Name: a method to assess bacteriocin effects on the gut microbiota of mice
Uploaded: 2017-07-25T15:00:00
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Os autores desejam agradecer a Mobilidade Coordenada da Ciência e da Sustentabilidade da NASA NELS Science (Coordenação 017-ABEL-CM-2013). CB e GP-M. Foram apoiados pela concessão AGL2015-70487-P do Ministério espanhol da Economia e Competitividade. OCOU e DBD foram apoiados por um programa de bolsas estratégicas para pesquisas em ciência da alimentação da Universidade de Ciências da Vida (NMBU) (projeto 1205051025). Também gostaríamos de agradecer a Inmaculada Noguera por sua assistência com cuidados com animais e amostragem e Jesus Dehesa por sua ajuda para garantir a disponibilidade de materiais de laboratório nas instalações de animais. Também apreciamos o professor Lars-Gustav Snipen pelo seu conselho sobre estatísticas.

O cuidado e o manuseio devem ser realizados em uma unidade especializada de cuidados com animais. Os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo correspondente Comitê de Ética da Universidade de Valência e autoridades locais, seguindo os princípios de cuidados de animais de laboratório obrigatórios pelo Direito da União Européia e 2010/63 / UE e pelo Governo espanhol RD 53/2013 sobre proteção de animais Usado para fins científicos, a fim de respeitar o princípio 3R na experimentação animal (Replaceme...

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+with+specific+bacteria+enhances+survival+of+Lactobacillus+plantarum+NC8,+an+autoinducer-regulated+bacteriocin+producer,+in+olive+fermentations.">Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations.</a> Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).</li><li>Drider, D., Fimland, G., H&#233;chard, Y., McMullen, L. M., Pr&#233;vost, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Story+of+Class+IIa+Bacteriocins.">The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins.</a> Microb. 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O procedimento descrito aqui foi usado para determinar se as mudanças na microbiota são vinculadas à saúde ou à idade. Diferentes partes do protocolo são importantes, mas entre elas, amostragem das fezes, a escolha do fragmento de DNA a ser sequenciado e analisado, e a realização da extração de DNA e análises bioinformáticas certamente podem ser os pontos mais críticos. A amostragem é crucial porque, por razões éticas, os camundongos não devem ser estressados ​​e porque é conhecido por mudar a prop...

As bactérias são péptidos antimicrobianos produzidos por uma ampla gama de espécies bacterianas 1 , 2 . Esses compostos e seus produtores, especialmente LAB, foram explorados e explorados em todo o mundo há décadas por suas aplicações potenciais na preservação e medicina 3 . Várias bacteriocinas são conhecidas por matar agentes patogênicos importantes, incluindo espécies de Listeria, Enterococcus, Staphylococcus e Bacillus . Algumas bacteriocinas até têm a capacidade de modular a resposta imune 4 . Muitas bacteriocinas têm espectros relativamente estreitos, uma propriedade que é muito apreciada em algumas aplicações. Por exemplo, algumas bacteriocinas de espectro estreito podem ser usadas para dirigir a atividade específica contra grupos selecionados de bactérias problemáticas, sem muita perturbação na flora comensal ou benéfica compartilhando o mesmo nicho; Isto é especialmente essencial no ambiente intestinalOnde muitos micróbios benéficos prosperam de forma interativa e dinâmica 5 . As bactérias são também muito atraentes para o uso profilático ou probiótico, pois podem suprimir o crescimento (out) de patógenos, pathobiontes ou bactérias oportunistas que podem desbalancear a homeostase intestinal 6 , 7 . Em termos de sua natureza e propriedades fisicoquímicas, as bacteriocinas são muito diversas, pois possuem estruturas diferentes, especificidades alvo, modos de ação, etc. A maioria das bacteriocinas foram estudadas com grande detalhe em configurações in vitro , mas muito poucos foram testados em alimentos Matrizes 8 , 9 ou in vivo, tal como num intestino de animal 6 , 10 . As propriedades in vitro podem diferir em grande medida quando avaliadas in vivo devido à complexidade oF o ambiente intestinal e também aos efeitos putativos não intencionais sobre bactérias benéficas. A maioria dos probióticos são LAB. Eles produzem uma série de outros metabólitos, incluindo ácidos graxos de cadeia curta, que são conhecidos por influenciar a fisiologia do hospedeiro, bem como para demonstrar propriedades antimicrobianas em relação a certas bactérias. Portanto, no caso de cepas probióticas que produzem bacteriocinas, é melhor estabelecer ensaios realistas, como animais saudáveis ​​com microbiota normal. No presente estudo, fornecemos uma estratégia que permite a avaliação do efeito de diferentes cepas produtoras de bacteriocina, cujas bacteriocinas possuem diferentes espectros inibitórios, em camundongos saudáveis. Nossa estratégia inclui a alimentação de camundongos com mutantes isogênicos não bacteriocinais, o que permite a diferenciação dos efeitos mediados pela bacteriocina dos efeitos não-bacteriocinados. Sequencing 16S rDNA permite seguir as mudanças dinâmicas da população bacteriana no intestino. SubsA análise estatística equitativa decide as correlações entre espécies bacterianas e também entre espécies bacterianas e parâmetros fisiológicos medidos ( por exemplo, peso corporal, parâmetros bioquímicos séricos, etc. ). Acreditamos que o protocolo apresentado neste estudo também é aplicável a outras aplicações probióticas ou prebióticas além do estudo de bacteriocinas em animais vivos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Balb/c mice (female)</td>
			<td style="width:141px;">Harlan</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:287px;">Mice should be 6 - 8 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic Petri dish</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brain-Heart-Infusion broth</td>
			<td style="width:141px;">Conda</td>
			<td style="width:183px;">1400.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">European Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:141px;">Pronadisa</td>
			<td style="width:183px;">1800.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose D1 Low EEO</td>
			<td style="width:141px;">Pronadisa</td>
			<td style="width:183px;">8010.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1XTAE buffer</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">15558042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MRS broth</td>
			<td style="width:141px;">Difco</td>
			<td style="width:183px;">288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scale</td>
			<td style="width:141px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:183px;">PB602-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile forceps</td>
			<td style="width:141px;">Levantina de Laboratorios S.L.</td>
			<td style="width:183px;">260-3710014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:183px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Hermle</td>
			<td style="width:183px;">Z383K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:141px;">AppliChem Panreac</td>
			<td style="width:183px;">121659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Realpure SSS Kit</td>
			<td style="width:141px;">Real Life Science Solutions, Durviz, Spain</td>
			<td style="width:183px;">RBME04 (300 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:141px;">AppliChem Panreac</td>
			<td style="width:183px;">131090.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:141px;">AppliChem Panreac</td>
			<td style="width:183px;">131086.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit fluorometer</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:183px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPure XP beads</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter Genomics, USA</td>
			<td style="width:183px;">A63881 (60 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PerfeCta NGS library quantification kit</td>
			<td style="width:141px;">Quanta BioSciences, Maryland, USA</td>
			<td style="width:183px;">733-2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MiSeq v3 reagent kit</td>
			<td style="width:141px;">Illumina, San Diego, California, USA</td>
			<td style="width:183px;">MS-102-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Primers for 16S rRNA gene amplification</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:287px;">Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5&#8217;-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3&#8217; and 5&#39;-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nextera XT Index kit</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:183px;">FC-131-1002</td>
			<td>Indices and Illumina sequencing adaptors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref.</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">Z317314-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass beads, 0.1 mm diameter</td>
			<td style="width:141px;">Biospec Products</td>
			<td style="width:183px;">11079-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:141px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:183px;">740609.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:141px;">Omni International Inc.</td>
			<td style="width:183px;">19-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mutanolysin</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">M9901-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">lysozyme</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:183px;">10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">proteinase K</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:183px;">3115887001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase A</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to assess bacteriocin effects on the gut microbiota of mice

Perguntas muito intrigantes surgem com nosso conhecimento avançado sobre a composição da microbiota intestinal e a relação com a saúde, particularmente em relação aos fatores que contribuem para manter o equilíbrio populacional. No entanto, existem metodologias disponíveis limitadas para avaliar esses fatores. As bactérias são peptídeos antimicrobianos produzidos por muitas bactérias que podem conferir uma vantagem competitiva para aquisição de alimentos e / ou estabelecimento de nicho. Muitas bactérias de ácido láctico probiótico (LAB) têm um grande potencial para promover a saúde humana e animal, evitando o crescimento de agentes patogênicos. Eles também podem ser usados ​​para imuno-modulação, pois produzem bacteriocinas. No entanto, a atividade antagonista das bacteriocinas é normalmente determinada por bioensaios laboratoriais em condições bem definidas, mas simplificadas em excesso, em comparação com o ambiente intestinal complexo em seres humanos e animais, onde bactérias enfrentam influências multifatoriais do hospedeiro e centenas de espécies microbianas sHaring o mesmo nicho. Este trabalho descreve um procedimento completo e eficiente para avaliar o efeito De uma variedade de bacteriocinas com diferentes especificidades alvo em um sistema murino. As alterações na composição de microbiota durante o tratamento com bacteriocina são monitoradas usando seqüência de rADN 16S composicional. Nossa abordagem usa os produtores de bacteriocina e os seus mutantes isogênicos que não produzem bacteriocinas, sendo este o último capaz de distinguir as modificações relacionadas à bacteriocina de modificações não relacionadas à bacteriocina nas microbiota. A extração de DNA fecal e os métodos de seqüência de rADN 16S são consistentes e, juntamente com a bioinformática, constituem um procedimento poderoso para encontrar mudanças fracas nos perfis bacterianos e estabelecer correlações, em termos de concentração de colesterol e triglicerídeos, entre populações bacterianas e marcadores de saúde. Nosso protocolo é genérico e, portanto, pode ser usado para estudar outros compostos ou nutrientes com o potencial de alterar o microfone hospedeiroComposição de robiota, seja ao estudar toxicidade ou efeitos benéficos.

A produção de bacteriocinas foi considerada uma característica probiótica positiva no LAB, já que se supunha que ele evita o crescimento de bactérias oportunistas e patógenos. O objetivo deste trabalho foi mostrar a capacidade das bacteriocinas para modular as populações de microbiota intestinal em um modelo de mouse. Para este propósito, foi desenvolvido um procedimento para comparar o efeito da ingestão de cepas produtoras de bacteriocina e suas cepas isogênicas não produt...

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A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Um método para avaliar os efeitos da bacteriocina na microbiota intestinal de ratos

Acredita-se que as bacteriocinas desempenham um papel fundamental na definição da diversidade microbiana em diferentes nichos ecológicos. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente para avaliar como as bacteriocinas afetam a composição da microbiota intestinal em um modelo animal.

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Extração de DNA a partir do Micróbios Gut da térmita (Zootermopsis Angusticollis) e Visualizing micróbios do intestino

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Biologia

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Medição e Análise de Produção de Ácido Extracelular determinar Glicosidases Classificação

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Avaliação dos efeitos metabólicos do jejum intermitente isocalórico 2:1 em camundongos

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

Divergência de Microbiota Raiz em Diferentes Habitats baseados em Redes de Correlação Ponderada

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Preparando e criando insetos axeônicos com mudas cultivadas de tecido para estudos de interação microbiota hospedeiro-intestinal do besouro-folha

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Optimization of Transesophageal Atrial Pacing to Assess Atrial Fibrillation Susceptibility in Mice

Otimização da estimulação atrial transesofágica para avaliar a suscetibilidade à fibrilação atrial em camundongos

Mouse models of genetic and acquired risk factors for atrial fibrillation (AF) have proven valuable in investigating the molecular determinants of AF. ...