Name: identification and characterization of metastatic factors by gene transfer into the novel rip-tag; rip-tva murine model
Uploaded: 2017-10-16T12:30:00
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Agradecemos a Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong e Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. é suportado pelo DOD grant W81XWH-16-1-0619 e NIH grant 1R01CA204916.

declaração de ética: experimentos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Instituto de cuidado Animal e Comitê de uso de Weill Cornell medicina.
 1. escolha de vetores retrovirais aviária (base RCASBP ou RCANBP(A)-based) <ul style="list-style: none;"> <li>vetores foi derivado de vírus do sarcoma de Rous 11. Vetores retrovirais aviária podem entregar os cDNAs (&#8804; 2,5 kb), curto grampo RNAs (shRNAs), ...

<ol>
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S., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+hyaluronan-mediated+motility+isoform+B+promotes+liver+metastasis+in+a+mouse+model+of+multistep+tumorigenesis+and+a+tail+vein+assay+for+metastasis.">Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).</li><li>Guernet, A., Grumolato, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+editing+of+the+genome+for+cancer+modeling.">CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling.</a> Methods. , (2017).</li></ol>

Neste estudo, descrevemos um modelo poderoso rato, RIP-Tag; RIP-tva, para conseguir a entrega do gene somática via aviária retrovírus para a identificação e caracterização de fatores metastáticos. Embora RIP-Tag; RIP-tva ratos desenvolvem tumores neuroendócrinos do pâncreas, metastáticos factores identificados neste modelo do rato também podem promover a metástase de outros tipos de câncer.
Nossa abordagem tem a vantagem de introduzir alterações genéticas som...

A maioria dos cânceres resultam de mutações somáticas 1. Modelos de mouse convencional geneticamente modificados (GEMM) forneceu insights significativos sobre a contribuição de alterações genéticas específicas a tumorigênese 2. No entanto, eles têm várias limitações. A grande desvantagem destes modelos é que eles não replicar a natureza esporádica da formação de tumor em seres humanos, em que apenas algumas células dentro de um tecido adquirem alterações genéticas. As mutações em camundongos transgênicos e nocaute também são germline com potencial de afetar o desenvolvimento. Além disso, gerar estes modelos do rato é caro e demorado.
Metástase é uma questão importante no campo do câncer. Metástase de modelagem tem sido difícil em GEMM. Metástase espontânea é rara no mouse. Penetrância é variável e latência é tempo no GEMM de metástase 3. Metástase experimental modelos utilizam injeção direta de células na circulação de ratos, então os primeiros passos em cascata metastática são eliminados.
Para superar algumas das limitações acima em estudar fatores metastáticos em modelos do rato, nós desenvolvemos um modelo do rato de bitransgenic, RIP-Tag; RIP-tva4. A estratégia baseia-se em combinar o uso de um modelo de mouse de progressão de tumor altamente sincronizada, RIP-Tag 5e o receptor para o vírus da leucose aviária subgrupo-A, tva 6,7. Este RIP -Tag; RIP-tvamodelo do rato permite que genes a ser introduzidos somaticamente uma cepa de rato bitransgenic único. Com o antígeno T SV40 suprimindo as funções supressora de tumor de Rb e p53, ratos desenvolvem tumores neuroendócrinos do pâncreas em uma forma similar a tumorigênese humana, com etapas, incluindo hiperplasia, angiogênese, adenoma e carcinoma invasivo. Este modelo RIP-Tag tem sido muito instrutivo para nossa compreensão das características de câncer, não se limitando a tumores neuroendócrinos do pâncreas. Ele também tem sido usado em ensaios pré-clínicos 8.
Apresentamos um protocolo para transferência de genes somáticos através da injeção de retrovírus aviária intracardiacally no RIP-Tag; RIP-tva ratos. Infecção bem sucedida com RCASBP-derivado de retrovírus aviária requer ativamente proliferando nas células-alvo. Portanto, nós escolhemos RIP-Tag; RIP-tva ratos em 7 semanas de idade, quando hiperplasia desenvolve-se em cerca de 50% das ilhotas pancreáticas. Esquerda ventricular Injeção intracardíaca de vírus de alta concentração é necessário para alcançar uma eficiência de infecção de 10-20% 4. Este método de entrega reduz a diluição significativa de partículas virais em circulação antes que vírus atinjam ilhotas pancreáticas.
Usando esta abordagem, temos demonstrado anteriormente que a Bcl-xL promove metástases independente de sua função de anti-apoptotic 4,9. Esta função de anti-independente de apoptotic metastática não foi observada quando Bcl-xL foi expresso por meio de um transgene em todas as células β do pâncreas durante a ontogenia tumorigênico no RIP-Tag; RIP-Bcl-xL mouse modelo 10. Portanto, nosso modelo do mouse oferece uma oportunidade única para identificar e caracterizar as funções dos genes quando expresso numa fase posterior da tumorigênese. Porque 2-4% das ilhotas evoluir para tumores no RIP-Tag; RIP-tva bitransgenic ratos sem infecção viral e nem todas as lesões pré-malignas estão infectados com os retrovírus aviária derivado de RCASBP, podem ser identificados apenas os fatores que conferem uma vantagem selectiva sobre o curso natural da tumorigênese. Em particular, metastáticos fatores serão mais facilmente reconhecidos por este método, porque a metástase para linfonodos pancreáticos ou outros órgãos não ocorre normalmente em RIP-Tag; RIP-tva ratos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">RCASBP-Y DV plasmid</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">11478</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RCAS-RNAi plasmid</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">15182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine, 100x</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin solution, 100x</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">PBS-/-, 1X</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfect</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyallomer centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:339px;">0.45 mm Nalgene 
			Syringe Filters with PES Membrane</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Insulin Syringes&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">synaptophysin</td>
			<td style="width:123px;">Vector Laboratories</td>
			<td>VP-S284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N8080153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of metastatic factors by gene transfer into the novel rip-tag; rip-tva murine model

Cancro metastático é responsável por 90% das mortes em pacientes com tumores sólidos. Há uma necessidade urgente para compreender melhor os drivers de metástase do cancro e para identificar novos alvos terapêuticos. Para investigar os eventos moleculares que conduzem a progressão do câncer primário a metástase, desenvolvemos um modelo do rato de bitransgenic, RIP-Tag; RIP-tva. Neste modelo de rato, o promotor de insulina de rato (RIP) conduz a expressão do antígeno T SV40 (Tag) e o receptor para o subgrupo um vírus da leucose aviária (tva) nas células β do pâncreas. Os ratos desenvolvem tumores neuroendócrinos do pâncreas com penetrância de 100% através de etapas bem definidas que são semelhantes a tumorigênese humana, com etapas, incluindo hiperplasia, angiogênese, adenoma e carcinoma invasivo. Porque RIP-Tag; RIP-tva ratos não desenvolvem a doença metastática, alterações genéticas que promovem a metástase podem ser identificadas facilmente. Gene somática transferir para expressar a tva, proliferando β do pâncreas lesões pré-malignas é conseguida através de Injeção intracardíaca de retrovírus aviária, abrigando a alteração genética desejada. Um título de &#62; 1 x 108 infecciosas unidades / ml é considerado apropriado para a infecção na vivo . Além disso, o retrovírus aviária podem infectar linhas de células derivadas de tumores em RIP-Tag; RIP-tva mouses com alta eficiência. As linhas de célula também podem ser usadas para caracterizar os fatores metastáticos. Aqui vamos demonstrar como utilizar este modelo de rato e linhas para avaliar as funções dos genes candidatos em metástase de tumor de células.

A taxa de infecção in vivo e in vitro de RIP-Tag; RIP-tva células tumorais por vírus baseados em RCASBP ~ 20% e ~ 80% respectivamente são 20. Na RIP-marca de ; RIP-tva modelo do rato, aproximadamente 4% de 400 ilhotas pancreáticas em cada rato desenvolverá naturalmente em tumores 20; Portanto, há uma quantidade suficiente de células tumorais em cada rato para análise histológica e fenotípica do...

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Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Apresentamos um protocolo para demonstrar um sistema de transferência de gene somática romance utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo do rato para estudar a função dos genes em metástase. Os retrovírus aviária são entregues intracardiacally para garantir a transferência de genes em lesões pré-malignas, não-invasivas de células β do pâncreas em ratos adultos.

Identificação e caracterização dos fatores metastáticos por transferência de genes para a novela RIP-Tag; RIP-tva modelo murino

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

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