards therapy and diagnosis of cancer, because ineffective tumor-cell accumulation is a major limitation with these applications for antibody conjugates. After synthesizing a colic-acid nuclear localization sequence antibody conjugate according to the text protocol, treat target TF1A cells with 200 nanomolar 7G3 colic-acid MLS antibody conjugate. Include cells treated with modified control monoclonal antibodies.Incubate five times 10 to the sixth antigen-positive cells with the conjugates at 37 degrees Celsius for one hour. Then remove the supernatant, and use one milliliter of ice-cold PBS to wash the cells three times. Add fresh medium, and incubate the cells at 37 degrees Celsius for an additional hour.Next, add 0.5 milliliters of PBS, containing 0.25%trypsin and EDTA, and incubate the cells at 37 degrees Celsius for up to 30 minutes. Then use 1.5 milliliters of RPMI1640 medium with 10%FBS to neutralize the trypsin. Centrifuge the cells at 500 times G for five minutes, remove the supernatant, and use 0.5 milliliters of ice-cold PBS to wash the cells three times again.Add 0.5 milliliters of 1%PFA and 1%sucrose and PBS to the cells, and place them on ice for 30 minutes to fix them. Then use 0.5 milliliters of ice-cold PBS to wash the cells three times, and centrifuge the samples at 250 times G for five minutes. Next, add 0.15%Triton X-100 and PBS to the cells, and permeablize them on ice for five minutes.Then, with ice-cold PBS, wash the cells, and repeat the centrifugation. Suspend the cells in 0.1 milliliters of PBS, containing two micrograms per milliliter of an antimirroring FC secondary polyclonal antibody conjugated to Alexa Fluor 647, and incubate the samples in the dark at room temperature for one hour. Centrifuge the cells at 250 times G for five minutes, and use 0.5 milliliters of ice-cold PBS to wash the cells three times.Then suspend the cells in 0.5 milliliters of PBS. Add 10 micrograms per milliliter of propidium iodide to the cells. Then use mounting medium to mount one times 10 to the fifth cells onto glass slides before covering the sample with a glass cover slip.Examine the cells with a Plan APO 60X oil-immersion objective, numerical aperture 1.42, on an inverted laser-scanning confocal microscope. Detect PI fluorescence using the 488-nanometer argon laser and the spectral-scanning prism set for 600 to 650 nanometers. For AF 647 fluorescence, use the 633-nanometer helium-neon laser and the spectral-scanning prism set for 650 to 700 nanometers.Collect images from PI and AF 647 sequentially, 1024 by 1024 pixels, with 2X line averaging, taken at 0.5-micron intervals through the entire cell thickness. Present images as Z projections. To analyze the cells, evaluate and record whether intracellular fluorescence in the cytoplasm is grouped and near the cell surface or diffuse and homogeneous.Also evaluate the relative fluorescence intensity per cell. After preparing and concentrating radiolabeled colic-acid NLS antibody conjugate according to the text protocol, determine the radiolabeling efficiency by applying 0.5 microliters of 0.1-molar PH5.5 sodium citrate, or ITLC eluent, to an ITLC strip. Form an autoradiograph of the strip, and obtain a digital image.Carry out densitometry to obtain the proportion of bound and free Copper-64. If free Copper-64 content is greater than 5%concentrate the sample further. For Copper-64 cellular accumulation studies, treat cells with 100 nanomolar of Copper-64-labeled A14 conjugates at 37 degrees Celsius for one, six, and 24 hours, as previously described.Treat the cells with unmodified A14 to block IL5R alphacytes and at four degrees Celsius to block receptor-mediated internalization. After washing the cells and incubating with fresh medium, as demonstrated earlier in this video, add 0.5 milliliters of PBS containing 0.25%trypsin and EDTA, and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Then, after neutralizing and washing the cells as before, add plasma-membrane lysis buffer to the cells, and incubate them on ice for 10 minutes.Centrifuge the plasma-membrane-lysed cells at 90 times G for five minutes. Remove the supernatant, and transfer it to a fresh tube. This represents the cytoplasmic fraction.Then use ice-cold PBS to wash the nuclei three times, and add the washes to the cytoplasmic fraction. Ensure vials containing the nuclear and cytoplasmic fractions are sealed, then place them in a gamma counter calibrated for Copper-64 in order to convert raw counts to megabecaril. Determine the quality of nuclei isolation by performing Western-Blot analysis for lamin AC, a restricted nuclear protein;and Rab-7, an abundant cytoplasmic protein, on wholesale lysate, nuclear, and cytoplasmic fractions.Treat five times 10 to the six cells with 500 microliters of radio-amino-precipitation assay, or RIPA buffer, and plasma-membrane lysis buffer containing 1%2%and 4%NP-40. Furthermore, treat the isolated nuclei with 500 microliters of RIPA buffer to obtain isolated nuclear proteins. Add four times the sample volume of cold acetone to the isolated nuclear, cytoplasmic, and wholesale proteins, and incubate for 60 minutes at minus 20 degrees Celsius.Centrifuge the samples at 13, 000 times G for 10 minutes. Decant the supernatant, being careful not to dislodge the protein pellet. Then add 100 microliters of PBS to dissolve the proteins.After performing Western Blotting as previously described, cut the membrane in half at the 40-kilodalton molecular-weight marker. Use lamin-AC-specific antibodies to probe the blot containing the higher-molecular-weight proteins, and use Rab-7-specific antibodies to probe the lower half of the membrane. In groups containing four nodskit mice, inject into the tail vein 20 to 30 micrograms of radiolabeled A14 colic-acid NLS antibody conjugate, radiolabeled A14 NLS, and radiolabeled A14.On the same day, place a cylindrical phantom containing five megabecaril of Copper-64 into the PET scanner to convert the radioactive counts per second into injected dose per gram of tissue. 48 hours later, after anesthetizing the mice according to the text protocol, rapidly transfer a mouse to a PET scanner table in the headfirst prone position with a nosecone for isoflurane. Start the PET data acquisition using a regular sampling-mode setting and an energy window of 250 to 650 kiloelectron volts.After the scan, remove the mouse from the scanner, and place it back in the cage. As shown in this figure, the arrows show the difference when evaluating antibody conjugate accumulation with and without trypsinization. In cells that are not trypsinized, intracellular accumulation and distribution is difficult to evaluate due to the over expression of the target cell's surface receptors.The arrows show the difference in intracellular accumulation and distribution of two antibody conjugate candidates when cells are properly trypsinized. Radiolabeled A14 colic-acid NLS antibody conjugate shows nanomolar affinity for IL5R alpha. With increasing concentrations of radiolabeled A14 colic-acid NLS antibody conjugate, specific binding of A14 colic-acid NLS antibody conjugate approached saturation at concentrations of 3.5 nanomolar in both HT-1376 and HT-B9 cells.Gamma counting reveals that the increase of radioactivity in the nucleus and in the cytoplasm from radiolabeled A14 colic-acid NLS antibody conjugate is specific and increases over time. HT-1376 and HT-B9 cells were incubated with plasma-membrane lysis buffer containing 1%2%or 4%NP-40. For HT-1376 and HT-B9 cells, the lysis buffer containing one or 2%NP-40 Rap-7 was not detected in the nuclear fraction, and lamin AC was not detected in the cytoplasmic fraction.PET imaging allows for the evaluation of candidate antibody conjugates for their ability to target antigen-positive tumors, red and blue arrows, and their associated biodistribution properties in comparison to the parental non-peptide-modified antibody. One can see the signal accumulation in the tumor to help select on the potential for a developed antibody conjugate. PET imaging also allows for the evaluation of candidate antibody conjugate uptake in healthy tissues such as the liver.After mastering these techniques, researchers in the field of targeted tumor delivery of molecular payloads will be able to explore additional agents where tumor-cell accumulation is hindered due to endosome entrapment.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Ökad cDNA Avkastningen från encelliga Mängder av mRNA i Standard transkriptas Laboratory Omvänd Reaktioner med akustiska Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion och inriktning av Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Tillverkning av en funktionaliserad Magnetic bakteriell Nanocellulosa med järnoxid nanopartiklar

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Cell Märkning och inriktning med superparamagnetiska nanopartiklar av järnoxid

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipid Nanopartiklar (SLNs) för Intracellulär Targeting Tillämpningar

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Leverans av proteiner, peptider eller cellimpermeabel Små molekyler i levande celler genom inkubation med Endosomolytic Reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Tillverkning av en multiplexade konstgjorda cellulära mikromiljö Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

Syntesen av Multi-walled kolnanorör modifierad med Silver nanopartiklar och utvärdering av sina antibakteriella aktiviteter och cytotoxiska egenskaper

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll för mikroRNA överföring till benmärgen-härrör hematopoetiska stamceller att aktivera Cell teknik kombinerat med magnetiska inriktning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...