Name: assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00
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이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (SNSF, 보조금 번호 320030_156193)에 의해 지원 되었다. 저자 박사 Benoît Werlen Biosilon microcarrier 비즈 제공 감사 합니다. 우리는 또한 감사 교수 한스 피터 Kohler와 교수 안 드레 Haeberli microcarrier 구슬 모델을 설정 하는 방법에 대 한.

독일 Landrace 돼지는 (야생 타입 지역 농가에서 사육 하 고 유전자 변형 동물 사육 분자 연구소와 생명 공학, 루드비히 막시밀리안 대학, 뮌헨, 독일에서 자란), 무게 40 k g, 30 킬로그램 사이 사용 되었다 이 연구는. 모든 동물이 물과 음식을 임의로 광고와 표준 조건 하에서 보관 되어 있었다. 모든 동물 실험은 스위스 동물 보호 법률 뿐만 아니라 치료와 실험 동물의 사용에 대 한 영국 동물 (?...

<ol>
	<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li><li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children.">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li><li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation.">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li><li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro.">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li><li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation:+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood.">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li><li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation.">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li><li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx:+composition,+functions,+and+visualization.">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li><li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces.">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li><li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium:+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions.">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li><li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles.">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li><li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs.">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li></ol>

여기에 제시 된 모델은 응고에 대 한 적합 한 응고 및 적와의 상호 작용의 다양 한 측면의 분석을 허용 하는 연구 관련 8 xenotransplantation 연구에서는 인간의 피 9부 화 후 다른 유전자 변형된 돼지 ECs의 항 응 혈 약 속성을 테스트 하는 유용한 시스템입니다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 실험을 시작 하기 전에 microbeads의 전체 셀 범위 (conflu...

단층 선 루멘 혈관의 내 피 세포 (EC)의 혈관 내 피에 의하여 이루어져 있다. 생리 적인 상태에서 무부하 EC는 응고 제와 항 염증 제 환경의 유지 보수에 대 한 책임이 있습니다. 1 이 응고 제와 항 염증 단백질 EC 표면에 표현에 의해 중재 됩니다. 예를 들어 EC 활성화 국 소 빈 혈 또는 reperfusion로 인 한 부상 또는 혈관 거부 (이종-) 이식의 내 피는 응고 제와 항 염증 상태에서 프로 응집과 프로-염증 성 변화에 장기 결과 상태입니다. 1
매혹적이 고 복잡 한 상호작용으로 모방 하는 체 외에서 모델 endothelium 및 응고 요인 연구 가능한 vivo에서 상황 매우 바람직한 있습니다. 기존의 시험관에 응고 분석 실험을 짓는 일반적인 제한 anticoagulated 혈액 응고 중재 효과의 분석 힘든 게의 사용 이며 심지어 recalcification citrated 전체 혈액의 복제 수 없습니다. 신선한 비 anticoagulated 혈액으로 얻을 수 있는 결과. 2 사실, 전통적인 침대 형 세포 배양 시스템에서 그것은 혈액 볼륨 당 충분 한 내 피 세포 표면에 도달 하실 수 없습니다 endothelium의 항 응 혈 약 속성을 이용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 모델 구형 microcarrier 구슬의 표면에 EC를 경작 하 여 이러한 한계를 극복 있도록 EC 표면 혈액 비율의 &#62; 작은 arterioles 또는 정 맥, 상황에 비슷한 16 cm2/mL 도달 될 수 있다 고 EC 표면에 의해 혈액의 "자연" anticoagulation 수 있도록 충분 한 것 설명 했다. 3 , 4 전체 혈액이이 설정에서 추가 응고 없이 사용할 수 있습니다. 혈액 샘플을 실험 하 고 cytokines, 응고 요인 동안 수집 될 수 있습니다 고 수용 성 보수 활성화 마커를 감지 및 측정할 수 있습니다. 또한, EC 코팅 microcarrier 구슬 EC 활성화 마커의 식으로 보완 및 면역 증 착 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 수 있습니다. 또 다른 흥미로운 응용 프로그램 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물의 테스트 포함 되어 있습니다. 5 이 모델을 완전히 동물 실험 대체 수 없습니다, 비록 특정 기능 가설 비보 전 셀을 사용 하 여 테스트 하 고 따라서 국 소 빈 혈 또는 reperfusion에 기초 연구에 사용 된 동물의 수를 줄일 수 있는 방법을 제공합니다 부상 또는 (xeno) 이식.
설명된 모델 모방 xenotransplantation 돼지 대동맥 내 피 셀 (PAEC) microcarrier 구슬에 성장 하 고 전체, 비 anticoagulated 인간의 피와 알을 품는 사용 되었다. 보완 시스템 thrombomodulin 응고 시스템의 규정 (hTBM)의 규칙을 위한 CD46 등 여러 가지 인간 유전자를 운반 하는 다른 유전자 변형 PAEC 그들의 항 응 혈 약 속성에 대 한 분석 했다. 내 피 세포 활성화, 보수, 및 응고 시스템 긴밀 하 게 제어 하 고 상호 연결. 따라서 다른 유전자 변형 세포 접착 분자 식 및 cytokine 릴리스, 인간의 혈액에 노출 된 후 동작 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 6 은 항 응 혈 약 단백질의 손실과 glycocalyx 흘리기. 7

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PAEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from pig aorta in our Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcarrier beads (Biosilon)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Bovine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10644-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1726.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T406-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer flasks</td>
			<td>Tecnomara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological stirrer</td>
			<td>Brouwer</td>
			<td>MCS-104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti CD31</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB33871</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-166-003</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6458</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti vWF</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dk anti Gt IgG &#8211; Alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit - FITC</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-25MG-F</td>
			<td>Dilution 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Concentration: 10% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td>Size: 0.8x19 mm (21&#610; 3/4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>14.1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Available for free at: https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td>2mL in 500mL of DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinun natricum</td>
			<td>Drossa Pharm AG</td>
			<td></td>
			<td>Stock concentration: 5000 U.I./ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamberslides</td>
			<td>Bioswisstec AG</td>
			<td>30108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x6 H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.5833.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>C0563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood

Vivo에서, 내 피 세포는 혈액 순환의 자연 anticoagulation에 대 한 중요 한. 따라서, 내 피 세포 활성화 혈액 응고에 지도 한다. 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해에서 뿐만 아니라 장기 이식 xenotransplantation를 포함 하 여 미리 형성 된 안티 기증자 항 체의 존재 처럼 많은 임상 상황에서이 현상이 관찰 됩니다. 3R 표준 (감소, 교체 및 수정), 생체 외에서 모델 내 피 세포의 효과 연구에 따르면 동물 실험을 감소 시키기 위하여 활성화 혈액 응고에 매우 바람직한 것 이다. 그러나, 내 피 세포 배양의 일반적인 평판 시스템은 자연, 내 피-중재 anticoagulation에 대 한 충분 한 혈액의 mL 당 피 내 막의 1-5 c m2 의 표면-볼륨 비율을 제공 합니다. Microcarrier 구슬에 내 피 세포를 배양 하는 것은 표면 볼륨 비율 40-160 cm2/mL을 증가할 수 있습니다. 이 증가 비율은 전체 혈액의 "자연" anticoagulation 되도록 충분 한 응고의 사용을 피할 수 있도록 합니다. 여기는 생체 외에서 microcarrier 기반 시스템 전체를 비 anticoagulated 인간의 혈액의 응고에 돼지 내 피 세포의 유전자 조작의 효과 공부 설명 되어 있습니다. 기술된 분석 결과, 기본 돼지 대동맥 내 피 세포, 중 야생 종류 (WT)에서 또는 유전자 변형 인간 CD46 thrombomodulin, 했다 microcarrier 구슬에 성장 그리고 다음 갓 그려진된 비 anticoagulated 인간의 혈액에 노출. 이 모델은 측정 및 활성화로 사이토카인 방출의 정량화에 대 한 보완 및 혈액 플라스마에 응고의 마커 수 있습니다. 또한, 활성화 된 내 피 세포와 면역 글로불린의 증 착의 이미징, 보완 및 응고 단백질 endothelialized 구슬에 confocal 현미경 검사 법에 의해 수행 되었습니다. 이 분석 결과 또한 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물 테스트를 사용할 수 있습니다. 그런 수사에 사용 되는 동물의 수를 줄이기 위해 그것의 잠재력, 위에 설명 된 분석 결과 수행 하기 쉽고 일관 되 게 재현할 수입니다.

스피너 플라스 크 (그림 1)에서 문화 7-10 일 후 셀 confluent microcarrier 구슬 (그림 2)의 전체 표면을 커버 했다. Confluency 상태 확인은 중요 한 단계는 microbeads에 EC의 비 합칠 단층 응고 시간 표시 감소로 이어질 것입니다 때문에, microcarrier는 주어진 구슬의 표면 강하게 직업 응고 (응고 시간: 4 ± 1 분) ( 그림 3).</p...

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Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

전체 혈액 자극 분석을 사용하여 프로 염증성 시토킨 IL - 1β의 정확하고 간단한 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

연구

의학

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

α-테스트 : 전체 타액을 사용하여 빠른 셀 프리 CD4의 열거

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

Microvascular 및 내피 기능의 비 침습적 평가

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

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종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3D 흑색 종 회전 타원체의 세포주기

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Ultrasound Assessment of Endothelial Function: A Technical Guideline of the Flow-mediated Dilation Test

내피 기능의 초음파 평가 : 흐름 중재 팽창 시험의 기술 가이드 라인

Cardiovascular disease is the primary cause of mortality and a major cause of disability worldwide. The dysfunction of the vascular endothelium is a ...