Name: assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00
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Diese Studie wurde unterstützt durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF, Grant No. 320030_156193). Die Autoren danken Dr. Benoît Werlen für die Bereitstellung der Biosilon Microcarrier Perlen. Wir danken auch Prof. Hans Peter Kohler und Prof. André Haeberli für Hilfe beim Einrichten der Microcarrier Wulst Modell.

deutsche Landrasse Schweine (Wildtyp gezüchtet in einem lokalen Bauernhof und transgenen gezüchtet am Institut für molekulare Tierzucht und Biotechnologie, Ludwig-Maximilians-Universität München), mit einem Gewicht von 30 kg bis 40 kg, dienten Diese Studie. Alle Tiere wurden unter Standardbedingungen mit Wasser und Nahrung ad libitum untergebracht. Alle Tierversuche wurden nach Großbritannien Animals Act (wissenschaftliche Verfahren) und der NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren sow...

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	<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li><li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children.">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li><li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation.">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li><li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro.">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li><li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation:+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood.">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li><li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation.">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li><li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx:+composition,+functions,+and+visualization.">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li><li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces.">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li><li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium:+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions.">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li><li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles.">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li><li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs.">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li></ol>

Das hier vorgestellte Modell eignet sich für Koagulation Studien erlaubt die Analyse der verschiedenen Aspekte der Koagulation und seine Wechselwirkung mit EG. 8 in der Xenotransplantation Forschung ist es ein nützliches System die gerinnungshemmenden Eigenschaften der verschiedenen gentechnisch veränderte Schweine ECs nach Inkubation mit Menschenblut 9zu testen.
Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind die komplette Netzabdeckung (Konflue...

Das vaskuläre Endothel besteht aus einer Monoschicht von Endothelzellen (EG), die das Lumen der Blutgefäße auskleiden. In einen physiologischen Zustand Ruhestrom EG sind verantwortlich für die Wartung von ein gerinnungshemmendes Mittel und entzündungshemmende Umgebung. 1 dies wird durch den Ausdruck der Antigerinnungsmittel und entzündungshemmende Proteine auf der Oberfläche der EG vermittelt. Z. B. EG Aktivierung verursacht durch Ischämie/Reperfusion Verletzungen oder vaskulären Ablehnung (Xeno-) transplantierten Organe bewirkt eine Änderung der endothelial Oberfläche aus einem Antigerinnungsmittel und Anti-inflammatory State pro- Koagulans und Pro-inflammatorische Zustand. 1
Um die faszinierende und komplexe Wechselwirkungen zwischen Endothel und Koagulation Faktoren, in-vitro- Modelle zu untersuchen, die als imitieren möglichst genau die in-Vivo -Situation sind höchst wünschenswert. Eine allgemeine Einschränkung, die konventionellen in-vitro- Koagulation Assays charakterisiert ist die Verwendung von Anticoagulated Blut, wodurch die Analyse der Koagulation-vermittelten Effekte beschwerliche und sogar Recalcification citrated Vollblut nicht reproduzieren Ergebnisse mit frischen nicht-Anticoagulated Blut erhältlich. 2 Außerdem ist im traditionellen Flachbett-Zellkultursysteme es unmöglich, die gerinnungshemmenden Eigenschaften des Endothels zu nutzen, da eine ausreichende Endothelzellen Oberfläche pro Blutvolumen nicht erreicht werden kann. Das hier vorgestellte Modell überwindet diese Einschränkungen durch Kultivierung EG auf der Oberfläche der kugelförmigen Microcarrier Perlen, so dass ein EG-Oberfläche-zu-Blut-Verhältnis von &#62; 16 cm2/mL kann erreicht werden, das ist vergleichbar mit der Situation in kleinen Arteriolen oder Venen, und die beschrieben wurde, ausreichen, um "natürliche" Gerinnungshemmung des Blutes ermöglichen durch die EG-Oberfläche. 3 , 4 Vollblut kann ohne zusätzlichen Antikoagulantien in dieser Einstellung verwendet werden. Blutproben können gesammelt werden, während das Experiment und Zytokine, Gerinnungsfaktoren und lösliche Ergänzung Aktivierungsmarker erkannt und quantifiziert werden können. Darüber hinaus können EC-beschichtete Microcarrier Perlen für Ergänzung und Immunglobulin Deposition sowie der Ausdruck von EG Aktivierungsmarker konfokalen Mikroskopie analysiert werden. Eine weitere interessante Anwendung umfasst die Prüfung von Medikamenten die um endothelialer Zellaktivierung und damit die Gerinnung zu verhindern sollen. 5 obwohl dieses Modell komplett Tierversuche ersetzen kann, bietet es eine Methode, um bestimmte funktionale Hypothesen ex Vivo mit Zellen zu testen und so reduzieren Sie die Anzahl der Versuchstiere in der Grundlagenforschung auf Ischämie/reperfusion Verletzungen oder (Xeno) Transplantation.
Das beschriebene Modell wurde verwendet, um eine Xenotransplantation in welche Aorten porcinen Endothelzellen (PAEC) sind auf die Microcarrier Perlen gezüchtet und inkubiert mit ganzen, nicht-Antikoagulanzien Menschenblut zu imitieren. Verschiedenen transgenen PAEC, mit mehreren menschlichen Genen wie CD46 für die Regulierung des Komplementsystems bzw. Thrombomodulin (hTBM) für die Regulierung des Systems der Koagulation, wurden wegen ihrer gerinnungshemmenden Eigenschaften analysiert. Endothelzellen Aktivierung, Ergänzung und Koagulation Systeme sind streng kontrolliert und miteinander verbunden. 6 es ist daher wichtig zu verstehen, wie die verschiedenen transgenen Zellen nach Exposition mit menschlichem Blut in Bezug auf Adhäsion Molekül Ausdruck und Cytokine Freigabe, Verhalten der Glycocalyx und Verlust von gerinnungshemmenden Proteine zu vergießen. 7

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PAEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from pig aorta in our Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcarrier beads (Biosilon)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Bovine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10644-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1726.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T406-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer flasks</td>
			<td>Tecnomara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological stirrer</td>
			<td>Brouwer</td>
			<td>MCS-104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti CD31</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB33871</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-166-003</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6458</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti vWF</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dk anti Gt IgG &#8211; Alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit - FITC</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-25MG-F</td>
			<td>Dilution 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Concentration: 10% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td>Size: 0.8x19 mm (21&#610; 3/4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>14.1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Available for free at: https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td>2mL in 500mL of DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinun natricum</td>
			<td>Drossa Pharm AG</td>
			<td></td>
			<td>Stock concentration: 5000 U.I./ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamberslides</td>
			<td>Bioswisstec AG</td>
			<td>30108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x6 H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.5833.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>C0563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood

In Vivo, sind Endothelzellen ausschlaggebend für die natürliche Antikoagulation des zirkulierenden Blutes. Endothelialer Zellaktivierung führt zu Blutgerinnung. Dieses Phänomen ist in vielen klinischen Situationen, wie Organtransplantation im Beisein von vorgeformten Anti-Spender-Antikörper, einschließlich Xenotransplantation, sowie Ischämie/Reperfusion Verletzungen beobachtet. Um Tierversuche gemäß der 3R Normen (Minderung, Ersatz und Verfeinerung), in-vitro- Modelle um die Wirkung von Endothelzellen untersuchen reduzieren wäre Aktivierung auf Blutgerinnung sehr wünschenswert. Allerdings bieten gemeinsame Flachbett Systeme der Endothelzellen Kultur ein Oberflächen-Volumen-Verhältnis von 1-5 cm2 des Endothels pro mL Blut, die für natürliche, endothelial vermittelte Antikoagulation nicht ausreicht. Kultivierung von Endothelzellen auf Microcarrier Perlen kann das Oberflächen-Volumen-Verhältnis zu 40-160 cm2/mL erhöhen. Dieses erhöhte Verhältnis ist ausreichend, um die "natürliche" Antikoagulation von Vollblut, so dass die Verwendung von Antikoagulantien vermieden werden kann. Hier ist ein in-vitro- Microcarrier-basiertes System zur Untersuchung der Auswirkungen der gentechnischen Veränderung von porcinen Endothelzellen auf Koagulation des ganzen, nicht-Antikoagulanzien Menschenblut beschrieben. In der beschriebenen Assay, primäre porcinen Aorten Endothelzellen, entweder Wildtyp (WT) oder transgenen für menschliche CD46 und Thrombomodulin, wurden auf Microcarrier Perlen gezüchtet und dann frisch gezogenen nicht-Antikoagulanzien Menschenblut ausgesetzt. Dieses Modell ermöglicht die Messung und Quantifizierung der Cytokine Freigabe sowie Aktivierung Marker der Ergänzung und Koagulation im Blutplasma. Darüber hinaus wurden Bildgebung des aktivierten Endothelzellen und Ablagerung von Immunglobulinen, Ergänzung und Koagulation Proteine an den endothelialized Perlen konfokalen Mikroskopie durchgeführt. Dieser Test kann auch verwendet werden, um Medikamente zu testen, die um Aktivierung von Endothelzellen und somit, Gerinnung zu vermeiden sollen. Auf ihr Potenzial, die Zahl der Versuchstiere für solche Untersuchungen ist der beschriebenen Test einfach durchzuführen und konsequent reproduzierbar.

Nach 7-10 Tagen Kultur in die Spinner-Kolben (Abb. 1) wurden die Zellen konfluierende, decken die ganze Oberfläche der Microcarrier Perlen (Abbildung 2). Überprüfung des confluency Staates ist ein wichtiger Schritt, denn eine nicht-Zusammenfluss Monoschicht der EG auf die Microbeads führt zu einem deutlichen Rückgang der Gerinnungszeit, angesichts der Microcarrier Perlen Oberfläche ist stark Pro-Gerinnungsmittel (Gerinnungs...

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Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Wir präsentieren ein in Vitro -Modell ermöglicht die Untersuchung und Analyse der Koagulation im ganzen, nicht-Anticoagulated Blut. Antikoagulation im System hängt die natürliche antikoagulierende Wirkung des gesunden Endothelzellen und endothelialer Zellaktivierung führt zu gerinnen.

Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Genaue und einfache Messung der pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β mit einem Vollblut Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Forschung

Medizin

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Schnelle Point-of-Care-Test von Enoxaparin Gerinnungshemmer Wirksamkeit im Vollblut

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Die α-Test: Rapid Zellfreie CD4-Zählung mit ganzen Speichel

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

Non-invasive Beurteilung der mikrovaskulären und Endothelfunktion

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

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Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

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Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

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Ultraschall Beurteilung der Endothelfunktion: A Technische Richtlinie der Fluss-vermittelten Dilatation-Test

Cardiovascular disease is the primary cause of mortality and a major cause of disability worldwide. The dysfunction of the vascular endothelium is a ...