Name: assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00
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Questo studio è stato sostenuto dal fondo nazionale svizzero (FNS, Grant No. 320030_156193). Gli autori ringraziano il Dr. Benoît Werlen per fornire le perline di microcarrier di Biosilon. Ringraziamo anche la Prof. ssa Hans Peter Kohler e Prof. ssa André Haeberli per aiuto con la creazione del modello del branello di microcarrier.

maiali Landrace tedesco (tipo selvaggio allevato in una fattoria locale e transgenico allevati presso l'Istituto di allevamento di animali molecolare e biotecnologie, Università Ludwig-Maximilian, Monaco di Baviera, Germania), da 30 kg a 40 kg, sono stati utilizzati Questo studio. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni standard con acqua e cibo ad libitum. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l'atto di animali (procedure scientifiche) di Regno Unito e la Gui...

<ol>
	<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li><li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children.">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li><li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation.">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li><li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro.">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li><li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation:+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood.">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li><li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation.">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li><li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx:+composition,+functions,+and+visualization.">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li><li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces.">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li><li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium:+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions.">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li><li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles.">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li><li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs.">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li></ol>

Il modello qui presentato è adatto per coagulazione correlate a studi che consente l'analisi dei diversi aspetti della coagulazione e della sua interazione con la CE. 8 nella ricerca di xenotrapianto, è un sistema utile per testare le proprietà dell'anticoagulante di ECs porcina geneticamente differenti dopo incubazione con sangue umano 9.
Le fasi più critiche del protocollo sono quelli garantendo la cellula completa copertura (confluency) de...

L'endotelio vascolare è costituito da un monostrato di cellule endoteliali (EC) che costeggiano il lume dei vasi sanguigni. In uno stato fisiologico, quiescente CE sono responsabili per il mantenimento di un ambiente di anti-infiammatori e anticoagulante. 1 questo è mediato dall'espressione di anticoagulante e anti-infiammatori proteine sulla superficie del CE. Ad esempio, l'attivazione di CE causato da ischemia/riperfusione lesioni o rigetto vascolare di (xeno-) trapiantati risultati di organi in un cambiamento della superficie endoteliale da un anticoagulante e anti-infiammatorio stato pro-coagulante e pro-infiammatorie stato. 1
Per studiare l'affascinante e complessa interazione tra i fattori di coagulazione e dell'endotelio, modelli in vitro che imitare come fedelmente possibile la situazione in vivo sono altamente desiderabili. Una limitazione comune che caratterizza le analisi convenzionali in vitro della coagulazione è l'uso di sangue anticoagulato che rende ardua l'analisi degli effetti di coagulazione-mediata e non può riprodurre anche ricalcificazione del sangue intero citrato risultati ottenibili con fresco non-anticoagulato. 2 inoltre, in sistemi di coltura tradizionale piatto-letto cellulare è impossibile sfruttare le proprietà dell'anticoagulante dell'endotelio come una sufficiente superficie endoteliale delle cellule per volume di sangue non può essere raggiunto. Il modello presentato qui supera queste limitazioni coltivando CE sulla superficie delle perle sferiche microcarrier, affinché un rapporto di superficie-sangue CE di &#62; 16 cm2/ml può essere raggiunto, che è simile alla situazione in piccole arteriole o vene, e che è stata descritta per essere sufficienti per consentire l'anticoagulazione "naturale" del sangue dalla superficie del CE. 3 , 4 il sangue intero può essere utilizzato senza anticoagulanti aggiunto in questa impostazione. I campioni di sangue possono essere raccolti durante l'esperimento e citochine, fattori di coagulazione e markers di attivazione del complemento solubili possono essere rilevati e quantificati. Inoltre, perline rivestite con CE microcarrier possono essere analizzati per deposizione di complemento e dell'immunoglobulina, nonché l'espressione di markers di attivazione CE mediante microscopia confocale. Un'altra interessante applicazione comprende la sperimentazione di farmaci che sono supposti per impedire la coagulazione e, quindi, l'attivazione delle cellule endoteliali. 5 anche se questo modello non può completamente sostituire la sperimentazione animale, offre un metodo per testare ipotesi specifiche funzionali ex vivo usando le cellule e ridurre così il numero di animali utilizzati nella ricerca di base su ischemia/riperfusione trapianto di lesioni o (xeno).
Il modello descritto è stato utilizzato per simulare un xenotrapianto impostazione in quali cellule endoteliali aortiche porcine (CEPA) sono coltivate sulle perle microcarrier e incubate con sangue umano totale, non anticoagulato. Diversi PAEC transgenici, portando diversi geni umani quali CD46 per la regolazione del sistema del complemento e/o thrombomodulin (hTBM) per la regolazione del sistema di coagulazione, sono stati analizzati per le loro proprietà dell'anticoagulante. Sistemi di attivazione, complemento e coagulazione delle cellule endoteliali sono strettamente controllati e collegati tra loro. 6 di conseguenza è importante capire come le diverse cellule transgeniche si comportano dopo l'esposizione al sangue umano per quanto riguarda l'espressione della molecola di adesione e rilascio di citochine, spargimento del glicocalice e la perdita delle proteine dell'anticoagulante. 7

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PAEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from pig aorta in our Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcarrier beads (Biosilon)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Bovine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10644-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1726.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T406-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer flasks</td>
			<td>Tecnomara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological stirrer</td>
			<td>Brouwer</td>
			<td>MCS-104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti CD31</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB33871</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-166-003</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6458</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti vWF</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dk anti Gt IgG &#8211; Alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit - FITC</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-25MG-F</td>
			<td>Dilution 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Concentration: 10% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td>Size: 0.8x19 mm (21&#610; 3/4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>14.1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Available for free at: https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td>2mL in 500mL of DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinun natricum</td>
			<td>Drossa Pharm AG</td>
			<td></td>
			<td>Stock concentration: 5000 U.I./ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamberslides</td>
			<td>Bioswisstec AG</td>
			<td>30108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x6 H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.5833.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>C0563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood

In vivo, le cellule endoteliali sono cruciali per l'anticoagulazione naturale del sangue circolante. Di conseguenza, l'attivazione delle cellule endoteliali conduce alla coagulazione del sangue. Questo fenomeno si osserva in molte situazioni cliniche, come il trapianto di organi in presenza di anticorpi anti-donatori pre-formati, tra cui lo xenotrapianto, come pure in ischemia e riperfusione. Al fine di ridurre la sperimentazione animale secondo i 3R standard (riduzione, sostituzione e raffinatezza), in vitro modelli per studiare l'effetto della cellula endoteliale attivazione sulla coagulazione del sangue sarebbe altamente auspicabile. Tuttavia, comune a base piatta sistemi della coltura delle cellule endoteliali forniscono un rapporto superficie-volume 1-5cm2 dell'endotelio per mL di sangue, che non è sufficiente per l'anticoagulazione naturale, endoteliale mediata. Coltura delle cellule endoteliali su microcarrier perline può aumentare il rapporto superficie-volume a cm 40-1602/ml. Questo aumento del rapporto è sufficiente a garantire l'anticoagulazione "naturale" di sangue intero, in modo che può essere evitato l'uso di anticoagulanti. Qui un in vitro basati su microcarrier sistema è descritto per studiare gli effetti di modificazione genetica di cellule endoteliali porcine sulla coagulazione del sangue umano totale, non anticoagulato. Nell'analisi della descritta, cellule endoteliali aortiche porcine primarie, o wild type (WT) o transgenici per umano CD46 e trombomodulina, erano coltivate su microcarrier perline e poi esposti a sangue umano appena prelevato non-anticoagulato. Questo modello permette per la misurazione e quantificazione del rilascio di citochine così come attivazione indicatori di complemento e della coagulazione nel plasma sanguigno. Inoltre, imaging di cellule endoteliali attivate e deposito delle immunoglobuline, proteine di coagulazione e complemento - sui branelli endotelizzati sono state eseguite mediante microscopia confocale. Questo test è utilizzabile anche per testare farmaci che sono supposti per impedire la coagulazione e, quindi, l'attivazione delle cellule endoteliali. Sulla cima del suo potenziale per ridurre il numero degli animali utilizzati per tali indagini, il dosaggio descritto è facile da eseguire e riproducibile in modo coerente.

Dopo 7-10 giorni di cultura nella beuta di spinner (Figura 1) le cellule erano confluenti, che copre tutta la superficie delle perle microcarrier (Figura 2). Verifica dello stato confluenza è un passo importante perché un monostrato non-confluenti della CE sulle microsfere porterà ad una profonda diminuzione nel tempo di coagulazione, dato il microcarrier superficie dei branelli è fortemente pro-coagulante (tempo di coagulazi...

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Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Vi presentiamo un modello in vitro che permette lo studio e l'analisi di coagulazione in intero, anticoagulato. L'anticoagulazione nel sistema dipende l'effetto anticoagulante naturale delle cellule endoteliali sane e attivazione endoteliale delle cellule si tradurrà nella coagulazione.

Valutazione delle proprietà anticoagulanti e anti-infiammatori delle cellule endoteliali mediante coltura cellulare 3D e Non intero anticoagulato

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

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Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

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