Name: assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood at JoVE.com

Это исследование было поддержано Швейцарский Национальный научный фонд (SNSF, Грант № 320030_156193). Авторы благодарят доктор Бенуа Werlen за предоставление бусы microcarrier Biosilon. Мы также благодарим профессор Ганс Петер Колер и профессор Андре Haeberli за помощь в настройке модели бисера microcarrier.

свиней породы Ландрас немецкий (дикого типа разводят в местном фермерском доме и трансгенных разводят в институте молекулярной животноводство и биотехнологии, Университет Людвига-Максимилиана, Мюнхен, Германия), весом от 30 кг до 40 кг, были использованы в Это исследование. Все животные ...

<ol>
	<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li><li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children.">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li><li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation.">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li><li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro.">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li><li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation:+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood.">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li><li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation.">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li><li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx:+composition,+functions,+and+visualization.">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li><li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces.">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li><li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium:+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions.">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li><li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles.">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li><li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs.">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li></ol>

Модель, представленная здесь подходит для коагуляции соответствующих исследований, позволяя анализ различных аспектов коагуляции и его взаимодействие с ЕС. 8 в ксенотрансплантации исследований, это удобная система для тестирования антикоагулянт свойства различных гене?...

Эндотелия состоит из монослоя эндотелиальных клеток (ЕС), которые линия просвета кровеносных сосудов. В состоянии физиологического покоя EC отвечает за поддержание антикоагулянт и противовоспалительными среды. 1 это опосредовано выражением антикоагулянт и противовоспалительными белков на поверхности ЕС. Например, ЕС активации, вызванные ишемии/реперфузии травмы или сосудистая неприятие (xeno-) пересадки органов результаты изменения эндотелиальных поверхности от антикоагулянт и противовоспалительными состояние про коагулянта и про воспалительных состояние. 1
Для изучения увлекательный и сложные взаимодействия между эндотелия и коагуляции факторы, в пробирке модели, которые имитируют как максимально близко в естественных условиях ситуация весьма желательно. Общие ограничения, которое характеризует обычные в vitro коагуляции анализов является использование антикоагулянтом крови, что делает анализ коагуляции опосредованной эффекты напряженных и даже recalcification citrated цельной крови невозможно воспроизвести результаты получить свежие номера антикоагулянтом кровью. 2 Кроме того, в системах культуры традиционных безбортовой ячейки невозможно эксплуатировать антикоагулянт свойства эндотелия, как не может быть достигнуто достаточно эндотелиальных клеток поверхности на единицу объема крови. Модель, представленная здесь преодолевает эти ограничения, культивирование ЕС на поверхности сферического microcarrier бусы, так что отношение поверхности к крови EC &#62; 16 см2/мл может быть достигнуто, которая похожа на ситуацию в небольших артериол или Вены, и который был описан быть достаточным, чтобы позволить «естественных» антикоагуляционную крови поверхности ЕС. 3 , 4 цельной крови может использоваться без добавлена антикоагулянтов в этот параметр. Образцы крови могут быть собраны в ходе эксперимента и цитокины, факторы свертывания крови и растворимых дополнение активации маркеры могут быть обнаружены и количественно. Кроме того EC-покрытием microcarrier бусы могут быть проанализированы для дополнения и иммуноглобулина осаждения, а также выражение маркеров активации EC confocal микроскопии. Другое интересное приложение включает в себя тестирование препаратов, которые должны предотвратить активацию эндотелиальных клеток и, таким образом, коагуляции. 5 хотя эта модель не может полностью заменить экспериментов на животных, он предоставляет метод для проверки конкретных функциональных гипотезы ex vivo с использованием клеток и таким образом уменьшить количество животных, используемых в фундаментальных исследований по ишемии/реперфузии травмы или (xeno) трансплантации.
Описывается модель использовалась для имитации ксенотрансплантации, в котором свинину аорты эндотелиальных клеток (паек) вырос на microcarrier бусы и инкубировали с весь, не антикоагулянтом человеческой крови. Различные трансгенных паек, перевозящих несколько генов человека как CD46 для регулирования системы комплемента и/или Тромбомодулин (hTBM) для регулирования системы коагуляции, были проанализированы на предмет их антикоагулянт свойств. Эндотелиальные клетки активации, дополнением и коагуляции системы плотно контролируются и взаимосвязаны. 6 поэтому важно понять, как различные трансгенных клетки ведут себя после воздействия на кровь человека выражение молекулы адгезии и релиз цитокинов, пролития Гликокаликс и потери антикоагулянт белков. 7

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PAEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from pig aorta in our Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcarrier beads (Biosilon)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Bovine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10644-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1726.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T406-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer flasks</td>
			<td>Tecnomara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological stirrer</td>
			<td>Brouwer</td>
			<td>MCS-104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti CD31</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB33871</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-166-003</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6458</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti vWF</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dk anti Gt IgG &#8211; Alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit - FITC</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-25MG-F</td>
			<td>Dilution 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Concentration: 10% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td>Size: 0.8x19 mm (21&#610; 3/4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>14.1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Available for free at: https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td>2mL in 500mL of DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinun natricum</td>
			<td>Drossa Pharm AG</td>
			<td></td>
			<td>Stock concentration: 5000 U.I./ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamberslides</td>
			<td>Bioswisstec AG</td>
			<td>30108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x6 H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.5833.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>C0563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood

В естественных условиях, эндотелиальные клетки имеют решающее значение для естественной антикоагуляционную циркулирующей крови. Следовательно активацию эндотелиальных клеток приводит к коагуляции крови. Это явление наблюдается во многих клинических ситуациях, как трансплантация присутствии предварительно сформированных антитела анти доноров, включая ксенотрансплантации, а также в ишемии/реперфузии травмы. Для того, чтобы уменьшить экспериментов на животных согласно 3R стандартов (сокращение, замена и уточнение), в пробирке модели для изучения влияния эндотелиальных клеток весьма желательно активации на свертываемость крови. Однако общие бортовой системы эндотелиальных клеток культуры обеспечивают отношение поверхности к объему 1-5 см2 эндотелия на мл крови, который не является достаточным для естественных, эндотелия опосредованной антикоагуляционную. Культивирование эндотелиальных клеток на microcarrier бисер может увеличить отношение поверхности кобъему/2мл 40-160 см. Это увеличение соотношения достаточно для обеспечения «естественных» антикоагуляционную цельной крови, так что можно избежать использование антикоагулянтов. Здесь описан в пробирке microcarrier систему на основе для изучения последствий генетической модификации свинину эндотелиальных клеток на свертываемость крови человека целиком, не антикоагулянтом. В описанных assay, первичный свинину аорты эндотелиальных клеток, либо дикого типа (WT) или трансгенных человеческих CD46 и Тромбомодулин, были выросли на microcarrier бусы и затем подвергается свежезаваренным нарисованные не антикоагулянтом человеческой крови. Эта модель позволяет измерение и количественное определение цитокинов выпуска, а также активации маркеры дополняют и коагуляции в плазме крови. Кроме того визуализация активированного эндотелиальных клеток и отложения иммуноглобулинов, дополнением и коагуляции белков на эндотелизированных бусины были исполнены confocal микроскопии. Этот assay может также использоваться для проверки наркотиков, которые должны предотвратить активацию эндотелиальных клеток и, таким образом, коагуляции. На вершине ее потенциал, чтобы уменьшить количество животных, используемых для таких расследований описанных assay легко выполнять и последовательно воспроизводимость.

После 7-10 дней культуры в колбу счетчика (рис. 1) клетки были вырожденная, охватывающих всю поверхность microcarrier бусины (рис. 2). Проверка confluency государства представляет собой важный шаг, потому что без притока монослоя ЕС на микрошарики прив...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood at JoVE.com

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Мы представляем в vitro модель, которая позволяет изучение и анализ свертывающей системы в целом, не антикоагулянтом крови. Антикоагуляционную в системе зависит от природных Антисвертывающая эффект здоровых эндотелиальных клеток и активации эндотелиальных клеток приведет к свертывания.

Оценка антикоагулянт и противовоспалительных свойств эндотелиальных клеток с использованием 3D клеточной культуры и не антикоагулянтом цельной крови

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Точные и простые измерения провоспалительных цитокинов IL-1β использованием Всего Пробирная стимуляция крови

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Быстрое Точка-санитарной помощи анализа эффективности эноксапарина антикоагулянтов в цельной крови

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Α-тест: Быстрая бесклеточной CD4 Перечисление Использование Всего слюны

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

Неинвазивная оценка микрососудистой и функцию эндотелия

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Оценка стволовых клеток Недвижимость в человека рака яичников клеток с использованием много- и отдельных клеток на основе сферах Анализы

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Выделение человека эндотелиальных клеток лимфатической от нескольких параметров флуоресценции активирован сортировки клеток

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Выделение и культура Расширение опухоли конкретных эндотелиальных клеток

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- и проточной цитометрии на основе анализа клеточной позиции и клеточного цикла в 3D меланомы сфероидов

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Ultrasound Assessment of Endothelial Function: A Technical Guideline of the Flow-mediated Dilation Test

Ультразвуковая оценка эндотелиальной функции: Техническое Руководство потока-опосредованной дилатации Test

Cardiovascular disease is the primary cause of mortality and a major cause of disability worldwide. The dysfunction of the vascular endothelium is a ...